التوافقي النانوية للبحوث التجديدي
مايو 1, 2014
وترد تفاصيل بروتوكول للفي المختبر وضع العلامات الخلايا الجذعية الجنينية البشرية مع ثاني النانوية توليد التوافقي. وتعرض أيضا منهجيات التحقيق HESC بواسطة المجهر متعدد الفوتون والتمايز بهم في مجموعات القلب.
الهدف العام من التجربة التالية هو المراقبة المختبرية لمجموعات الخرز القلبية المشتقة من الخلايا الجذعية الجنينية البشرية في الوقت الفعلي ثلاثي الأبعاد والدقة المكانية العالية. يتم تحقيق ذلك عن طريق زراعة الخلايا الجذعية الجنينية وتوسيعها أولا حتى تشكل أجسام Embry. بعد ذلك ، يتم تشريح مجموعات الضرب وطلاءها على مرشحات مسامية POLYTETRAFLUOROETHYLENE أو PTFE ، مما يسمح بالحفاظ عليها كهواء طويل الأجل.
يتم تصنيف الثقافات السائلة ثم العناقيد الضاربة بجسيمات نانوية توافقية من أجل إجراء فحص مجهري متعدد الفوتون في الوقت الفعلي. تسمح النتائج التي تم الحصول عليها بتحليل الاستطالة المكانية وتكرار الانقباضات القلبية على النطاق المجهري. لذا فإن الميزة الرئيسية لهذه الجسيمات النانوية هي أنه يمكنك استخدام أي طول موجي ، خاصة الأشعة تحت الحمراء ، حتى تتمكن من التعمق في الأنسجة وهي أيضا مستقرة جدا بمرور الوقت.
حتى نتمكن من مراقبة عملياتنا الطويلة على مدى أطر زمنية طويلة. يمكن أن تساعد طريقة زراعة الخلايا الجذعية هذه في الإجابة على الأسئلة الرئيسية في مجال الانقباض الوظيفي لخلايا عضلة القلب في ثلاثة أبعاد. على وجه الخصوص ، نضوج القلب وهندسة الأنسجة.
يجب أن يدرك الأفراد طريقة المرض الجديدة أن إجراء وضع العلامات مع الجسيمات النانوية التوافقية لا يمكن استخدامه إلا للفحص المجهري متعدد الفوتون ولا يمكن نقله إلى نوع آخر من أنظمة التصوير. خطرت لنا لأول مرة فكرة استخدام الجسيمات النانوية التوافقية في عام 2005. تقدم هذه الجسيمات النانوية مزايا فيما يتعلق بالأصباغ الفلورية والنقاط الكمومية.
في الواقع ، لا تتلاشى إشارتهم بمرور الوقت ويمكن استخدامها لمراقبة العينات النامية على مدى فترات زمنية طويلة. يعد العرض المرئي لتحضير العينة أمرا بالغ الأهمية لكفاءة الخطوات المختلفة وقابليتها للتكرار ، لا سيما عند إجراء اختبار المخدرات ويمكن أيضا تطبيقه على أنسجة أو أمراض مختلفة. نمذجة الأنسجة.
بعد زراعة وتوسيع الخلايا الجذعية الجنينية البشرية أو الخلايا الجذعية الجنينية وفقا لبروتوكول النص واحتضانها بالكولاجيناز الدافئ ، أربعة لمدة 10 دقائق ، اجمع شظايا المستعمرة في ملليلترين من التمايز الطازج ، متوسط أو DM وأجهزة الطرد المركزي عند 115 ضعف الجاذبية لمدة ثلاث دقائق. الثقافة ، تقطع المستعمرة في تعليق في مرفقات منخفضة للغاية. ست ألواح آبار لمدة أربعة أيام للسماح لها بتكوين أجسام جنينية أو ebs.
ثم قم بوضع EBS المشكل حديثا على 0.1٪ مغلفة بالجيلاتين 24 لوح بئر لمدة 15 إلى 30 يوما حتى ظهور مجموعات الضرب. قم بإزالة PBS وباستخدام acutus ، وفصل المستعمرات إلى خلايا مفردة بعد الطرد المركزي وإعادة التشكيل ، مع تعليق الخلايا في لوحة DM المتوسطة ملليلتر لكل agro. غرفة البئر واحتضانها عند 37 درجة مئوية ليوم واحد.
اجمع EBS المشكلة حديثا واللوحة ثلاثة لكل بئر على 0.1٪ مغلفة بالجيلاتين 24 لوحة بئر بعد أسبوعين إلى أربعة أسابيع في المزرعة. حدد مجموعات خلايا عضلة القلب النابضة واستخدم ماصة معجون ممدودة مقطوعة بشكل حاد ، وقم بتشريحها يدويا. قم بإيداع أربعة مرشحات PTFE لكل ملحق وضع كل منها في بئر من ستة ألواح آبار.
بعد إضافة مليلتر واحد من DM إلى كل منها ، أضف مجموعة خفق واحدة مشرحة إلى كل مرشح PTFE. لتسمية المجموعات ، انقل مرشحات PTFE مع مجموعات الضرب إلى طبق زجاجي قاع بطول 3.5 سم. أضف ملليلترا واحدا من الجسيمات النانوية من الجيل التوافقي الثاني عند 50 ميكروغراما لكل مليلتر واحتضانه لمدة 30 دقيقة عند 37 درجة مئوية لإجراء التصوير البصري غير الخطي.
بعد نقل مجموعات HEBs أو مجموعات ضربات القلب المسمى إلى غرفة التصوير ، استخدم التصوير الواسع المجال تحت إضاءة الضوء الأبيض لتحديد الهياكل ذات الأهمية داخل EBS المتمايزة أو مجموعات الضرب النشطة. قم بإجراء مسح ثلاثي الأبعاد سريع منخفض الدقة لإعادة بناء التشكل الكلي لمجموعة القلب وتحديد مستوى صورة داخل حجم العنقود مع العديد من الجسيمات النانوية التوافقية الثانية المرئية لمراقبتها في الوقت الفعلي. تضع تقلصات الكتلة القلبية الماسح الضوئي المجهري في أسرع وضع ، مما يسمح بالحصول على صور ثنائية الأبعاد متعددة الهرتز.
قم بتحليل الصور باستخدام برنامج MATLAB وفقا لبروتوكول النص كما هو موضح هنا قبل تقييم نشاط الضرب. يتم إجراء توصيف الاستجابة البصرية غير الخطية لمرشحات PTFE للتأكد من أن الركيزة العارية لمضان الفوتون ضعيفة جدا ولا يمكن أن تمنع قياس العينات البيولوجية ذات الصلة والانبعاث من المعزول. يمكن الحصول على الجسيمات النانوية من الجيل الثاني بسهولة عن طريق التصوير من خلال الركيزة في وضع الكشف عن epi.
في هذا الشكل ، يتم عرض الجسيمات النانوية التوافقية الثانية المسماة هياكل القلب و EBS على شكل شفرة. تتوافق الألوان الحمراء والصفراء والخضراء مع التألق الذاتي NADH بينما تنبع البقع التوافقية الثانية الزرقاء الكثيفة من الجسيمات النانوية من الجيل الثاني المعزولة. لاحظ التباين البصري الجيد ووضع العلامات المتناثرة نسبيا مقارنة بالنقاط الكمومية أو الجسيمات النانوية ذات التحويل الأعلى.
يوضحهذا الشكل عرضا لشريحة من الجيل التوافقي الثاني للجسيمات النانوية المسماة مجموعة النبضات القلبية. كما هو موضح في هذا الفيلم ، يتم تسجيل الهياكل ثلاثية الأبعاد بسرعة عالية لمراقبة نمط الانكماش في الخلية الثانية. تتجمع الجسيمات النانوية للتوليد التوافقي للحفاظ على معدل سرعة اكتساب مرتفع لحل حركة NP.
لمتكن حساسية الاستحواذ الإجمالية كافية لتسجيل التألق الذاتي للخلية مع الانبعاث التوافقي الثاني من الجيل التوافقي الثاني. يشير تحليل صورة الجسيمات النانوية التي يتم إجراؤها على إطارات الأفلام إلى أنه داخل نفس إزاحة الكتلة القلبية في حدود بضعة ميكرومترات ، والتردد ثابت لداخل وخارج حركة الجسيمات النانوية من الجيل الثاني العادي. عند إتقان تقنية تحضير الخلية ، تقوم مجموعة الرهان بتشريح مزرعة سائل الهواء ويمكن إجراء الحمل في غضون 24 إلى 36 ساعة إذا تم إجراؤها بشكل صحيح.
خاصة مع هذه التقنية ، يجب تجنب ملامسة الهواء الطلق لمنع التلوث. باتباع هذا الإجراء ، يمكن للمرء تطبيق طرق أخرى مثل التسجيلات الفيزيولوجية الكهربية باستخدام مصفوفات أقطاب كهربائية متعددة من أجل الإجابة على أسئلة إضافية مثل ربط ملفات تعريف جهد الفعل بتردد الضرب في ثلاثة أبعاد. يمكن تطوير تقنيتنا الجديدة القائمة على اكتشاف الإشارة غير الخطية بواسطة الجسيمات النانوية التوافقية بشكل أكبر من أجل الدراسات في الجسم الحي تصيب الأطوال الموجية المستخدمة للتصوير تسمح باختراق أعمق في الأنسجة.
يمكن أن يكون أحد التطورات المحتملة هو اتباع تكامل البنية المشتقة من الخلايا الجذعية لتطبيقات الطب التجديدي.
اعرض النص الكامل واحصل على الوصول إلى آلاف الفيديوهات العلمية
نظرة عامة
تقدم هذه المقالة بروتوكولًا لوضع العلامات داخل المختبر لخلايا الجذع الجنينية البشرية (hESCs) باستخدام جسيمات نانوية توليد التوافق الثاني. وتفصل المنهجيات للتحقيق في hESCs من خلال التصوير المجهري متعدد الفوتونات وتنميتها إلى مجموعات قلبية.
مكونات الدراسة الرئيسية
مجال العلم
- أبحاث الخلايا الجذعية
- بيولوجيا القلب
- تقنيات التصوير المجهري
الخلفية
- يمكن أن تتمايز الخلايا الجذعية الجنينية البشرية إلى أنواع مختلفة من الخلايا.
- رصد مجموعات لؤلؤ القلب أمر بالغ الأهمية لفهم تطور القلب.
- تقدم الجسيمات النانوية المولدة للتوافق الثاني ميزات في التصوير.
- يوفر التصوير المجهري متعدد الفوتونات دقة مكانية عالية للتحليل في الوقت الفعلي.
غرض الدراسة
- لمراقبة مجموعات لؤلؤ القلب المشتقة من hESCs في الوقت الفعلي.
- لتحليل التمدد المكاني وتواتر الانقباضات القلبية.
- لاستخدام الجسيمات النانوية للتصوير الأعمق للأنسجة.
الطرق المستخدمة
- زراعة وتوسيع hESCs لتشكيل أجسام جنينية.
- تشريح وزرع مجموعات النبضات على فلاتر PTFE المسامية.
- وضع العلامات على مجموعات النبضات باستخدام الجسيمات النانوية التوافقية.
- إجراء التصوير المجهري متعدد الفوتونات في الوقت الفعلي للتحليل.
النتائج الرئيسية
- مراقبة ناجحة للانقباضات القلبية على المقياس المجهري.
- ثبات الجسيمات النانوية على مر الزمن.
- القدرة على استخدام أطوال موجية مختلفة للتغلغل الأعمق في الأنسجة.
- رؤى حول ديناميكيات سلوك مجموعات القلب.
الخلاصات
- تسمح المنهجية بمراقبة فعالة لمجموعات القلب في المختبر.
- تعزز الجسيمات النانوية المولدة للتوافق الثاني قدرات التصوير.
- يمكن أن يتقدم هذا النهج في فهم تطور القلب من الخلايا الجذعية.
الأسئلة المتداولة
Executive Industry Relevance
Labeling human embryonic stem cell-derived cardiac clusters with second harmonic generation nanoparticles (HNPs) enables high-resolution, real-time 3D monitoring of tissue dynamics critical for regenerative research. This approach provides stable, deep-tissue imaging for extended observation of cardiac maturation and functional contraction, supporting predictive confidence in early discovery and tissue engineering workflows. The method advances portfolio decision-making by enabling quantitative, reproducible analysis of stem cell-derived tissue constructs.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Enables quantitative interrogation of cardiomyocyte function and maturation in 3D tissue models.
- Supports mechanistic de-risking by providing direct visualization of contractile behavior in stem cell-derived systems.
- Facilitates functional target validation for cardiac tissue engineering and regenerative medicine research.
Screening & Assay Development
- Prepares validated, labeled cardiac clusters for downstream multiphoton imaging assays.
- Delivers reproducible, quantitative readouts of contraction frequency and displacement patterns.
- Supports assay standardization and scalability for compound evaluation in disease-relevant systems.
Translational & Preclinical Research
- Aligns with translational biomarker strategies by enabling 3D functional analysis of cardiac constructs.
- Provides continuity from discovery-stage tissue modeling to preclinical validation of regenerative therapies.
- Reduces biological risk by supporting predictive assessment of tissue integration and function.
Pipeline & Workflow Integration
This method integrates into the discovery-to-preclinical continuum by enabling hypothesis testing, functional validation, and quantitative analysis of stem cell-derived cardiac tissues.
- Discovery Biology: Supports mechanistic studies of cardiac differentiation and contractility in engineered tissues.
- Screening: Provides robust, quantitative imaging outputs for evaluating functional endpoints.
- Analytics: Enables measurement of displacement and contraction frequency for comparative analysis.
- Translational Research: Bridges in vitro tissue modeling with preclinical assessment of regenerative strategies.
- Enterprise Reuse: Offers a reusable imaging and analysis platform for diverse tissue engineering applications.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Increases predictive confidence and reduces mechanistic ambiguity in cardiac tissue research.
- Operational Value: Delivers stable, reproducible imaging over long-term experiments.
- Strategic Value: Improves go/no-go decisions and capital efficiency in regenerative portfolio development.
- Portfolio Impact: Enables risk-adjusted prioritization of tissue engineering and regenerative medicine programs.
Implementation Considerations
- Requires expertise in stem cell culture, tissue engineering, and multiphoton microscopy.
- Needs access to advanced imaging platforms and quantitative analysis software (e.g., MATLAB).
- Demands cross-team standardization of labeling and imaging protocols for reproducibility.
- Adaptation to other tissue types or disease models may require protocol optimization.
- Labeling with HNPs is limited to multiphoton microscopy and not transferable to other imaging modalities.
