طويلة الأجل حيوي داخلي المناعي التصوير من الأنسجة مكونات مصفوفة مع Epifluorescence والميكروسكوب ثنائي الفوتون

الهدف العام من هذا الإجراء هو إجراء تصوير تألق مناعي حيوي لأذن الفئران الحاملة للورم الميلانيني لدراسة ديناميكيات مكونات المصفوفة لأنسجة الورم. يتم تحقيق ذلك عن طريق تلقيح أذن الفأر أولا باستخدام GFP الذي يعبر عن خلايا الورم الميلانيني B 16 F 10. يتم إجراء الجراحة التالية على أذن الفأر من أجل فصل البطن عن جلد الأذن الظهرية وفضح أنسجة الورم.

ثم يتم إجراء تلطيخ مناعي على الأنسجة المكشوفة للأذن الظهرية. أخيرا ، يتم تحضير للتصوير الحيوي الداخلي. في النهاية ، يتم استخدام الفحص المجهري المجري الفلوري أو الفحص المجهري متعدد الفوتون لإظهار التوطين والسلوك الديناميكي للخلايا السرطانية ومكوناتها المصفوفة.

الميزة الرئيسية لهذه التقنية مقارنة بطرق التصوير الحي الأخرى هي أنه يمكننا تصوير التفاعلات الديناميكية للخلايا السرطانية مع الخلايا المرتبطة باللحمة مثل الخلايا المناعية ، ولكنها في سياق الرجفان والشبكة مثل المصفوفة خارج الخلية. لذلك يمكن أن تساعدك هذه الطريقة في معالجة الأسئلة الرئيسية في مجال بيولوجيا الورم ، مثل كيفية تفاعل الخلايا السرطانية مع بيئتها الدقيقة الفيزيائية ، والتي بدورها قد توفر رؤى مهمة حول كيفية تقدم الأورام. سيتم عرض جزء من الإجراء بواسطة Vita Kki ، أحد كبار العلماء في مختبرنا لتحضير الخلايا السرطانية للحقن ، ابدأ بزراعة خلايا الورم الميلانيني B 16 F 10 GFP.

بعد الطرد المركزي ، تنقلها الخلايا إلى أنبوب einor سعة 1.5 مل وتدور مرة أخرى ، وقم بإزالة كل المواد الطافية باستثناء طبقة رقيقة من الوسط تبقى فوق الحبيبات مباشرة ، وأعد تعليق الخلايا في ملاط خلية سميكة بجانب تحميل ملاط الخلية في حجم 10 ميكرولتر. حقنة هاميلتون. قم بإزالة غطاء الطرف من إبرة قياس 33 متصلة وقم بتحميل 20 ميكرولترا من الملاط أعلى حجرة الطرف.

ثم اسحب المكبس للخلف حتى يتم تحميل خمسة ميكرولترات من الملاط داخل المحقنة. بعد تخدير الفأر C 57 Black Six مع التخدير عن طريق الحقن ، احلق رأس الماوس ، وقم بإزالة الشعر على الرأس وحول الأذن ، واشطفه بالماء. باستخدام شريط لاصق ، قم بتثبيت الحافة القريبة للأذن على طرف السبابة.

أدخل إبرة حقنة هاميلتون بين الأدمة الظهرية وغضروف أذن C 57 أسود ستة فأر يخترق الأذن القريبة إلى البعيدة لما يقرب من ملليمترين إلى ثلاثة ملليمترات. حقن ملاط الخلية وسحب الإبرة ببطء من الجلد. دع الخلايا السرطانية تشكل ورما صلبا على مدار سبعة إلى تسعة أيام ، باستخدام المجهر الفلوري لمتابعة نمو الورم.

بعد استخدام مزيج من الأكسجين المرطب والفلور الأيزو لتخدير الماوس ، ضع الماوس على وسادة تسخين 37 درجة مئوية وقم بإجراء قرصة لطيفة على إصبع القدم. للتأكد من أن مخدر بما فيه الكفاية. ضع مرهم العين على العينين واحتفظ بالفأر على وسادة تسخين يتم التحكم فيها بواسطة ثرمستور المستقيم طوال العملية بأكملها.

بعد ذلك ، ضع الأذن الحاملة للورم برفق على كومة من الشرائح الزجاجية. ثم استخدم شرائط صغيرة من الشريط اللاصق لتثبيت الحواف الأمامية والخلفية للأذن على المكدس باستخدام مشرط ، وقم بقص الجلد البطني للأذن على طول اللولب المضاد لصيوان الفأر. قم بإزالة الأشرطة من الأذن بمساعدة ملاقط منحنية.

قشر الأدمة البطنية والغضاريف برفق من الأدمة الظهرية. استخدم عازلة الرنين لغسل الأذن لإجراء تلطيخ الفلورسنت المناعي. ضع الأجسام المضادة الأولية التي تستهدف جزيئات المصفوفة خارج الخلية في حجب المخزن المؤقت للأذن المكشوفة ، ووضع زلة غطاء في الأعلى.

احتضن لمدة 15 دقيقة قبل استخدام ما يقرب من خمسة ملليلتر من الجرعات العازلة لغسل الأذن مرتين. تطبيق الأجسام المضادة الثانوية المناسبة أو البكتيريا العقدية عدن في المخزن المؤقت المنع. ضعي زلة غطاء واحتضنها لمدة 15 دقيقة قبل غسلها مرتين كما كان من قبل ، قم بطي المنطقة الجلدية المفتوحة في EM mencia conki واستخدم مناديل معقمة لتجفيف أدمة الأذن الخارجية غير المفتوحة.

ضع الأذن على كومة من الشرائح الزجاجية وقم بتطبيق 0.5 ميكرولتر من الغراء الجراحي على الحواف الظهرية الأمامية والخلفية لشل حركتها للتصوير قصير المدى لمدة ساعتين أو أقل. أضف معقما طازجا كمخزن مؤقت لجرس السوربات أعلى الأذن الثابتة وقم بتطبيق زلة غطاء. ثم استخدم مجهر استريو فلوري مع عدستين لتصوير الأذن.

للتصوير طويل المدى. ضع مخرج إبرة متصلة بخزان يحتوي على جرس سوربات تحت زلة الغطاء على بعد حوالي 0.5 سم من الأذن. استخدم مضخة تمعجية بسرعة ميكرولتر واحد في الدقيقة لتوصيل المخزن المؤقت باستمرار إلى الغرفة.

افتح برنامج الاستحواذ. اضبط شدة مضان الكسب ، والتكبير وصورة وقت التعرض ، والعديد من الحقول التي تحتوي على خلايا سرطانية ، بالإضافة إلى بروتينات المصفوفة خارج الخلية الملطخة لإجراء التصوير داخل الحيوية باستخدام الفحص المجهري متعدد الفوتون بشحم السيليكون. بدءا من قاعدة الأذن.

قم ببناء جدار دائري يبلغ قطره حوالي سنتيمترين وارتفاعه من ملليمترين إلى ثلاثة ملليمترات حول الأذن. املأ الدائرة بجرعات السوربات. ضع الماوس على المسرح على وسادة تسخين ، اضبطها على 37 درجة مئوية وقم بتكوين إعدادات المجهر وفقا لبروتوكول النص.

كما هو موضح في هذا الشكل ، يمكن تمييز العديد من الهياكل بناء على مورفولوجيتها بعد التلوين المناعي. بالنسبة لمكونات الغشاء القاعدي مثل الكولاجين الرابع أو البرولين ، والأهم من ذلك ، البروتينات الهيكلية التي لا يمكن اكتشافها عادة بواسطة SHG. يمكن تصور طريقة الكشف عن المصفوفة الكلاسيكية.

على سبيل المثال ، وجدنا أن العشرات و C تترسب في مواقع مختلفة من سدى الورم من قوى الكولاجين الليفية التي تتطور داخل البيئة المكروية للورم قد تؤدي إلى تمدد أو تقلص مصفوفة الورم ، ونتيجة لذلك ، إعادة تشكيل الأوعية الدموية للورم على غرار التئام الجروح. نوضح هنا أنه يمكننا إجراء اثنين من الفحص المجهري للفوتون بفاصل زمني ، مع تصوير مصفوفة C ذات المسمى المناعي في نفس الوقت مع الحد الأدنى من تبييض الصور للفلور فور ، حتى في كثافة الفوتون العالية لفحص الفوتون. في هذا الفيديو ، تلتصقت الخلايا السرطانية التي تم تراكبها على الأدمة المكشوفة الملطخة بالكولاجين الرابع بالأنسجة وبدأت في مجموعات في الهجرة بشكل جماعي على طول الغشاء القاعدي للأوعية الدموية والمواقع الدهنية.

بمجرد إتقان الإجراء الكامل لفتح الأذن والتلوين المناعي يستغرق ساعتين. بعد مشاهدة هذا الفيديو ، يجب أن يكون لديك فهم جيد لكيفية إجراء تلطيخ مناعي داخل الحيوية لدراسة تفاعلات مصفوفة الخلايا في الأورام باستخدام مضان epi أو اثنين من المجهريات الفوتونية.