البروتين البروتين التفاعلات تصور من قبل ثنائي الجزيء الإسفار التكملة في Protoplasts التبغ وأوراق

الهدف العام من التجربة التالية هو مراقبة التفاعل بين بروتينين يتم التعبير عنهما في أوراق تبغ سليمة. ويتم تحقيق ذلك من خلال تصميم تركيبات جينية مناسبة، ودمج الجينين المستهدفين مع بروتينات فلورية منقسمة، ثم نقل هذه التركيبات إلى بكتيريا الأجروبكتيريوم (agro bacteria). وكخطوة ثانية، يتم خلط مزارع بكتيريا الأجروبكتيريوم وحقنها في أوراق التبغ، مما يؤدي إلى التعبير عن البروتينات وظهور إشارة فلورية مُعاد تشكيلها.

إذا تقاربت البروتينات من بعضها البعض، يتم بعد ذلك تحليل الأوراق كاملة أو البروتوبلاست المعزولة تحت المجهر. وتُحصل النتائج التي تُظهر التفاعلات بين البروتينات بناءً على الإشارة الفلورية المنبعثة التي يتم رصدها بواسطة المجهر الفلوري. وتتمثل الميزة الرئيسية لهذه التقنية مقارنة بالطرق الحالية مثل الترسيب المناعي المشترك أو نظام الخميرة الثنائي الهجين في إمكانية مراقبة التفاعل بين البروتينات مباشرة داخل خلية النبات الحية.

يمكن أن تساعد هذه الطريقة في الإجابة على أسئلة رئيسية في مجال بيولوجيا النبات، مثل تكوين المعقدات البروتينية في المقصورات الخلوية المختلفة. لبدء هذا الإجراء، قم بتنمية بكتيريا agro التي ستُستخدم في تحويل أوراق التبغ. في أنبوب معقم سعة 50 milliliter، قم بتلقيح 10 milliliters من وسط LB الذي يحتوي على المضادات الحيوية المناسبة باستخدام 50 microliters من مستنبت مخزون glycerol لـ AG L one الذي يحتوي على البلازميد المطلوب.

يتم التحضين عند 28 degrees Celsius لمدة 24 ساعة على الأقل، مع الرج بسرعة 190 RPM حتى تصل المزرعة إلى OD 600 تتراوح بين 1.0 و 2.0 في اليوم التالي. تُطرد البكتيريا مركزياً عند 3000 times G لمدة 15 دقيقة. وبعد التخلص من الطافي، تُعلق الراسبة في وسط ارتشاح مُحضّر حديثاً ويتم ضبط المعلق ليصل إلى OD 600 بقيمة 1.0.

قم بحضن خلايا agro bacteria في هزاز علوي لمدة ساعتين في الظلام وفي درجة حرارة الغرفة من أجل ترشيح أوراق التبغ. اختر عدة أوراق مسنة من نبات تبغ يبلغ من العمر ثلاثة أسابيع. اخلط أحجاماً متساوية.

ثلاثة ملليلترات من كل سلالة من بكتيريا agro bacteria التي تحمل البناءات الجينية المطلوبة. املأ سرنجة سعة خمسة ملليلترات بدون إبرة بخليط معلق الخلايا لتلقيح أوراق التبغ بهذا المعلق. اضغط بالسرنجة بعناية على الجانب السفلي من الأوراق في عدة مواضع، ثم اسقِ النباتات واتركها مغطاة ومحمية من الضوء لمدة يومين.

لعزل البروتوبلاست من ورقة مرشحة، ابدأ بوضع الورقة في طبق بتري وأضف بعضًا من محلول الإنزيم المحضر حديثًا. وباستخدام شفرة حلاقة جديدة، قطع الورقة إلى قطع بحجم 0.5 سنتيمتر مربع تقريبًا. بعد ذلك، انقل قطع الأوراق مع محلول الإنزيم إلى جهاز تفريغ الهواء.

دورق الترشيح. يتم الترشيح بالتفريغ لمدة 20 ثانية تقريبًا حتى تظهر فقاعات الهواء من الأوراق. يتم تحرير التفريغ بحذر شديد.

رُجّ الدورق لمدة 90 دقيقة بسرعة 40 RPM في الظلام وفي درجة حرارة الغرفة بعد مرور 90 دقيقة. حرر البروتوبلاستات عن طريق الرج لمدة دقيقة واحدة بسرعة 90 RPM. قم بترشيح المحلول باستخدام قطعة شاش في أنبوب طرد مركزي مستدير القاع سعة 15 ملليلتر.

قم بتغطية محلول البروتوبلاست بملليلترين من منظم FPCN، ثم قم بالطرد المركزي لمدة 10 دقائق عند 70 ×g مع تسارع وتباطؤ بطيئين في درجة حرارة الغرفة. ستتراكم البروتوبلاستات السليمة عند الواجهة الفاصلة بين المحلول الإنزيمي ومنظم FPCN؛ وباستخدام طرف ماصة سعة ملليلتر واحد ذو فتحة واسعة، انقل البروتوبلاستات السليمة إلى أنبوب طرد مركزي جديد. ولضمان نجاح هذا الإجراء، استخدم دائماً الأطراف ذات الفتحات الواسعة (البيضاء) لمنع تمزق البروتوبلاستات السليمة.

املأ الأنبوب بمحلول W five buffer ثم قم بالطرد المركزي لمدة دقيقتين عند 100 ×g مع تسارع وتباطؤ بطيئين. ولترسيب البروتوبلاستات، أزل السائل الطافي بعناية وأعد تعليق الراسب في حوالي 200 µL من محلول W five buffer، وذلك حسب كمية البروتوبلاستات.

لتحضير عينة من البروتوبلاست للفحص باستخدام المجهر المسحي الليزري، ضع أولاً شريطين صغيرين من المادة المانعة للتسرب على شريحة مجهرية بحيث تكون المسافة بينهما حوالي سنتيمترين. ضع 20 µL من محلول البروتوبلاست بين الشريطين، ثم ضع غطاء الشريحة بعناية في الأعلى. ستعمل أشرطة المادة المانعة للتسرب على منع سحق البروتوبلاست بواسطة غطاء الشريحة.

لتحضير عينة ورقة كاملة للفحص باستخدام المجهر المسحي الليزري، اقطع قطعة بطول 1 cm من الورقة وضعها على شريحة مجهرية بحيث يكون الجانب السفلي للورقة متجهًا للأعلى. أضف 30 µL تقريبًا من الماء، ثم ضع غطاء شريحة في الأعلى وثبته بإحكام باستخدام شريط لاصق من كلا الجانبين.

يتم إجراء التصوير باستخدام مجهر مسح ليزري بؤري من نوع MICCA TCS SP five للتكبير. استخدم عدسة شيئية بقوة تكبير 63 x مع استخدام الجلسرين كوسط للتصوير، واستخدم برنامج Leica application suite advanced fluorescent للتقييم. اضبط ليزر Argonne على 30% وقدرة الليزر عند 488 nanometers بكثافة 18%. ولمراقبة إشارته عند 515 nanometers، اضبط نطاق عرض حزمة الانبعاث لكاشف PMT الأول من 495 إلى 550 nanometers.

لمراقبة الفلورة الذاتية للكلوروفيل، اضبط عرض نطاق انبعاث كاشف PMT الثاني من 650 إلى 705 نانومتر. ولمراقبة إشارة M cherry، استخدم ليزر HENI 5 61.

اضبط كثافة الليزر على 18% ونطاق عرض انبعاث كاشف PMT الثالث من 587 إلى 610 نانومتر. تأكد من التقاط الصور من جميع قنوات كاشف PMT بإعدادات ربح (gain) متماثلة. يجب أن يتراوح الربح بين 800 و 900 لاستبعاد إشارات الخلفية.

التقط الصور بهذا التنسيق، بعرض وارتفاع 1024 في 1024 بكسل وبسرعة مسح تبلغ 100 hertz. وبالنسبة للتكديس المحوري Z stackings، استخدم مسافة قصوى تبلغ 0.5 microns بين كل تكديس والآخر. في هذه الدراسة، استُخدمت طريقة BFC لمراقبة التفاعل بين المرافق الجزيئي السيتوزولي HSP 90 وبروتينات الارتباط الغشائية TPR seven و TPR 64.

كما هو موضح في هذا المخطط، يرتبط بروتين Venus بالجزء السيتوزولي إما من TPR seven الذي يتواجد في الشبكة الإندوبلازمية، أو من 64 الذي يتواجد في الغلاف الخارجي للبلاستيدة الخضراء. تم دمج Hs.P 90 عند النهاية النيتروجينية (N terminally fused) مع SCFP لتمكين تفاعل نطاقات TPR لـ talk 64 وTPR seven مع النهاية الكربونية (C-Terminus) لبروتين HSP 90. يتم التعبير عن SCFP وحده في السيتوزول كعينة ضابطة سلبية للتحقق من تموضع معقد بروتين TPR seven HS P 90. تم إجراء تحويل مشترك (co transformed) لـ TPR seven وHS P 90 مع علامة للشبكة الإندوبلازمية (ER marker).

تمت مراقبة الفلورة في أوراق سليمة كعينة ضابطة. تم التعبير عن SCFP بمفرده جنبًا إلى جنب مع TPR seven وعلامة الـ ER. في جميع الصور المعروضة، يمثل شريط المقياس 10 microns.

تظهر اللوحات الموجودة على اليسار استعادة الفلورة باللون الأخضر عند رصدها بطول موجي 515 nanometers. ويظهر واسم الشبكة الإندوبلازمية (ER) باللون الأحمر. وفي اللوحات الوسطى، يظهر تراكب كلتا الإشارتين في اللوحات اليمنى.

تمت مراقبة إشارة مُعاد تشكيلها لـ TPR seven مع HS P 90، حيث ظهر تداخل مع علامة ER باللون الأصفر. وفي المقابل، لم تُرصد أي إشارة لـ TPR seven أو للضابط السلبي CFP. وفي المثال التالي، تم التعبير المشترك لبروتين البلاستيدة الخضراء tox 64 مع HS P 90 كضابط.

تم التعبير المشترك عن Tox 64 مع SCFP بمفرده. وكما سبق، تمت مراقبة الفلورية المعاد تشكيلها باللون الأخضر عند 515 nanometers. وتظهر اللوحات الوسطى الفلورية الذاتية للكلوروفيل التي تمت مراقبتها عند 480 nanometers.

يظهر التراكب الأحمر لكلتا الإشارتين في اللوحات اليمنى. لوحظ استعادة الفلورة في الخلايا التي تعبر بشكل مشترك عن tox 64 و HSP 90، ولكن ليس في الخلايا التي تعبر بشكل مشترك عن tox 64 و SCFP وحدهما.

بما أن التحديد الدقيق لموقع tox 64 و HSP 90 يصعب تحقيقه في الصور المجهرية للأوراق الكاملة، فقد تم عزل البروتوبلاست من أوراق التبغ الملقحة من أجل المجهر الفلوري. وكما سبق، تمت مراقبة الفلورة المعاد تشكيلها عند 515 nanometers، ومراقبة الفلورة الذاتية للكلوروفيل عند 480 nanometers، وتم إنشاء صور تراكبية كما هو موضح في هذه الصورة التراكبية، حيث يمكن رصد tox 64 و HSP 90 كهياكل حلقية الشكل تحيط بالبلاستيدات الخضراء.

بعد مشاهدة هذا الفيديو، ينبغي أن يكون لديك فهم جيد لكيفية تصميم البناءات الجينية، وتحويل أوراق التبغ، وأفضل طريقة لتصور الإشارة الفلورية التي توضح التفاعل بين البروتينين المستهدفين.