وسم الخلية وحقن في تطوير الجنينية الماوس قلوب

الهدف العام من هذا الإجراء هو إجراء حقن الخلايا التي تموت ، أو الحمض النووي في قلوب الفئران الجنينية. من أجل التحقيق في دهون الخلية أو للتلاعب المحلي بالتعبير الجيني ، يتم تحقيق ذلك عن طريق تشريح الأجنة أولا من فأر حامل وتعريض القلب الجنيني. بعد ذلك ، يتم حقن صبغة أو خلايا الحمض النووي في المنطقة المستهدفة ذات الاهتمام في القلب.

ثم بعد تحضين الجنين ، تتم إزالة القلب ووضعه في المزرعة. أخيرا ، يتم تحديد مصير الخلايا المحقونة أو المصنفة عن طريق الفحص المجهري. في النهاية ، تتم مراقبة مصير الخلايا المحقونة أو المصنفة أو المعدلة وراثيا عن طريق الفحص المجهري متحد البؤر أو الفحص المجهري الفلوري للضوء والتصوير الموسع الذي يكشف عن الأهمية الوظيفية لجينات وخلايا معينة أثناء نمو القلب.

الميزة الرئيسية لهذه التقنية للطرق الحالية مثل التحول في الفأر ، هي أنه يمكننا حقن الخلايا في المختبر أو التعديل الوراثي محليا ودقيقا في الجسم الحي. هذا يسمح بالتحقيق في هذه الخلايا في البيئة المناسبة. سأظهر هذا الإجراء أنا وإميلي آر، طالبة دكتوراه من أحد المختبرات.

بعد تحضير المعدات والكواشف والمحاليل ، وفقا لبروتوكول النص ، اجمع الأجنة E 9.5 و E 10.5 من فأر حامل تم القتل رحيم عن طريق استخدام 70٪ من الإيثانول أولا لتعقيم الصدر ، وعمل شق بطني في خط الوسط لفتح البطن واستعادة قرن الرحم قبل نقله إلى PBS بدرجة حرارة الغرفة. بعد غسلتين إضافيتين في PBS ، انقله إلى طبق بتري مملوء بالسيليكون. مع وسط M 16 ، استخدم دبابيس الحشرات لتثبيت قرن الرحم على طبقة السيليكون بحيث يكون الجانب الوعائي من الرحم تحته.

ثم استخدم ملقطا دقيقا لقطع سطح الرحم وتغطية المتساقطة عند ملليمتر واحد تحت السطح. انشر جدران القضيب واسترجع الجنين برفق في كيس الصفار. قم بتخزينه في M 16 ، متوسط عند 37 درجة مئوية قبل حقن الخلية لإجراء الحقن.

أولا، استخدم حقنة هاميلتون لملء ماصة زجاجية من الخلف بالحمض النووي أو الخلايا، وقم بهز الماصة لإزالة الفقاعات. عند الطرف، ضع الماصة على حامل الحقن الدقيق واضبط الحاقن وفقا للإعدادات التالية. بعد ذلك ، قم بتثبيت الجنين في قاع السيليكون من خلال كيس الصفار دون لمس الجنين المناسب.

ثم حدد منطقة القلب وافتح الكيس فوق هذه المنطقة مباشرة. أضف أربعة دبابيس حول الجنين لمنع أي حركة أثناء حقن الخلية. باستخدام المعالج الدقيق المضبوطة على اليدوي، ضع طرف الماصة ببطء بزاوية 45 درجة فوق التامور، فوق منطقة القلب المراد

انقل الماصة إلى المنطقة المعنية، وقم بتشغيل الحقن وأخرج الماصة في أسرع وقت ممكن. تأكد من أن القلب ينبض بشكل صحيح بعد حقن الحمض النووي أو الخلية باستخدام بروتوكول الحقن الموضح في هذا الفيديو لدراسة الانتقال الظهاري إلى اللحمة المتوسطة و E 9.5 تم حقن E 9.5 A VC explan ب S-H-R-N-A الذي يقلل من تنظيم البروتين المطلوب للانتقال الوسيط البطاني لخلايا الشغاف. تم حقن الجنين الضابط بناقل العمود الفقري الفارغ ، وبالمثل ، تم حقن الخلايا البطانية قبل الصمامات المشتقة من خلايا HUES التي تعبر عن GFP تحت سيطرة محفز SOX التسعة في A VC في E 10.5 ، تليها 48 ساعة من زراعة القلب.

تكتسب هذه الخلايا علامات EMT ، مثل البيريوستين ، على غرار خلايا الشغاف الذاتية. الأساليب خارج الجسم الحي الموضحة هنا سهلة نسبيا ، ولكنها تقتصر على حد أقصى للمتابعة قصيرة المدى من 48 إلى 72 ساعة. ومع ذلك ، فإن إجراء الحقن الموجه بالموجات فوق الصوتية الموصوف في بروتوكول النص يوفر نهجا أكثر تحديا من الناحية الفنية ، ولكن مع خيار متابعة طويلة حتى بعد الولادة في الرحم.

هنا الحقن داخل الرحم للصبغة أو النواقل الفيروسية لتسمية الخلايا في مناطق قلبية محددة. باستخدام هذه الطريقة ، يمكن تحقيق وضع العلامات المحددة على خلايا النخابي باستخدام الأصباغ الفلورية أو الفيروسات ، ويمكن توسيع الطريقة بالخلايا أو الحقن البديلة. باتباع هذا الإجراء ، يمكن إجراء طريقة مثل ثقافة bryo من أجل الإجابة على أسئلة إضافية مثل التأثير طويل المدى للجين أو الجزيء أو قراءة القائمة الطويلة ، مثل تشكل الأنسجة بعد تطورها.

مهدت هذه التقنية الطريق للباحث في مجال علم الأحياء التطوري للقلب وعلم الوراثة. إنه يمكننا من استكشاف عالم الجينات الجديدة أيضا للتحقيق في مصير الخلية البشرية في السياق الجنيني المناسب. هذا مفيد جدا عندما لا يتوفر خط ماوس معدل وراثيا.