التوافقي النانوية للبحوث التجديدي

الهدف العام من التجربة التالية هو المراقبة المخبرية لتجمعات خلايا القلب النابضة المشتقة من الخلايا الجذعية الجنينية البشرية في الزمن الحقيقي وبدقة مكانية عالية وثلاثية الأبعاد. يتم تحقيق ذلك أولاً عن طريق زراعة وتوسيع الخلايا الجذعية الجنينية حتى تشكل أجساماً جنينية. بعد ذلك، يتم تشريح التجمعات النابضة وزراعتها على مرشحات مسامية من مادة POLYTETRAFLUOROETHYLENE أو PTFE، مما يسمح بالحفاظ عليها لفترات طويلة في الهواء.

تتم بعد ذلك تسمية المزارع السائلة ثم التجمعات النابضة بجسيمات نانوية توافقية من أجل إجراء مجهرية فوتونية متعددة في الوقت الفعلي. وتسمح النتائج التي تم الحصول عليها بتحليل الاستطالة المكانية وتكرار الانقباضات القلبية على المقياس المجهري. لذا فإن الميزة الرئيسية لهذه الجسيمات النانوية هي إمكانية استخدام أي طول موجي، وخاصة الأشعة تحت الحمراء، مما يتيح التغلغل بشكل أعمق في الأنسجة، كما أنها مستقرة جداً بمرور الوقت.

وبذلك يمكننا مراقبة عملياتنا الطويلة عبر أطر زمنية ممتدة. ومن شأن طريقة زراعة الخلايا الجذعية هذه أن تساعد في الإجابة على أسئلة جوهرية في مجال الانقباض الوظيفي للخلايا العضلية القلبية في ثلاثة أبعاد، وبالأخص فيما يتعلق بنضج القلب وهندسة الأنسجة.

يجب على الأشخاص الذين يستخدمون هذه الطريقة المرضية الجديدة أن يدركوا أن إجراء الوسم باستخدام الجسيمات النانوية التوافقية يمكن استخدامه فقط في المجهر متعدد الفوتونات ولا يمكن نقله إلى أنواع أخرى من أنظمة التصوير. لقد خطرت لنا فكرة استخدام الجسيمات النانوية التوافقية لأول مرة في عام 2005. وتقدم هذه الجسيمات النانوية مزايا مقارنة بالأصباغ الفلورية والنقاط الكمومية.

في الواقع، لا تتلاشى إشارتها بمرور الوقت، ويمكن استخدامها لمراقبة العينات النامية على فترات زمنية طويلة. يُعد التوضيح المرئي لتحضير العينة أمراً بالغ الأهمية لكفاءة وقابلية تكرار الخطوات المختلفة، لا سيما عند إجراء اختبارات الأدوية، ويمكن تطبيق ذلك أيضاً على أنسجة أو أمراض مختلفة. نمذجة الأنسجة.

بعد استزراع وتوسيع الخلايا الجذعية الجنينية البشرية (ESCs) وفقاً للبروتوكول النصي وتحضينها مع الكولاجيناز الدافئ، four لمدة 10 دقائق، يتم جمع شظايا المستعمرات في 2 mL من وسط التمايز الطازج (DM) والطرد المركزي بقوة 115 ×g لمدة 3 دقائق. تُستزرع شظايا المستعمرات في معلق في أطباق سداسية الآبار فائقة انخفاض الالتصاق لمدة أربعة أيام للسماح لها بتكوين الأجسام الجنينية (ebs).

بعد ذلك، يتم توزيع أجسام التشكيل الجنيني (EBS) المتكونة حديثاً على أطباق ذات 24 بئراً مطلية بـ 0.1% Gelatin لمدة تتراوح من 15 إلى 30 يوماً حتى ظهور تجمعات نابضة. يتم إزالة محلول PBS، وباستخدام أداة acutus، تُفصل المستعمرات إلى خلايا مفردة بعد عملية الطرد المركزي، ثم تُعلق الخلايا في وسط DM، بحيث يُوضع 2 mL في كل بئر، وتُحضن عند 37 درجة مئوية لمدة يوم واحد.

قم بجمع أجسام الجنين الاصطناعية (EBS) المتكونة حديثاً، وزع ثلاثة منها في كل بئر على أطباق ذات 24 بئراً مغطاة بـ 0.1% gelatin بعد أسبوعين إلى أربعة أسابيع من الزرع. حدد تجمعات الخلايا العضلية القلبية النابضة، وقم بتشريحها يدوياً باستخدام ماصة لصق ذات طرف مدبب ومقطوع طولياً. ضع أربعة مرشحات PTFE في كل إدراج، ثم ضع كل إدراج في بئر من طبق ذي ستة آبار.

بعد إضافة 1 mL من وسط DM إلى كل منها، يتم وضع عنقود نابض واحد مُشرح على كل مرشح PTFE. ولتمييز العناقيد، يتم نقل مرشحات PTFE التي تحتوي على العناقيد النابضة إلى طبق زجاجي القاع بقطر 3.5 cm. ثم يُضاف 1 mL من جسيمات النانو المولدة للتوافق الثاني بتركيز 50 µg/mL، وتُحضن لمدة 30 دقيقة عند 37 °C لإجراء التصوير البصري غير الخطي.

بعد نقل أجسام القلب البشرية (HEBs) الموصومة أو مجموعات الخلايا القلبية النابضة إلى غرفة التصوير، استخدم التصوير واسع المجال تحت إضاءة الضوء الأبيض لتحديد البنى ذات الأهمية ضمن الأجسام القلبية (EBS) المتمايزة أو مجموعات الخلايا النابضة النشطة. قم بإجراء مسح سريع ثلاثي الأبعاد منخفض الدقة لإعادة بناء المورفولوجيا العامة للمجموعة القلبية، واختر مستوى تصوير داخل حجم المجموعة يحتوي على عدة جسيمات نانوية مرئية لتوليد التوافق الثاني لمراقبتها في الوقت الفعلي. تفرض انقباضات المجموعة القلبية ضبط الماسح الضوئي للمجهر على أسرع وضع، مما يسمح بالاستحواذ على صور ثنائية الأبعاد بترددات متعددة (multi hertz).

قم بتحليل الصور باستخدام برنامج MATLAB وفقاً للبروتوكول النصي كما هو موضح هنا قبل تقييم نشاط الخفقان. يتم إجراء توصيف للاستجابة البصرية غير الخطية لمرشحات PTFE للتأكد من أن الفلورة الناتجة عن الركيزة العارية تجاه الفوتونات ضعيفة جداً ولا يمكنها منع قياس العينات البيولوجية ذات الصلة، كما يمكن الحصول بسهولة على الانبعاث الصادر من جسيمات توليد التوافقي الثاني النانوية المعزولة عن طريق التصوير عبر الركيزة في وضع الكشف فوق المجهري (epi detection mode).

في هذا الشكل، تظهر جسيمات توليد التوافق الثاني النانوية وهي تميز الهياكل القلبية وEBS بشكل واضح. تشير الألوان الأحمر والأصفر والأخضر إلى التألق الذاتي لـ NADH، بينما تنشأ بقع التوافق الثاني الزرقاء الكثيفة من جسيمات توليد التوافق الثاني النانوية المعزولة. لاحظ التباين البصري الجيد والوسم المتناثر نسبياً مقارنة بالنقاط الكمومية أو جسيمات التحويل التصاعدي النانوية.

يوضح هذا الشكل عرضاً مقطعياً لتجمع خلايا قلبية نابضة تم وسمها بجسيمات نانوية مولدة للتوافق الثاني. وكما يظهر في هذا المقطع المرئي، تم تسجيل الهياكل ثلاثية الأبعاد بسرعة عالية لمراقبة نمط الانقباض في الخلية الثانية. تتجمع الجسيمات النانوية المولدة للتوافق للحفاظ على معدل سرعة استحواذ عالية من أجل تحليل حركة الجسيمات النانوية.

لم تكن حساسية الاستحواذ الإجمالية كافية لتسجيل الفلورة الذاتية للخلايا مع انبعاث التوافق الثاني الناتج عن توليد التوافق الثاني. ويشير تحليل صور الجسيمات النانوية الذي أجري على إطارات الفيديو إلى أن الإزاحات داخل نفس العنقود القلبي تكون في حدود بضعة ميكرومترات، وأن التردد ثابت لحركة الجسيمات النانوية في توليد التوافق الثاني سواء كانت داخل المستوى أو خارجه. وعند إتقان تقنية تحضير الخلايا، يمكن إتمام تشريح العنقود القلبي، والزراعة في الوسط الهوائي السائل، والترقيع خلال 24 إلى 36 ساعة إذا تم تنفيذ ذلك بشكل صحيح.

ويجب تجنب التلامس مع الهواء الطلق بشكل خاص عند استخدام هذه التقنية لمنع حدوث التلوثات. وباتباع هذا الإجراء، يمكن تطبيق طرق أخرى مثل التسجيلات الفيزيولوجية الكهربائية باستخدام مصفوفات الأقطاب المتعددة من أجل الإجابة على أسئلة إضافية، مثل ربط ملامح جهد الفعل بتردد الضربات في الأبعاد الثلاثة. كما يمكن تطوير تقنيتنا المبتكرة القائمة على اكتشاف الإشارة غير الخطية بواسطة الجسيمات النانوية التوافقية بشكل أكبر لإجراء دراسات in vivo، حيث تسمح الأطوال الموجية المستخدمة في التصوير باختراق أعمق في الأنسجة.

من التطورات الممكنة متابعة دمج الهياكل المشتقة من الخلايا الجذعية لتطبيقات الطب التجديدي.