Name: التنميط الفردية الخلايا الجذعية الجنينية البشرية من خلال الكمي RT-PCR (فيديو) | JoVE Journal
Uploaded: 2014-05-29T13:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 3 s
Description: اكتشف تحليل التعبير الجيني للخلايا الجذعية الجنينية البشرية على مستوى الخلية الواحدة باستخدام تقنية RT-qPCR الكمية. تكشف هذه الطريقة عن التباين في التعبير الجيني داخل مجتمعات الخلايا الجذعية.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

نود أن نشكر أعضاء المختبر لي لإجراء مناقشات قيمة على المخطوطة. وأيد العمل في المختبر لي من المنح المقدمة من روبرتسون جائزة الباحث نيويورك مؤسسة الخلايا الجذعية من ولاية ماريلاند وصندوق أبحاث الخلايا (TEDCO) الجذعية.

1. إعداد اللوحة 96 جيد <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> مزيج 1 ميكرولتر من خلية واحدة DNase1 إلى 9 ميكرولتر وحيد الخلية تحلل الحل. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> وضع 10 ميكرولتر حل مختلطة في كل بئر من 96 لوحة جيدا PCR. </li></ol> 2. فصل hESCs لنظام مراقبة الأصول الميدانية تنقية <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> فصل OCT4 :: خط الخلية EGFP ES من 60 ملم صحن مع 1 مل Accutase لمدة 20 دقيقة، عند 37 درجة مئوية، والتي كانت متعادلة مع وسائل الاعلام الإنسان ES. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> إعداد السكان خلية في 1 مل FACS العازلة وضبط خلية إلى 1 × 10 6 خلية / مل. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> تمرير عينة الخلية من خلال مصفاة الخلية 35 ميكرومتر غطاء الأنبوب. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> تخزين أنبوب في الجليد قبل الفرز الخلية. </li></ol> 3. تحلل من نظام مراقبة الأصول الميدانية تنقية خلية واحدة في كل بئر من لوحة 96 جيدا <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> فرز عينة للخلايا إيجابية EGFP على فارز الخلية مع المشغل المدربين. وضع خلية واحدة في خلية واحدة Lysis/DNase1 حل في 96 لوحة جيدا PCR. إذا لزم الأمر، و9لوحة 6 جيدا مع عينة يمكن تخزينها في -80 درجة مئوية التجميد العميق أقل من شهر واحد. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> احتضان العينات 5 دقائق على RT لتحلل الخلية. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> إضافة 1 ميكرولتر من وقف الحل لوقف رد فعل تحلل. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> احتضان 2 دقيقة في RT. </li></ol> 4. عكس النسخ <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> إضافة إلى كل قسامة 0.5 ميكرولتر من 20 ميكرومتر SMA-T15، SMA-A. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> إضافة 4 ميكرولتر 5X العازلة، 2 ميكرولتر DTT، 1 ميكرولتر الناسخ العكسي، و 1 ميكرولتر dNTP إلى كل بئر. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> أداء النسخ العكسي في cycler الحرارية. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ضبط البرنامج الحراري في 42 ° C × 90 دقيقة وتعطيل الناسخ العكسي في 85 ° C × 5 دقائق. </li></ol></li></ol> 5. التضخيم <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> إضافة 4 ميكرولتر من كاشف ExoSAP-IT لكل عكس العينة كتب. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> احتضان العينات عند 37 درجة مئوية لمدة 15 دقيقة و 80 درجة مئوية لمدة 15 دقيقة إلى تعطيل كاشف ExoSAP-IT. </li></ol></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> إعداد PCR مزيج التفاعل ثإيث SMA-P2 (2 نانومتر) </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> إضافة 10 ميكرولتر من مزيج PCR رد فعل على عكس كل عينة كتب. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> أداء التضخيم، ويتألف من 20 دورات تمسخ (94 درجة مئوية لمدة 30 ثانية)، الصلب (57 درجة مئوية لمدة 30 ثانية)، والإرشاد (68 درجة مئوية لمدة 10 دقيقة). </li></ol> 6. الأداء QRT-PCR <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> إضافة 10 ميكرولتر من 2X SYBR الأخضر ميكس ماجستير PCR، 1 ميكرولتر تضخيم [كدنا]، 2 الاشعال نانومتر، و 7 ميكرولتر المياه إلى كل بئر. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ضبط البرنامج تليها 95 درجة مئوية لمدة 3 ثانية، 60 درجة مئوية لمدة 30 ثانية × 40 دورات. </li></ol></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> أداء في مكررة لأخطاء فنية. </li></ol>

<ol><li>Miyanari, Y., Torres-Padilla, M. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Control+of+ground-state+pluripotency+by+allelic+regulation+of+Nanog%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Control of ground-state pluripotency by allelic regulation of Nanog.</a> Nature. 483, 470-473 (2012).</li>
<li>Leitch, H. G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Embryonic+germ+cells+from+mice+and+rats+exhibit+properties+consistent+with+a+generic+pluripotent+ground+state%5BTitle%5D)+AND+%22Development%22%5BJournal%5D)">Embryonic germ cells from mice and rats exhibit properties consistent with a generic pluripotent ground state.</a> Development. 137, 2279-2287 (2010).</li>
<li>Ramskold, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Full-length+mRNA-Seq+from+single-cell+levels+of+RNA+and+individual+circulating+tumor+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Biotechnol%22%5BJournal%5D)">Full-length mRNA-Seq from single-cell levels of RNA and individual circulating tumor cells.</a> Nat Biotechnol. 30, 777-782 (2012).</li>
<li>Stewart, M. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Clonal+isolation+of+hESCs+reveals+heterogeneity+within+the+pluripotent+stem+cell+compartment%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Methods%22%5BJournal%5D)">Clonal isolation of hESCs reveals heterogeneity within the pluripotent stem cell compartment.</a> Nat Methods. 3, 807-815 (2006).</li>
<li>O'Malley, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((High-resolution+analysis+with+novel+cell-surface+markers+identifies+routes+to+iPS+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">High-resolution analysis with novel cell-surface markers identifies routes to iPS cells.</a> Nature. 499, 88-91 (2013).</li>
<li>Nichols, J., Smith, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Naive+and+primed+pluripotent+states%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Stem+Cell%22%5BJournal%5D)">Naive and primed pluripotent states.</a> Cell Stem Cell. 4, 487-492 (2009).</li>
<li>Kim, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((miR-371-3+expression+predicts+neural+differentiation+propensity+in+human+pluripotent+stem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Stem+Cell%22%5BJournal%5D)">miR-371-3 expression predicts neural differentiation propensity in human pluripotent stem cells.</a> Cell Stem Cell. 8, 695-706 (2011).</li>
<li>Mortazavi, A., Williams, B. A., Mccue, K., Schaeffer, L., Wold, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mapping+and+quantifying+mammalian+transcriptomes+by+RNA-Seq%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Methods%22%5BJournal%5D)">Mapping and quantifying mammalian transcriptomes by RNA-Seq.</a> Nat Methods. 5, 621-628 (2008).</li>
<li>Pan, Q., Shai, O., Lee, L. J., Frey, J., Blencowe, B. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Deep+surveying+of+alternative+splicing+complexity+in+the+human+transcriptome+by+high-throughput+sequencing%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Genet%22%5BJournal%5D)">Deep surveying of alternative splicing complexity in the human transcriptome by high-throughput sequencing.</a> Nat Genet. 40, 1413-1415 (2008).</li>
<li>Wang, E. T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Alternative+isoform+regulation+in+human+tissue+transcriptomes%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Alternative isoform regulation in human tissue transcriptomes.</a> Nature. 456, 470-476 (2008).</li>
<li>Hockemeyer, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Genetic+engineering+of+human+pluripotent+cells+using+TALE+nucleases%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Biotechnol%22%5BJournal%5D)">Genetic engineering of human pluripotent cells using TALE nucleases.</a> Nat Biotechnol. 29, 731-734 (2011).</li>
<li>Lee, G., Chambers, S. M., Tomishima, M. J., Studer, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Derivation+of+neural+crest+cells+from+human+pluripotent+stem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Protoc%22%5BJournal%5D)">Derivation of neural crest cells from human pluripotent stem cells.</a> Nat Protoc. 5, 688-701 (2010).</li>
<li>Zhu, Y. Y., Machleder, E. M., Chenchik, A., Li, R., Siebert, P. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Reverse+transcriptase+template+switching%3A+A+SMART+%28TM%29+approach+for+full-length+cDNA+library+construction%5BTitle%5D)+AND+%22Biotechniques%22%5BJournal%5D)">Reverse transcriptase template switching: A SMART (TM) approach for full-length cDNA library construction.</a> Biotechniques. 30, 892-897 (2001).</li>
<li>Pan, X. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Two+methods+for+full-length+RNA+sequencing+for+low+quantities+of+cells+and+single+cells%5BTitle%5D)+AND+%22P+Natl+Acad+Sci+USA%22%5BJournal%5D)">Two methods for full-length RNA sequencing for low quantities of cells and single cells.</a> P Natl Acad Sci USA. 110, 594-599 (2013).</li>
<li>Tang, F. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((RNA-Seq+analysis+to+capture+the+transcriptome+landscape+of+a+single+cell%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Protoc%22%5BJournal%5D)">RNA-Seq analysis to capture the transcriptome landscape of a single cell.</a> Nat Protoc. 5, 516-535 (2010).</li>
</ol>

والكتاب ليس لديهم ما يكشف.

واحد التنميط الجيني الخلايا يمكن أن تكون أداة رئيسية للتنبؤ وظيفة من خلية واحدة أو شعب بأكمله. بسبب قيود تقنية، وقد تم تقييد التحليل التنميط الجيني بأكمله إلى المتوسطات السكان. وقد اقترحت الاختلافات في أنماط التعبير الجيني ومستويات بين الخلايا الفردية والمجموعات السكانية الفرعية للتسبب التفسير الخاطئ. هذه الجوانب الخلوية المتنوعة يمكن العثور عليها في hESCs ويسبب عدم التجانس قدرتها المختلفة بمهارة للحفاظ على تعدد القدرات والمواصفات مصير العملية. <p class="jove_content" style=";...

السكان حقيقي النواة معظم العالي غير متجانسة وبالتالي مع تحليل من سكان المجمعة، غالبا ما يكون من الصعب تفسير خصائصها الخلوية. الخلايا الفردية ضمن مجموعة من السكان قد تكون مختلفة بمهارة، ويمكن لهذه الاختلافات لها عواقب هامة للخاصية وظيفة من إجمالي عدد السكان 1، 2. خاصة، ومن المعروف عن الخلايا الجذعية الجنينية البشرية (hESCs) أن تكون غير متجانسة، والذي يسبب مستويات مختلفة من تعدد القدرات والإمكانات المتنوعة لمواصفات النسب في طرق مميزة بدقة 3 و 4. على سبيل المثال، تختلف مستضدات سطح الخلية يمكن استخدامها لتصنيف الخلايا الجذعية المحفزة غير متمايزة، (5) ومجموعة أوستن سميث المقترحة مستويات مختلفة من تعدد القدرات في الخلايا الجذعية الجنينية، استنادا على التشكل، الميل التمايز وتبعية يشير مسار 6. وقد افترض هذه الظاهرة في الجنين البشريالخلايا الجذعية شركة الاستثمارات الوطنية 7. في حين أجريت الدراسات الشاملة بين مختلف خطوط الخلايا الجذعية، وليس الخلايا الجذعية فرد واحد، ويمكن أن تكون مثيرة للغاية لتحليل مستويات مختلفة من تعدد القدرات على مستوى خلية واحدة، والتي يحتمل أن يؤثر على قدرات التمايز تجاه كل الأنساب الخلية الجسدية. يمكن أملت عدم التجانس الخلوية والجزيئية من خلال التنميط النسخ، وهو ما يسمى &#39;Transcriptome على خلية واحدة&#39; ويؤكد نهج جديدة لقياس مستويات التعبير الجيني 8-10. لتحليل مستويات التعبير الجيني في الخلايا الفردية، وضعنا بروتوكولا بسيطة، ولكن قوية من خلية واحدة الكمي RT-PCR. أكدنا على فعالية وجدوى من بروتوكول لدينا من خلال مقارنة كل نصف لست] خلية واحدة، وكذلك مجموع الرنا المخفف متسلسل من hESCs، مما أدى إلى الاختلافات التقنية والحد الأدنى من الخلافات. علاوة على ذلك، استخدمنا خط مراسل الوراثية لعزل ع متجانسةopulation من hESCs باستخدام نظام استهداف الجينات. استخدمت ناقلات المانحة لاستهداف OCT4 موضع (OCT4-2A-EGFP-PGK-بورو بناء) وزوج من البلازميدات TALEN 11. أدخلت ناقلات المانحة وزوج من البلازميدات TALEN في hESCs (H9، WA09) باستخدام لدينا nucleofection وبروتوكول اختيار نسيلي وصيانة أجريت hESCs استنادا لدينا بروتوكول روتين 12. أكدنا هذا الخط مراسل الوراثية التعبير عن EGFP لOCT4 التعبير في OCT4 :: EGFP hESCs. لدينا نتيجة يدل على أن hESCs الفردية (تم الفرز حسب OCT4 :: EGFP الخلايا إيجابية بقوة) عقد مستويات عالية من OCT4 التعبير، ولكن مستويات مختلفة من NANOG التعبير. لذلك، يجب أن يكون لدينا واحد الجينات الخلية التعبير فحص مفيدة لدراسة التغاير السكان من الخلايا الجذعية المحفزة.

<table><tbody><tr><td>96-well PCR لوحة</td><td>الولايات المتحدة الأمريكية العلمية</td><td>1402-8900</td><td></td></tr><tr><td>Ambion Cell Lysis Kit</td><td>Life Technologies</td><td>4458235</td><td></td></tr><tr><td>SMARTScribe Reverse Transcriptase</td><td>Clonetech</td><td>639536</td><td></td></tr><tr><td>ExoSAP-IT</td><td></td><td>USB 78200</td><td></td></tr><tr><td>Platinum Taq DNA polymerase عالي الدقة</td><td>Invitrogen</td><td>11304</td><td></td></tr><tr><td>10 ملي مولار dNTP Mix، PCR Grade</td><td>Invitrogen</td><td>18427</td><td></td></tr><tr><td>SYBR Universal 2X Master Mix</td><td>Kapa biosystem</td><td>KR0389</td><td></td></tr><tr><td>Accutase</td><td>Innovative Cell Tech</td><td>S-1100-1</td><td></td></tr><tr><td>FACS buffer</td><td></td><td></td><td>45 مل PBS ، 5 مل a-MEM ، 100 & mu ؛ ل DNase ، مرشح معقم</td></tr><tr><td>35 & مو ؛ أنابيب غطاء مصفاة الخلية m BD</td><td>Biosciences</td><td>352235</td><td></td></tr></tbody></table>

التنميط الفردية الخلايا الجذعية الجنينية البشرية من خلال الكمي rt-pcr

Profiling Individual Human Embryonic Stem Cells by Quantitative RT-PCR

عدم تجانس السكان الخلايا الجذعية يعوق فهم مفصل لبيولوجيا الخلايا الجذعية، مثل التمايز ميلها نحو الأنساب مختلفة. وحيد الخلية Transcriptome على الفحص يمكن أن يكون نهجا جديدا لتشريح الاختلاف الفردية. قمنا بتطوير خلية واحدة طريقة QRT-PCR، وأكد أن هذا الأسلوب يعمل بشكل جيد في العديد من ملامح التعبير الجيني. في مستوى خلية واحدة، كل خلية الجذعية الجنينية البشرية، تم الفرز حسب OCT4 :: الخلايا إيجابية EGFP، لديه عالية في التعبير OCT4، ولكن على مستوى مختلف من NANOG التعبير. وينبغي أن يكون لدينا واحد الجينات الخلية التعبير فحص مفيدة لاستجواب التغاير السكان.

كفاءة وقوية واحدة تضخيم الحمض النووي الريبي الخلية لتقليل التباين بين النسخي hESCs، استخدمنا OCT4 :: EGFP HESC استنساخ لتنقية نظام مراقبة الأصول الميدانية. بعد فرز OCT4 :: الخلايا إيجابية EGFP في لوحة 96 جيدا، وهي lysed كل خلية في تحلل العازلة وتحويلها بولي (A) + RNA إلى كامل طول كدنا] باستخدام SMA-T15 (GACATGTATCCGGATGTTTTTTTTTTTTTTTT) التمهيدي وترسيخ مع SMA-A (ACATGTATCCGGATG...

وهناك حاجة واحدة الجين الخلية التعبير مقايسة لفهم التغاير الخلايا الجذعية.

التنميط الفردية الخلايا الجذعية الجنينية البشرية من خلال الكمي RT-PCR

Heterogeneity of stem cell population hampers detailed understanding of stem cell biology, such as their differentiation propensity toward different ...

الهدف العام من هذا الإجراء هو تحديد مستويات التعبير الجيني للخلايا الجذعية الجنينية البشرية الفردية باستخدام تفاعل البوليميراز المتسلسل للنسخ العكسي الكمي للخلية الواحدة، أو R-T-P-C-R. يتم تحقيق ذلك أولاً باستخدام فرز الخلايا المنشط فلوريسنتياً لفرز الخلايا الفردية في كل بئر من طبق يحتوي على 96 بئراً وبها منظم لysis الخلايا. وتتمثل الخطوة الثانية في إجراء النسخ العكسي لـ RNA لتوليد CDNA من نواتج تحلل الخلايا الفردية.بعد ذلك، يتم تضخيم الـ CDNA بواسطة تفاعل البوليميراز المتسلسل. وتتمثل الخطوة النهائية في إجراء R-T-P-C-R الكمي على الـ CDNA المُضخّم. وفي النهاية، يعد هذا المقايسة مفيدًا لدراسة التعبير الجيني في المجموعات غير المتجانسة مثل الخلايا الجذعية الجنينية البشرية.تتمثل الميزة الرئيسية لهذه التقنية مقارنة بالأوعية الاصطناعية الكمية ذات الخلية الواحدة الموجودة في أن هذه الطريقة، وتخطيط كهربية الدماغ (EEG)، أكثر متانة قبل تنقية الفاكس. يتم فصل خلايا OCT 4 EGFP الجذعية الجنينية البشرية أو Hess من طبق سعة 60 مليمتر. قم بإزالة جميع أوساط الزرع، وأضف 1 mL من Accutane واحضنها عند درجة حرارة 37 °C لمدة 20 دقيقة.قم بمعادلة Accutane باستخدام 1 mL من وسط ES البشري، ثم استخدم جهاز الطرد المركزي لترسيب الخلايا بعد التخلص من السائل الطافي. أعد تعليق الخلايا في محلول fax buffer واضبط التركيز ليكون 1 × 10⁶ خلية/mL. بعد ذلك، مرر عينة الخلايا عبر مصفاة خلايا بقطر 35 µm في أنبوب سعة. احفظ الأنبوب على الثلج قبل البدء في عملية فرز الخلايا.ابدأ هذا الإجراء بتحضير مزيج رئيسي يحتوي على 1 µL من single cell D Ns one و 9 µL من محلول تحلل الخلايا المفردة. لكل بئر، انقل 10 µL من محلول المزيج إلى كل بئر في لوحة PCR ذات 96 بئراً لتحليل fax. قم ببرمجة فارز الخلايا لفرز الخلايا المفردة الموجبة لـ EGFP في آبار لوحة PCR ذات 96 بئراً. بعد فرز الخلايا، حضن العينات لمدة خمس دقائق في درجة حرارة الغرفة لتحلل الخلايا. لإيقاف تفاعل التحلل، أضف 1 µL من محلول الإيقاف وحضن في درجة حرارة الغرفة لمدة دقيقتين.لبدء هذا الإجراء، أضف أولاً إلى كل بئر من طبق الـ 96 بئراً 0.5 µL من Eloqua بتركيز 20 µM من بادئات SMAT 15 وSMAA. سخّن العينات عند 80 °C لمدة خمس دقائق. ثم أضف 4 µL من المحلول المنظم (5x buffer)، و2 µL من DTT، و1 µL من إنزيم النسخ العكسي (reverse transcriptase)، و1 µL من dNTPs.أجرِ تفاعل النسخ العكسي في كل بئر باستخدام جهاز الدورات الحرارية. اضبط البرنامج الحراري عند 42 °C لمدة 90 دقيقة، يليه 85 °C لمدة خمس دقائق. ولتثبيط إنزيم النسخ العكسي عند اكتمال عملية النسخ العكسي، أضف 4 µL من كاشف exo إلى كل عينة CDNA، ثم حضنها عند 37 °C لمدة 15 دقيقة لهضم بقايا قليلات النوكليوتيد، يليه 80 °C لمدة 15 دقيقة.لتعطيل كاشف exo، قم بتحضير خليط تفاعل PCR باستخدام 2 nM من بادئ SMAP two. أضف 10 µL من خليط تفاعل PCR إلى كل عينة من عينات النسخ العكسي.أجرِ عملية التضخيم المكونة من 20 دورة من المسخ والارتباط والتمديد. وبعد تضخيم العينات، يتم إجراء مجموعتين من تفاعلات quantitative R-T-P-C-R في أطباق منفصلة لتأكيد نتائج R-T-P-C-R؛ حيث يُضاف إلى كل بئر من الطبقين اللذين يحتوي كل منهما على 96 بئراً 10 µL من cyber green 2x PCR master mix، و1 μL من الـ cDNA المضخم، وبادئان (primers)، و7 µL من الماء. اضبط البرنامج على 95 °C لمدة ثلاث ثوانٍ، تليها 60 °C لمدة 30 ثانية.خلال 40 دورة، تم إزالة خطوة التثبيت (kneeling step) لتقليل خطأ البادئ. وفيما يخص التثبيت في هذه الدراسة، تم تخفيف كميات ميكروغرامية من الحمض النووي الريبي الكلي (total RNA) لـ Hess وصولاً إلى مستويات النانو والبيكوغرام لتقييم التباين التقني والكشف عن الاختلافات في الكميات المنخفضة من الـ total RNA. تم إجراء اختبار quantitative R-T-P-C-R لجين G-A-P-D-H باستخدام MR.NA من قشور مجمعة تم تخفيفها تسلسلياً من 10 nanograms per microliter إلى 0.1 picograms per microliter. تمثل كل نقطة قيمة CT للـ mRNA المخفف تسلسلياً والـ mRNA لخلية واحدة تم فرزه بواسطة fax.لوحظ وجود ارتباط بين كل عينة ونتائج QR TPCR، حيث أظهرت العديد من الخلايا المفردة قيم CT متماثلة. استُخدم جهاز Fax لفرز واختيار الخلايا القوية الموجبة لـ EEG FP من خط خلايا HESC Reporter أربعة OCT EGFP. وتظهر النتائج وجود مجموعة موجبة لـ EGFP بنسبة 60% تقريبًا مقارنة بالمجموعة السالبة، وذلك للتحقق من الاتساق بين الدفعات المختلفة من تفاعلات النسخ العكسي والتضخيم.قُسمت نواتج تحلل الخلايا المفردة المنقاة بواسطة تقنية Fax إلى نصفين، وطُبق البروتوكول على كل نصف لإجراء مقارنات بين الدفعات. ولوحظ وجود ارتباط معنوي بين قيمة CT لـ OCT four في كل نصف من نواتج تحلل الخلايا المفردة. ويظهر عرض الخريطة الحرارية للتعبير الجيني للخلية الواحدة مستوىً ثابتاً وقوياً من تعبير OCT four، ولكن بمستويات متفاوتة لجين علامة خلية جذعية آخر وهو NAN og. وبشكل عام، تثبت نتائجنا أن مقايسة التعبير الجيني للخلية الواحدة هذه مفيدة لدراسة عدم التجانس السكاني للخلايا الجذعية متعددة القدرات.بعد مشاهدة هذا الفيديو، يجب أن يكون لديك فهم جيد لكيفية إجراء بروتوكول QITP لتحليل ترانسكريبتوم الخلية الواحدة بشكل صحيح.

profiling-individual-human-embryonic-stem-cells-by-quantitative-rt-pcr

Research

JoVE Journal

Biology

علم الأحياء

وحيد الخلية التنميط التعبير يسمح التعبير الجيني التحليل التفصيلي الخلايا الفردية. نحن تصف طرق لعزل الخلايا العضلية ، وإعداد lysates الناتجة إما كليا أو ميكروأري transcriptome qPCR أهداف محددة.

التنميط واحدة من الخلايا العضلية الترانسكربتي ماوس الكبار

تم وصف طريقة لعزل خلايا الشبكية واحد، والتضخيم لاحق من cDNAs بهم. وحيدة الخلية transcriptomics يكشف عن درجة من عدم التجانس الحالي الخلوي في الأنسجة والجينات تكشف علامة جديدة للسكان الخلية نادر. ويمكن تعديل البروتوكول المرافق لتتناسب مع العديد من أنواع مختلفة من الخلايا.

وحيدة الخلية التنميط من الخلايا العصبية الشبكية المتطورة والناضجة

تحديد خلايا ورم في المخ بدء (BTICs)، وخلايا نادرة داخل الورم غير متجانسة تمتلك خصائص الخلايا الجذعية، ويقدم رؤى جديدة في الدماغ البشري المرضية الورم. صقلنا ظروف محددة لإثراء الثقافة لBTICs، والتي نستخدمها بشكل روتيني التدفق الخلوي لإثراء هؤلاء السكان. يمكن في وقت لاحق الذاتي تجديد المقايسات وتحليل نص واحد بواسطة PCR-RT الخلية سيتم تنفيذها على هذه الخلايا المعزولة.

تجهيز الدماغ الأولية للفحوصات الأنسجة السرطانية والخلايا الجذعية تدفق الفرز

خطوط الخلايا مراسل توفر وسيلة لتصور، وتتبع وعزل الخلايا من الاهتمام من السكان غير متجانسة. ومع ذلك، باستخدام إعادة التركيب مثلي التقليدية في الخلايا الجذعية الجنينية البشرية استهداف الجين غير فعال للغاية. هنا، نحن تصف استهداف CNS محدد المخ الأوسط عامل النسخ PITX3 موضع مع EGFP باستخدام إصبع الزنك نوكلياز تعزيز إعادة التركيب مثلي.

الزنك الاصبع نوكلياز المحسن استهداف الجينات في الخلايا الجذعية الجنينية البشرية

بقصد توصيف التغيرات في miRNAs على الخلايا الجذعية العصبية البشرية المتمايزة (hNSCs) ، نصف تمايز hNSC على نظام ثلاثي الأبعاد ، وتقييم التغيرات في تعبير الحمض النووي الريبي الصغير بواسطة مصفوفة miRNA PCR ، والتحليل الحسابي للتنبؤ بهدف miRNA والتحقق من صحته عن طريق مقايسة لوسيفيراز مزدوجة.

التمايز من العصبية البشرية خط الخلايا الجذعية على الثقافات الثلاث الأبعاد، تحليل الجينات الرنا الميكروي، واعتبارا الهدف

يوفر هذا البروتوكول طريقة بسيطة وفعالة لنشر الخلايا الجذعية البشرية متعددة القدرات (hPSCs) باستخدام الوسائط المكيفة فقط المشتقة من المشيمة البشرية في طبق مغطى بالجيلاتين دون مكملات خارجية إضافية أو طبقات أساسية اصطناعية خاصة ب hPSC.

ثقافة نموذج رواية لالمحفزة الإنسان الجذعية نشر خلية على الجيلاتين في وسائل الإعلام مكيفة المشيمة-

يوفر هذا البروتوكول طريقة لجمع الخلايا الجذعية الجنينية الماوس (مسك) المتوسطة -conditioned (مسك-CM) المستمدة من مصل الدم (مصل الجنين البقري، FBS) - والمغذية (الخلايا الليفية الجنينية الماوس، MEFS) شروط خالية للخلية نهج خالية. قد تكون قابلة للتطبيق لعلاج الشيخوخة والأمراض المرتبطة بالشيخوخة.

جمع Serum- وخالية من تغذية الفأر الجنينية الجذعية المتوسطة مكيفة الخليوي لنهج خالية من خلية

نصف طريقة لفرز خلايا الثدييات المفردة وتحديد التعبير عن ما يصل إلى 96 جينا مستهدفا ذا أهمية في كل خلية. تتضمن هذه الطريقة استخدام معايير qPCR الداخلية لتمكين تقدير عدد النصوص المطلق.

وحيدة الخلية التعبير الجيني التنميط عن طريق نظام مراقبة الأصول الميدانية وQPCR مع المعايير الداخلية

معظم الجينات التعبير القياسات سحابة خلية فردية الاختلافات في الخلية غير المتجانسة السكان. هنا، يمكننا وصف بروتوكول تحليل التعبير الجيني كيف خلية واحدة وفهرس الفرز بالتنوير تنشيط الخلية الفرز (نظام مراقبة الأصول الميدانية) ويمكن الجمع بين تحديد عدم التجانس وإيمونوفينوتيبيكالي تميز سكان الخلية جزيئيا متميزة.

اتباع نهج خلية واحدة اندماجي لتوصيف الجزيئية والتغاير إيمونوفينوتيبيك الجذعية البشرية والسكان السلف

هنا قدمنا مضاعفه خليه واحده mRNA أسلوب التسلسل إلى التعبير الجيني الشخصي في الانسجه الجنينية الماوس. الخلية المفردة القائمة علي القطرات mRNA التسلسل (scRNA-Seq) الأسلوب في تركيبه مع استراتيجيات تعدد الإرسال يمكن الملفات الشخصية خلايا واحده من عينات متعددة في وقت واحد ، مما يقلل بشكل كبير من تكاليف الكاشف ويقلل من اثار الدفعة التجريبية.

مولتيميد خليه واحده mRNA تحليل التسلسل من الخلايا الجنينية الماوس

يصف هذا البروتوكول طريقة للنقل العكسي المتعدد للخلايا الجذعية الجنينية للفأر أثناء الزراعة باستخدام وسائط 2i و LIF. تنتج هذه الطريقة قابلية وكفاءة أعلى من بروتوكولات النقل الأمامية التقليدية ، مع تمكين تحسين نسب البلازميد في وعاء واحد.

تقنية نقل عكسي عكسية قائمة على الخلايا الجذعية الجنينية للفأر للاستكشاف السريع لنسب الحمض النووي

اكتشف تحليل التعبير الجيني للخلايا الجذعية الجنينية البشرية على مستوى الخلية الواحدة باستخدام تقنية RT-qPCR الكمية. تكشف هذه الطريقة عن التباين في التعبير الجيني داخل مجتمعات الخلايا الجذعية.

التنميط الفردية الخلايا الجذعية الجنينية البشرية من خلال الكمي RT-PCR

استكشف المزيد من الفيديوهات