أفضل: الباركود تمكين تسلسل Tetrads

الهدف العام من هذا الإجراء هو إنتاج عدد كبير من السلالات الوليدة المعاد تركيبها من تهجين الخميرة بطريقة تحتفظ بالمعلومات حول السلالات الوليدة التي اشتقت من نفس الرباعية الأصلية. يتم تحقيق ذلك أولاً عن طريق تحويل السلالة ثنائية الصيغة الصبغية متغايرة الزيجوت المستخدمة في التهجين باستخدام مكتبة بلازميدية تحتوي على رمز شريطي محدد للرباعية ومراسل فلوري محدد للتبيوغ. وتتمثل الخطوة الثانية في نقل الخلايا ذات الرموز الشريطية إلى وسط التبيوغ.

يسمح هذا بتكوين الأبواغ الرباعية (tetras) ويحفز تعبير المراسل الفلوري GFP في الأبواغ الرباعية، ولكن ليس في الخلايا التي تفشل في عملية التبوغ. بعد ذلك، يقوم جهاز فرز الخلايا (fax sorter) بفصل الأبواغ الرباعية الموصومة فلوريًا عن الخلايا الأخرى وإيداعها مباشرة في طبق أغار، حيث يتم هضم الغلاف الخارجي للأبواغ الرباعية إنزيميًا. تتمثل الخطوة النهائية في استخدام حبيبات زجاجية لفصل ونشر أبواغ الأبواغ الرباعية المهضومة عبر سطح طبق الأغار، مما يسمح لكل بوغة بتكوين مستعمرة واحدة.

وفي نهاية المطاف، سيتم تحديد النمط الجيني للسلالات التي تم الحصول عليها باستخدام هذه الطريقة عبر بروتوكول تسلسل DNA متعدد الإرسال عالي الإنتاجية يقوم بقراءة الرمز الشريطي (barcode) رباعي التحديد لكل سلالة. وتُستخدم هذه الرموز الشريطية بعد ذلك لتحديد كل سلالة من السلالات الأربع الناتجة عن حدث اختزالي واحد. وتكمن الميزة الرئيسية لهذه التقنية مقارنة بالطرق الحالية، مثل التشريح اليدوي الدقيق باستخدام الملاعب الدقيق (micro manipulator)، في قدرة الباحث الواحد على عزل عدة آلاف من النسل المعاد تركيبه في غضون ساعات قليلة فقط.

تم تحويل خلايا الخميرة ثنائية المجموعة الكروموسومية المستخدمة في هذه الدراسة مسبقاً باستخدام مكتبة من البلازميدات ذات الرموز الشريطية كما هو موضح في المخطوطة المرفقة، وخُزنت في درجة حرارة 80- درجة مئوية لإحياء الخلايا من السيقان المجمدة. تُنمى الخلايا طوال الليل في 5 mL من وسط YPD مضافاً إليه 200 µg/mL من G418 عند درجة حرارة 30 درجة مئوية مع الرج، وفي اليوم التالي، تُغسل الخلايا من المزارع الليلية ثلاث مرات في PBS، ثم تُعلق الخلايا مجدداً لتصل إلى حجم نهائي قدره 2 mL في وسط التبوغ، مضافاً إليه 200 µg/mL.

قم برجّ مزارع التبَوْغ G four 18 في درجة حرارة الغرفة. راقب تقدم عملية التبَوْغ يومياً حتى يتوقف تكوين رباعيات (tetrads) جديدة. عادةً ما يستغرق ذلك ما بين يومين إلى أربعة أيام بمجرد أن تحتوي المزارع على رباعيات مكتملة التكوين وعدد قليل نسبياً من الثنائيات (dyads).

أخرج المزارع من جهاز الرج واتركها في درجة حرارة الغرفة لمدة سبعة أيام على الأقل قبل فرز الرباعيات. يكمن الجانب الأكثر صعوبة في هذا الإجراء في تحقيق فصل جيد للأبواغ. وقد وجدنا تجريبياً أن ترك المزارع المتبوغة في درجة حرارة الغرفة دون رج لمدة أسبوع على الأقل قبل فرز الرباعيات يحسن فصل الأبواغ بشكل كبير.

يمكن الكشف عن الرباعيات من مستنبت التبوغ وعزلها باستخدام فرز الخلايا المنشط بالفلورة أو تقنية fax، وذلك لأن البلازميدات ذات الرموز الشريطية في الخلايا الثنائية الصيغة الصبغية تحمل أيضاً بروتين GFP مدمجاً خاصاً بالتبوغ. تم تطوير البروتوكول الموصوف هنا لجهاز fax aria to two. لبدء هذا الإجراء، قم بتحميل المستنبت المبوغ على جهاز فرز fax، وقم بضبط بوابتين للتشتت الأمامي والتشتت الجانبي لاستبعاد الحطام، والخلايا المتكتلة، وتعدد الخلايا في كل قطرة.

يجب أن يكون هناك مجتمع من الخلايا الفلورية، والتي عند استخدام بناء المراسل PS two GFP تشمل الثنائيات والرباعيات؛ يتم ضبط بوابة GFP مقابل FSC لتشمل هذه الأحداث الفلورية. اعتماداً على خلفية السلالة، قد يكون من الضروري إضافة بوابة إضافية لإزالة التجمعات التي تشمل الرباعيات وخلايا أخرى. قم بفحص مخطط FSC التكراري للأحداث الفلورية.

في هذا المثال، تكون الأحداث في القمة اليسرى في الأساس رباعيات (tetras)، بينما تكون الأحداث في القمة اليمنى عموماً رباعيات ملحق بها برعم؛ قم بتطبيق بوابة نهائية تشمل الأحداث ذات تشتت أمامي (FSC) أقل والتي تكون في الغالب رباعيات، كما تشير الأشرطة الحمراء. تحقق من كفاءة نظام البوابة عن طريق فرز 1,500 رباعية تقريباً على شريحة مجهرية وحساب نسبة الرباعيات إلى غير الرباعيات. باستخدام مجهر تباين الأطوار عند تكبير 400 مرة، يمكن تقدير نسبة الرباعيات بدقة عن طريق عد 200 حدث مفروز تقريباً فقط، ولكن فرز 1,500 حدث تقريباً يقلل من مقدار الوقت المستغرق في البحث عن الخلايا على الشريحة المجهرية.

تُظهر صور المجال المضيء هذه تكبيراً بمقدار 600 مرة. تظهر أمثلة على الرباعيات (tetrads) على اليسار وغير الرباعيات على اليمين بعد عملية الفرز. تحقق بشكل دوري من أن جهاز الفرز يسجل عدد الأحداث بدقة عن طريق فرز 25 رباعية على شريحة مجهرية وفحص الخلايا الموجودة في القطرة باستخدام مجهر تباين الطور بتكبير 400 مرة.

يجب أن تحتوي القطيرة على 25 رباعية. كرر هذه العملية ثلاث أو أربع مرات لتقييم تباين جهاز fax في تلك الدورة. قم بتجهيز أطباق الآجار لهذا الإجراء عن طريق تدفئة العدد المطلوب من أطباق YPD plus G four 18 لمدة 1.5 ساعة على الأقل في حاضنة بدرجة حرارة 37 °C موضوعة بالقرب من جهاز fax sorter.

تتمثل الميزة الرئيسية لبروتوكول الفرز في القدرة على توجيه الرباعيات التي تم فرزها بواسطة جهاز الفرز بالتدفق الخلوي (fax sorted tetrads) بدقة إلى موقع محدد على طبق أغار يحتوي على مجموعة من محلول X. وللقيام بذلك، ضع أولاً طبق علامة مكوناً من 96 بئراً على وحدة ترسيب الخلايا الآلية في جهاز الفرز. بعد ذلك، قم بإعداد مخطط فرز يتم من خلاله فرز 25 رباعية في بئر واحد من طبق الـ 96 بئراً.

يؤدي فرز 25 تيترا لكل طبق بتنسيق الآبار إلى الحصول على مستعمرات منفصلة جيداً. اختر بئراً قريباً من منتصف الطبق، على سبيل المثال، البئر D5.

انقل مجموعة مكونة من 10 أطباق آغار من الحاضنة عند درجة حرارة 37 درجة مئوية إلى جهاز الفرز. خذ طبق آغار واحد واستخدم الماصة لوضع 25 µL من محلول zy على الآغار بالقرب من مركز الطبق. ثم ضع الطبق فوق طبق الآبار 96 المرجعي، مع محاذاة قطرة X فوق الهدف.

لقد تم اختيار ذلك مسبقاً. البئر D5. ابدأ عملية الفرز وأودع 25 من رباعيات الساعات (tetras) في منتصف قطرة zy على طبق الآجار.

قم بإزالة الطبق وتغطيته. كرر عملية الفرز لكل طبق حتى يتم فرز 25 رباعية (tetrads) في قطرات zamo على كل طبق في المجموعة. أعد مجموعة الأطباق التي تحتوي على الرباعيات إلى الحاضنة عند درجة حرارة 37 درجة Celsius.

أحضر مجموعة الأطباق العشرة التالية إلى جهاز الفرز وكرر إجراء الفرز. يمكن فصل الأبواغ بعد تحضين أطباق الآجار التي تحتوي على الرباعيات عند 37 درجة مئوية لمدة 1.5 ساعة. لبدء هذا الإجراء، أضف من 15 إلى 25 خرزة زجاجية معقمة بقطر 3 ملم إلى كل طبق، ورج الأطباق في مجموعتين تتكون كل منهما من خمسة أطباق لمدة تتراوح من ثلاث إلى خمس دقائق.

يتحقق أفضل فصل للأبواغ عن طريق تحريك الأطباق بشكل صلب من جانب إلى آخر أو من الأمام إلى الخلف. لا تحرك الأطباق بطريقة تؤدي إلى دوران الخرزات حول الحافة الخارجية للطبق. اترك الخرزات على الأطباق عند الانتهاء.

ضع مجموعة الأطباق التي تحتوي على الخرز بحيث يكون الوجه للأعلى في حاضنة عند درجة حرارة 30 درجة مئوية. استخرج مجموعة الأطباق التالية من الحاضنة عند درجة حرارة 37 درجة مئوية وكرر إجراء فصل الأبواغ باستخدام الخرز. قم بتحضين جميع الأطباق طوال الليل عند درجة حرارة 30 درجة مئوية في اليوم التالي لفصل الأبواغ.

أخرج الأطباق بعناية من الحاضنة عند درجة حرارة 30 degrees Celsius دون تحريك الخرز الزجاجي. يجب أن تكون مستعمرات صغيرة قد تكونت على الأطباق. قم بإزالة الخرز الزجاجي عن طريق قلب الأطباق بعناية وبسرعة فوق وعاء عميق.

يمكن أن يساعد النقر على قاع الطبق أثناء قلبه في تحرير الخرزات الملتصقة بالطبق. يجب أن تكون الحاويات عميقة بما يكفي لالتقاط الخرزات دون السماح لها بالارتداد والاصطدام بطبق الآجار. قم بعدد المستعمرات في كل طبق واستخدم عدد المستعمرات لتقدير كفاءة فصل الأبواغ واستعادتها.

على سبيل المثال، قد ينتج عن 25 رباعية (tetrads) لكل طبق في عملية تهجين ذات حيوية تقارب 100% إجمالي 100 مستعمرة لكل طبق من الأطباق التي تحتوي على أعداد كافية من المستعمرات، مثل أكثر من 65 مستعمرة في حالة الحيوية العالية. انقل خلايا التهجين من كل مستعمرة إلى بئر منفصل في طبق بـ 96 بئراً يحتوي على وسط YPD السائل بالإضافة إلى G four 18. كما يجب تدوين الآبار التي تحتوي على مستعمرات من نفس طبق الآجار.

ستُستخدم هذه المعلومات لاحقاً للمساعدة في تعيين الرباعيات. يمكن للبرمجيات أن تحسن بشكل كبير من السرعة التي يمكن بها عزل الأبواغ من الرباعيات. وعلى الرغم من أن الإصدار الحالي من هذه الطريقة يتضمن بعض الفقدان في الكفاءة مقارنة بالتشريح اليدوي، فقد استُخدم توزيع ذات الحدين لحساب الكسر المتوقع للرباعيات التي تحتوي على بوغ واحد مسترجع بنجاح على الأقل ينتج مستعمرة واحدة، أو اثنتين، أو ثلاثاً، أو أربع مستعمرات، وذلك بناءً على نسبة جميع الأبواغ التي تم استرجاعها بنجاح.

يمكن أن يعمل هذا الرسم البياني كدليل تقريبي لعدد السلالات التي سيتم تجميعها في النهاية في ثلاث أو أربع رباعيات أبواغ كما هو ملاحظ هنا. يزداد عدد الرباعيات الكاملة المستعادة مع زيادة عدد المستعمرات لكل طبق في هذه الدراسة. تم توزيع 25 rads من عبر مع حيوية أبواغ تقترب من 100% كما تم تحديدها عن طريق التشريح اليدوي على 149 طبق أغار.

بلغ الحد الأقصى لعدد المستعمرات الملاحظة لكل طبق 80 مستعمرة، مما يشير إلى أن 20 بوغاً قد فشلت في تكوين مستعمرات منفصلة. وبلغ متوسط عدد المستعمرات لكل طبق 62. تم جمع وتسلسل 4,354 مستعمرة من 61 طبقاً تحتوي على 65 مستعمرة أو أكثر. ومن بين 3,700 سلالة اجتازت مراقبة جودة التسلسل، أمكن تعيين 2,665 سلالة أو 72% حسابياً ضمن ثلاث أو أربع رباعيات بوغية بمجرد إتقان العملية.

يمكن استخدام هذه التقنية لمعالجة أكثر من ألف رباعية في الساعة. ومع ذلك، ستحتاج إلى المساعدة في حال استمرت العملية لأكثر من ثلاث ساعات.