البروتين البروتين التفاعلات تصور من قبل ثنائي الجزيء الإسفار التكملة في Protoplasts التبغ وأوراق

الهدف العام من التجربة التالية هو مراقبة تفاعل بروتينين يتم التعبير عنهما في أوراق التبغ السليمة. يتم تحقيق ذلك من خلال تصميم التركيبات المناسبة ، ودمج الجينات ذات الأهمية لتقسيم بروتينات الفلورسنت وتحويل هذه التركيبات إلى بكتيريا زراعية. كخطوة ثانية ، يتم خلط مزارع البكتيريا الزراعية وحقنها في أوراق التبغ ، مما يؤدي إلى التعبير عن البروتينات وإشارة الفلورسنت المعاد تكوينها.

إذا كانت البروتينات على مقربة ، بعد ذلك ، يتم تحليل الأوراق الكاملة أو البروتوبلاستات المعزولة تحت المجهر. تم الحصول على النتائج التي تظهر تفاعلات البروتين البروتيني بناء على إشارة الفلورسنت المنبعثة التي تم اكتشافها بواسطة المجهر الفلوري. الميزة الرئيسية لهذه التقنية للطرق الحالية مثل الترسيب المناعي أو الخميرة إلى الهجين هي أنه يمكن مراقبة تفاعل البروتين البروتيني مباشرة في الخلية النباتية الحية.

يمكن أن تساعد هذه الطريقة في الإجابة على الأسئلة الرئيسية في مجال بيولوجيا النبات ، مثل تكوين مجمعات البروتين في المقصورات الخلوية المختلفة. لبدء هذا الإجراء ، قم بزراعة البكتيريا الزراعية لاستخدامها في تحويل أوراق التبغ. تلقيح 10 ملليلتر من وسط LB الذي يحتوي على المضادات الحيوية المناسبة مع 50 ميكرولتر من AG L واحد مزرعة مخزون الجلسرين التي تحتوي على البلازميد محل الاهتمام في أنبوب معقم سعة 50 مل.

احتضان عند 28 درجة مئوية لمدة 24 ساعة على الأقل ، مع الاهتزاز عند 190 دورة في الدقيقة حتى تصل الثقافة إلى OD 600 بين 1.0 و 2.0 في اليوم التالي. الطرد المركزي البكتيريا عند 3000 مرة G لمدة 15 دقيقة. بعد التخلص من التجسيد الطافي ، قم بتعليق الحبيبات في وسط التسلل المصنوع حديثا واضبط التعليق على OD 600 من 1.0.

احتضان خلايا البكتيريا الزراعية في شاكر علوي لمدة ساعتين في الظلام في درجة حرارة الغرفة لتسلل أوراق التبغ. اختر عدة أوراق قديمة من نبات التبغ عمره ثلاثة أسابيع. تخلط أحجام متساوية.

ثلاثة ملليلتر كل من البكتيريا الزراعية تحمل التركيبات ذات الأهمية. املأ حقنة سعة خمسة ملليلتر بدون إبرة بخليط تعليق الخلية لتسلل معلق الخلية إلى أوراق التبغ. اضغط بحذر على المحقنة الموجودة على الجانب السفلي من الأوراق في عدة أماكن ، وسقي النباتات واتركها مغطاة ومحمية من الضوء لمدة يومين.

لعزل البروتوبلاست من الورقة المتسربة ، ضع الورقة أولا في طبق بتري وأضف بعض محلول الإنزيم الطازج. باستخدام شفرة حلاقة جديدة ، قم بتقطيع الورقة إلى قطع بحجم 0.5 سم مربع تقريبا. بعد ذلك ، انقل قطع الأوراق بمحلول الإنزيم إلى فراغ.

قارورة التسلل. تسلل بالمكنسة الكهربائية لمدة 20 ثانية تقريبا حتى تخرج فقاعات الهواء من الأوراق. حرر المكنسة الكهربائية بعناية فائقة.

رج القارورة لمدة 90 دقيقة عند 40 دورة في الدقيقة في الظلام في درجة حرارة الغرفة بعد 90 دقيقة. حرر البروتوبلاستيات عن طريق الاهتزاز لمدة دقيقة واحدة عند 90 دورة في الدقيقة. قم بتصفية المحلول من خلال الشاش في أنبوب طرد مركزي دائري القاع سعة 15 مل.

قم بتراكب محلول البروتوبلاست بملليلترين من المخزن المؤقت FPCN والطرد المركزي لمدة 10 دقائق عند 70 ضعف G مع تسارع وتباطؤ بطيء في درجة حرارة الغرفة. سوف تتراكم البروتوبلاستات السليمة عند الواجهة بين محلول الإنزيم و FPCN باستخدام فتحة عريضة برأس ماصة واحد مليلتر لنقل البروتوبلاستات السليمة إلى أنبوب طرد مركزي جديد. لنجاح هذا الإجراء ، استخدم دائما أطراف الفتحة البيضاء لمنع تمزق البروتوبلاست السليم.

املأ الأنبوب بجهاز طرد مركزي W Five عازلة لمدة دقيقتين عند 100 ضعف G مع تسارع وتباطؤ بطيئين. لتكميل البروتوبلاست ، قم بإزالة المادة الطافية بعناية وأعد تعليق الحبيبات. في تقريبا 200 ميكرولتر من W خمسة عازلة ، اعتمادا على كمية البروتوبلاست.

لتحضير عينة من البروتوبلاست للفحص المجهري للمسح الضوئي بالليزر ، بالسرعة الأولى ، شريطان صغيران من مادة مانعة للتسرب على بعد حوالي سنتيمترين على شريحة مجهرية. ضع 20 ميكرولترا من محلول البروتوبلاست بين الشرائط وضع غطاء زجاجي بعناية في الأعلى. ستمنع شرائط مانع التسرب سحق البروتوبلاست بواسطة زجاج الغطاء.

لتحضير عينة كاملة من الورقة للفحص المجهري بالمسح بالليزر ، قم بقص قطعة بطول سنتيمتر واحد من الورقة وضعها على شريحة مجهرية بحيث يكون الجانب السفلي من الورقة متجها لأعلى. أضف ما يقرب من 30 ميكرولتر من الماء. ضع غطاء زجاجي في الأعلى وثبته بإحكام بشريط لاصق على كلا الجانبين.

يتم إجراء التصوير باستخدام مجهر المسح الضوئي بالليزر متحد البؤر من نوع MICCA TCS SP five للتكبير. استخدم عدسة موضوعية بحجم 63 × مع الجلسرين كوسيط تصوير ، واستخدم برنامج الفلورسنت المتقدم لمجموعة تطبيقات Leica للتقييم. اضبط ليزر Argonne على 30٪ وقوة الليزر على 488 نانومتر إلى شدة 18٪ لمراقبتها إشارة عند 515 نانومتر ، قم بتعيين أول عرض نطاق ترددي لانبعاثات كاشف PMT من 495 إلى 550 نانومتر.

لمراقبة التألق الذاتي للكلوروفيل. قم بتعيين عرض نطاق ترددي ثان لانبعاثات كاشف PMT من 650 إلى 705 نانومتر. لمراقبة إشارة M cherry ، استخدم ليزر HENI 5 61.

اضبط شدة الليزر على 18٪ وعرض النطاق الترددي الثالث لانبعاثات كاشف PMT من 587 إلى 610 نانومتر. تأكد من التقاط الصور من جميع قنوات كاشف PMT بنفس إعدادات الكسب. يجب أن يتراوح الكسب بين 800 و 900 لاستبعاد إشارات الخلفية.

احصل على صور بهذا التنسيق والعرض والارتفاع 1024 × 1024 بكسل بسرعة مسح 100 هرتز. بالنسبة لتكديس Z ، استخدم مسافة قصوى تبلغ 0.5 ميكرون بين كل كومة. في هذه الدراسة ، تم استخدام طريقة BFC لمراقبة تفاعل المرافق الجزيئي العصاري الخلوي HSP 90 مع بروتينات الإرساء الغشائية TPR seven و 64.

كما هو موضح في هذا التخطيطي ، يقترن كوكب الزهرة بالجزء العصاري الخلوي من TPR سبعة ، والذي يقع في الشبكة الإندوبلازمية أو 64 ، الذي يقع في الغلاف الخارجي للبلاستيدات الخضراء. Hs.P 90 هو N مدمج نهائيا مع SCFP مما يتيح التفاعل بين مجالات TPR للحديث 64 و TPR السابع مع HSP 90 C ، Terminus ، يتم التعبير عن SCFP وحده في العصارة الخلوية كعنصر تحكم سلبي للتحقق من توطين مركب بروتين TPR سبعة HS P 90. تم تحويل TPR seven و HS P 90 بشكل مشترك مع علامة ER.

تمت مراقبة التألق في الأوراق السليمة كعنصر تحكم. تم التعبير عن SCFP وحده جنبا إلى جنب مع TPR سبعة وعلامة ER. في جميع الصور المعروضة ، يمثل شريط المقياس 10 ميكرون.

تظهر الألواح الموجودة على اليسار مضان معاد تشكيله باللون الأخضر مراقب عند 515 نانومتر. تظهر علامة ER باللون الأحمر. في اللوحات الوسطى ، يظهر تراكب كلتا الإشارتين في اللوحات اليمنى.

تم رصد إشارة معاد تشكيلها ل TPR سبعة مع HS P 90 متداخلة مع علامة ER التي تظهر باللون الأصفر. في المقابل ، لم تتم مراقبة أي إشارة ل TPR سبعة والتحكم السلبي مثل CFP. في المثال التالي ، تم التعبير عن بروتين البلاستيدات الخضراء 64 مع HS P 90 كعنصر تحكم.

تم التعبير عن Tox 64 بالاشتراك مع SCFP وحده. كما كان من قبل ، تمت مراقبة التألق المعاد تشكيله باللون الأخضر عند 515 نانومتر. تظهر الألواح الوسطى التألق الذاتي للكلوروفيل الذي تم مراقبته عند 480 نانومتر.

في اللون الأحمر يظهر تراكب لكلتا الإشارتين في اللوحات اليمنى. لوحظ التألق المعاد تكوينه في الخلايا التي تعبر عن السموم 64 و HSP 90 ، ولكن ليس في الخلايا. Coex يعبر عن السموم 64 و SCFP وحده.

نظرا لأنه يصعب تحديد التوطين الدقيق للسموم 64 و HSP 90 في الصور المجهرية للأوراق بأكملها. تم عزل البروتوبلاستات من أوراق التبغ المتسللة للفحص المجهري الفلوري. كما كان من قبل ، تمت مراقبة التألق المعاد تشكيله عند 515 نانومتر تمت مراقبة التألق الذاتي للكلوروفيل عند 480 نانومتر وتم إنشاء صور تراكب كما هو موضح في صورة التراكب هذه إلى 64 ويمكن اكتشاف HSP 90 كهياكل على شكل حلقة تحيط بالبلاستيدات الخضراء.

بعد مشاهدة هذا الفيديو ، يجب أن يكون لديك فهم جيد لكيفية تصميم التركيبات الخاصة بك ، وتحويل أوراق التبغ ، وأفضل طريقة لتصور إشارة الفلورسنت التي توضح تفاعل البروتينين اللذين يثير اهتمامك.