التنميط الفردية الخلايا الجذعية الجنينية البشرية من خلال الكمي RT-PCR

الهدف العام من هذا الإجراء هو تحديد مستويات التعبير الجيني للخلايا الجذعية الجنينية البشرية الفردية باستخدام تفاعل البوليميراز المتسلسل للنسخ العكسي الكمي أحادي الخلية ، أو R-T-P-C-R. يتم تحقيق ذلك عن طريق استخدام فرز الخلايا المنشطة بالفلورسنت أولا لفرز الخلايا الفردية في كل بئر من لوحة 96 بئر تحتوي على عازلة تحلل الخلية. الخطوة الثانية هي عكس نسخ الحمض النووي الريبي لتوليد CDNA من محللات الخلية الواحدة.

بعد ذلك ، يتم تضخيم CDNA عن طريق تفاعل البوليميراز المتسلسل. الخطوة الأخيرة هي إجراء R-T-P-C-R الكمي على CDNA المضخم. في النهاية ، يعد هذا الاختبار مفيدا لدراسة التعبير الجيني في المجموعات السكانية غير المتجانسة مثل الخلايا الجذعية الجنينية البشرية.

الميزة الرئيسية لهذه التقنية على الأوعية الاصطناعية الكمية أحادية الخلية الموجودة هي أن هذه الطريقة ، مخطط كهربية الدماغ وأكثر قوة قبل تنقية الفاكس. يتم فصل الخلايا الجذعية الجنينية البشرية OCT four EGFP أو Hess عن الطبق 60 ملم. قم بإزالة كل الوسائط ، وأضف ملليلترا واحدا من Accutane واحتضن عند 37 درجة مئوية لمدة 20 دقيقة.

قم بتحييد Accutane باستخدام مليلتر واحد من أجهزة الطرد المركزي لوسائط ES البشرية لتكسير الخلايا بعد التخلص من الخلايا الطافية ، وإعادة تعليق الخلايا في مخزن مؤقت للفاكس وضبط التركيز إلى واحد في 10 إلى الخلايا الست لكل مليلتر. بعد ذلك ، مرر عينة الخلية عبر أنبوب غطاء مصفاة خلية 35 ميكرومتر. قم بتخزين الأنبوب على الثلج قبل فرز الخلايا.

ابدأ هذا الإجراء بإعداد مزيج رئيسي يحتوي على ميكرولتر واحد من خلية واحدة D Ns واحد وتسعة ميكرولتر من محلول تحلل الخلية الواحدة. لكل منها ، قم بنقل 10 ميكرولترات من محلول المزيج إلى كل بئر من لوحة PCR سعة 96 بئرا لبرنامج تحليل الفاكس ، وفارز الخلايا لفرز الخلايا الموجبة EGFP المفردة في آبار لوحة PCR 96 جيدا بعد فرز الخلايا ، واحتضان العينات لمدة خمس دقائق في درجة حرارة الغرفة لتحلل الخلية. لإيقاف تفاعل التحلل ، أضف ميكرولتر واحد من محلول التوقف واحتضانه في درجة حرارة الغرفة لمدة دقيقتين.

لبدء هذا الإجراء ، أضف أولا إلى كل بئر من لوحة البئر 96 0.5 ميكرولتر Eloqua من 20 ميكرومولار SMAT 15 و SMAA. سخني العينات على حرارة 80 درجة مئوية لمدة خمس دقائق. ثم أضف أربعة ميكرولترات من خمسة × مخزن مؤقت ، وميكرولترين من DTT ، وميكرولتر واحد من النسخ العكسي ، وميكرولتر واحد من D و tps.

لكل جيد أداء النسخ العكسي في دورة حرارية. اضبط البرنامج الحراري على 42 درجة مئوية لمدة 90 دقيقة ، متبوعة ب 85 درجة مئوية لمدة خمس دقائق. لتعطيل النسخ العكسي عند اكتمال النسخ العكسي ، أضف أربعة ميكرولترات من الكاشف الخارجي إلى كل عينة من حضن عينة CDNA عند 37 درجة مئوية لمدة 15 دقيقة لهضم انزلاق قليل النوكليوتيدات الزائدة ، متبوعة ب 80 درجة مئوية لمدة 15 دقيقة.

لتعطيل الكاشف الخارجي ، قم بإعداد مزيج تفاعل تفاعل البوليميراز المتسلسل باستخدام اثنين من مولار النانو من SMAP اثنين من التمهيدي. أضف 10 ميكرولتر من مزيج تفاعل تفاعل البوليميراز المتسلسل (PCR). لكل عينة مكتوبة عكسية.

قم بإجراء التضخيم الذي يتكون من 20 دورة من التمسخ ، والركوع والتمديد بعد تضخيم العينات التي أجريت مجموعتين من تفاعلات R-T-P-C-R الكمية في لوحات منفصلة لتأكيد نتائج R-T-P-C-R لكل بئر من 2 96 لوحة بئر تضيف 10 ميكرولتر من اثنين × سايبر جرين. يمزج PCR الرئيسي ميكرولتر واحد من CDNA المضخم اثنين من الاشعال وسبعة ميكرولترات من الماء. اضبط البرنامج على 95 درجة مئوية لمدة ثلاث ثوان ، متبوعة ب 60 درجة مئوية لمدة 30 ثانية.

لمدة 40 دورة ، تتم إزالة خطوة الركوع لتقليل خطأ التمهيدي. عند الركوع في هذه الدراسة ، تم تخفيف كميات ميكروغرام من إجمالي الحمض النووي الريبي ل Hess إلى مستويات النانو والبيكوغرام لتقييم التباين التقني والكشف عن الاختلاف على كميات منخفضة من إجمالي الحمض النووي الريبي الكمي R-T-P-C-R لجين G-A-P-D-H تم إجراؤه باستخدام MR. NA للقشور المجمعة المخففة بشكل متسلسل من 10 نانوجرام لكل ميكرولتر إلى 0.1 بيكوغرام لكل ميكرولتر. تظهر كل نقطة قيمة التصوير المقطعي المحوسب ل mRNA المخفف متسلسلا و mRNA أحادي الخلية مرتبة حسب الفاكس.

لوحظ وجود ارتباط بين كل عينة ونتائج QR TPCR مع العديد من الخلايا المفردة التي تظهر قيم التصوير المقطعي المحوسب المتشابهة. تم استخدام الفاكس لفرز وتحديد الخلايا الإيجابية القوية لتخطيط كهربية الدماغ FP من خط HESC لمراسل OCT four EGFP. تظهر النتائج وجود مجموعة إيجابية ل EGFP تبلغ حوالي 60٪ مقارنة بالسكان السلبين للتحقق من الاتساق بين دفعات مختلفة من تفاعلات النسخ والتضخيم العكسية.

تم تقسيم محللات الخلية المفردة المنقاة بالفاكس إلى نصفين وطبق البروتوكول على كل نصف لمقارنات الدفعات. لوحظ وجود علاقة ذات دلالة إحصائية بين قيمة التصوير المقطعي المحوسب OCT الأربعة لكل نصف من محللات الخلية الواحدة. يظهر عرض خريطة الحرارة للتعبير الجيني للقشر الفردي مستوى ثابتا وقويا من التعبير الرابع OCT ، ولكن مستويات متفاوتة من جين علامة آخر للخلايا الجذعية ، NAN og مجتمعة تظهر نتائجنا أن مقايسة التعبير الجيني للخلية المفردة مفيدة لدراسة عدم تجانس السكان للخلايا الجذعية متعددة القدرات.

بعد مشاهدة هذا الفيديو ، يجب أن يكون لديك فهم جيد لكيفية إجراء QITP لنسخ الخلية المفردة بشكل صحيح.