غرفة تدفق العدلات الإنسان التصاق الفحص

الهدف العام من هذا الإجراء هو قياس الالتصاق القوي للخلايا المتعادلة باستخدام مقايسة غرفة التدفق التي تتيح التصاق الخلايا المتعادلة البشرية في ظل وجود إجهاد القص. ويتم تحقيق ذلك أولاً عن طريق تحضير ركيزة من جزيئات الالتصاق المنقاة أو سطح خلية بطانية، مثل الخلايا البطانية لوريد السرة البشري، أو ve. وتتمثل الخطوة الثانية في فصل الخلايا المتعادلة من الدم المحيطي البشري باستخدام طريقة الطرد المركزي بنظام PHI ذو الطبقتين.

بعد ذلك، يتم تجميع غرفة التدفق للسماح بحقن الخلايا المتعادلة البشرية المعزولة تحت إجهاد القص على ركيزة تحتوي إما على جزيئات الالتصاق، أو الربيطات، أو ve. وتتمثل الخطوة النهائية في تسجيل أحداث التصاق الخلايا المتعادلة في غرفة التدفق، يلي ذلك تقدير كمي دقيق للالتصاق القوي. وفي النهاية، يُستخدم مقايسة غرفة التدفق لإثبات الالتصاق القوي للخلايا المتعادلة تجاه جزيئات الالتصاق المنقاة وسطح HX.

يمكن أن تساعد هذه الطريقة في الإجابة على أسئلة جوهرية في مجال المناعة الذاتية، مثل الأهمية الوظيفية للتغيرات الجينية في جزيئات الأنسجة المعروف بارتباطها بتطور المناعة الذاتية. وقد أظهرت الدراسات الجينية على المرضى المصابين بالذئبة الحمامية الجهازية ارتباطاً قوياً بمتغيرات في integrin beta 2، وهو بروتين يشارك في الالتصاق الوثيق للخلايا المتعادلة. لقد طورنا نظام المقايسة هذا لتقييم النتائج الوظيفية للتغير variation الجيني في هذا البروتين beta 2 integrin المسمى Mac-1 على الالتصاق الوثيق. لتجهيز أطباق الزرع للاستخدام في غرفة التدفق.

أضف واحد ملي لتر من محلول الفيبرين والجيلاتين إلى كل طبق زراعة أنسجة بحجم 35 مليمتر، واستخدم الماصة عدة مرات للتأكد من تغطية سطح الطبق بالكامل. تخلص من محلول الفيبرونكتين والجيلاتين الزائد واترك الأطباق لتجف في الهواء لمدة 30 دقيقة على الأقل. ولتحسين تكوين المصفوفة البروتينية، يتم حصاد خلايا بطانية من وريد السرة البشري أو qve التي تمت زراعتها حتى وصلت درجة التلاقي إلى 80 إلى 90% باستخدام trypsin EDTA، ثم يتم استزراع 500,000 خلية في كل طبق زراعة أنسجة مطلي.

أضف ملي لترين من وسط النمو إلى كل طبق، ثم يتم التحضين عند 37 °C و5% CO2. يجب فحص الخلايا بصرياً يومياً مع تغيير الوسط كل يومين. اترك الخلايا لتنمو حتى تصل نسبة التلاقي (confluence) إلى 80 إلى 90%.

لبدء هذا الإجراء، استخدم قلماً أو قلم تحديد لرسم دائرة قطرها 0.5 centimeters في مركز طبق زراعة أنسجة بقطر 35 millimeter. أضف 20 µL من محلول البروتين A بتركيز 20 µg/mL في المنطقة المحددة. استخدم طرف الماصة لتوزيع محلول البروتين A بحيث يغطي كامل المنطقة داخل الدائرة التي قطرها 0.5 centimeters.

من المهم عدم لمس أو خدش سطح الطبق. يتم تحضين أطباق زراعة الأنسجة عند 37 درجة Celsius لمدة ساعة واحدة. بعد ذلك، تُغسل كل شريحة مطلية بالبروتين ثلاث مرات باستخدام 1 mL من PBS.

بعد إزالة محلول PBS من لوحة الغسيل الثالثة، يتم إضافة 50 µL من 1%BSA في المنطقة المحددة لمنع الارتباط غير النوعي على اللوحة. تُحضن اللوحة عند درجة حرارة 4 °C لمدة ساعتين. بعد مرور ساعتين.

اغسل الطبق المحجوب ثلاث مرات باستخدام 1 mL من PBS. قم بتحضير محاليل البروتين الكيميري لمستقبل التصاق FC لغرض التغطية وهذه التجربة، حيث سيتم استخدام ICAM-1 FC Kyra بتركيز 25 µg/mL وP-selectin FC Kyra بتركيز 0.5 µg/mL. غطِّ المنطقة المحددة بـ 50 µL من الركيزة، ثم قم بحضن أطباق زراعة الأنسجة طوال الليل عند درجة حرارة 4 °C.

يجب استخدام الأطباق في غضون يومين، مع الحرص على عدم جفاف المنطقة المطلية. وعند الضرورة، يتم إضافة PBS للحفاظ على 50 µL من المحلول على الطبق.

تُعزل الخلايا المتعادلة لهذه الدراسة من دم المشاركين الذين قدموا موافقة مستنيرة مكتوبة. بعد جمع الدم عن طريق سحب الدم في أنبوب جمع دم يحتوي على مضاد للتخثر أو أنبوب تفريغ (vacutainer)، يتم تخفيف الدم بنسبة واحد إلى واحد باستخدام PBS لتنفيذ جميع الخطوات في هذا الإجراء. وفي درجة حرارة الغرفة، يتم تحضير طبقة فيزيكال (phy call) ثنائية لفصل الخلايا أحادية النواة في الدم المحيطي (p BMCs) والخلايا المتعادلة في أنابيب طرد مركزي سعة 50 ملليلتر.

أولاً، أضف 15 milliliters من PHI call الكثيف، ثم ضع بعناية 10 milliliters من fi call الخفيف في طبقة فوق fi call الكثيف. يجب أن يكون هناك حد فاصل واضح بين طبقتي fi call الخفيف وfi call الكثيف. وأخيراً، ضع بعناية 25 milliliters من عينة الدم المخففة في طبقة فوق fi call الخفيف دون تحريك PHI.

قم بطرد أنابيب الاختبار مركزياً لمدة 30 دقيقة في درجة حرارة الغرفة؛ بعد عملية الطرد المركزي، يجب أن تظهر طبقات متعددة. تقع طبقة الخلايا المتعادلة (neutrophil layer) التي تحتوي على عدد قليل من خلايا الدم الحمراء بين الطبقتين الفاتحة والثقيلة. باستخدام ماصة نقل، قم بجمع ونقل طبقة الخلايا المتعادلة إلى أنبوب جديد سعة 50 مل، ثم أضف PBS حتى يصل الحجم النهائي إلى 50 مل.

قم بإجراء عملية الطرد المركزي بسرعة 225 ×g لمدة 10 دقائق. عند درجة حرارة الغرفة بعد الطرد المركزي، قد تظل هناك خلايا دم حمراء مختلطة مع الخلايا المتعادلة. قم بشفط السائل الطافي حتى الوصول إلى مستوى 10 milliliter.

إعادة التعليق. قم بتعليق راسب الخلايا المتعادلة وكريات الدم الحمراء عن طريق الرج الدوامي لفترة وجيزة وبسرعة منخفضة، ثم اغسله مرة أخرى باستخدام 50 milliliters من PBS، وقم بسحب supernatant لإزالة كريات الدم الحمراء الملوثة. أعد تعليق الخلايا المترسبة في PBS المتبقي عن طريق الرج الدوامي لفترة وجيزة وبسرعة منخفضة.

أضف 25 milliliters من الماء وقم بالرج الميكانيكي (vortex) بلطف لمدة 10 seconds. لتحلل خلايا الدم الحمراء، أضف 25 milliliters من كلوريد الصوديوم بتركيز 1.8% واخلط فوراً عن طريق الطرد المركزي بسرعة 225 ×g لمدة 10 minutes.

يجب الآن تحليل خلايا الدم الحمراء الملوثة لترك راسب أبيض من الخلايا المتعادلة. اغسل راسب الخلايا المتعادلة باستخدام PBS، ثم تخلص من السائل الطافي وأعد تعليق الخلايا المتعادلة المعزولة في وسط RPMI مع 10%FBS. بعد تحديد تركيز الخلايا تحت المجهر الضوئي باستخدام مقياس كرات الدم (hemo cytometer)، اضبط كثافة الخلايا لتصبح 500, 000 cells per milliliter باستخدام وسط RPMI 10%FBS الكامل.

قبل البدء في مقايسة الالتصاق في غرفة التدفق، قم بتحفيز الخلايا البطانية الوريدية (VE) باستخدام 20 nanograms per milliliter من عامل نخر الورم α البشري (human TNF alpha) لمدة تتراوح من أربع إلى ست ساعات لزيادة تنظيم وتحفيز تعبير جزيئات الالتصاق. وعندما تصبح الخلايا البطانية الوريدية جاهزة، قم بتجميع غرفة التدفق. ضع الطبق الذي قطره 35 millimeter ويحتوي على الخلايا البطانية الوريدية الملتئمة على طاولة المجهر.

لأغراض هذا الفيديو، سيتم فحص التصاق الخلايا المتعادلة (neutrophil) بالبطانة الوعائية (VE) فقط، ولكن الإجراء نفسه ينطبق على دراسة التصاق الخلايا المتعادلة بجزيئات الالتصاق المنقاة. قم بتوصيل غرفة التدفق ذات الصفائح المتوازية بمضخة الحقنة ونظام التفريغ، واترك خطاً واحداً مفتوحاً لإدخال الخلايا المتعادلة. أدخل غرفة التدفق فوق الصفيحة وثبّت مجموعة غرفة التدفق. ابدأ برنامج تسجيل الفيديو على الكمبيوتر المتصل بالمجهر.

اضبط المجال وبؤرة المجهر حتى يظهر مجال واضح يحتوي على VE نمت بشكل كامل. باستخدام مضخة السرنجة، اشطف حجرة التدفق باستخدام وسط RPMI. تأكد من عدم وجود فقاعات هواء داخل الحجرة أو في خط إدخال الخلايا المتعادلة (neutrophil).

استخدم مضخة الحقن لحقن الخلايا المتعادلة (neutrophils) في غرفة التدفق بسرعات محددة. قم بتسجيل مقطع فيديو لأن التصاق الخلايا المتعادلة قد يحدث بسرعة، وعادة ما يكون مقطع فيديو مدته من أربع إلى خمس دقائق كافياً لتقدير أحداث الالتصاق كمياً من أجل التحليل. يوضح مقطع الفيديو هذا مثالاً لارتباط الخلايا المتعادلة بغرفة تدفق مطلية بـ HU E.

تُعرَّف الخلية الملتصقة بأنها الخلية التي تتحرك أقل من قطر خلية واحدة خلال خمس ثوانٍ على السطح المغطى بـ HU e. تظهر هنا لقطات شاشة من نقاط زمنية مختلفة لفيديوهات عينة لخلايا neutrophils تلتصق بسطح مغطى بـ ICAM one P selectin، أو سطح مغطى بـ uve.

في كلتا التجربتين، كانت سرعة تدفق الخلايا المتعادلة 350 microliters per minute بكثافة خلايا متعادلة تبلغ 500, 000 cells per milliliter. في الظروف النموذجية، لوحظ أن ما بين 50 إلى 70 من الخلايا المتعادلة البشرية التصقت بقوة بالرابط أو السطح المطلي بـ VE خلال فترة تسجيل استمرت أربع دقائق. ومع ذلك، فإن المتغيرات الأليلية لجزيئات التصاق الخلايا المتعادلة أو المتغيرات الأليلية في الركيزة يمكن أن تغير بشكل كبير من كمية التصاق الخلايا المتعادلة عند تسجيل مقاطع فيديو ذات طول مماثل من متبرعين مختلفين.

بالنسبة للخلايا المتعادلة (Neutrophils)، يمكن حساب عدد الخلايا الملتصقة في الدقيقة لمقارنة خصائص الالتصاق بين مختلف المتبرعين. وأثناء تنفيذ هذا الإجراء، من المهم تذكر الفحص البصري للخلايا المتعادلة للتأكد من عدم وجود تكتل خلوي ناتج عن تنشيط الخلايا المستحث بعملية العزل. بالإضافة إلى ذلك، يمكن إجراء تقييم متوازٍ باستخدام قياس التدفق الخلوي (flow cytometric assessment) لتنشيط الخلايا لضمان تطابق حالة تنشيط الخلايا بين المتبرعين وبين التجارب المختلفة.

مهدت هذه التقنية الطريق للباحثين في مجال المناعة الذاتية لاستكشاف التصاق الخلايا في الخلايا البشرية الأولية من متبرعين ذوي أنماط جينية تمتلك أليلات مختلفة في المنطقة المشفرة لسلسلة CD 11 B في الإنتغرين بيتا 2، MAC one. وقد سمحت هذه الدراسات بإجراء تقييم دقيق وكمي للتأثير الوظيفي لهذه المتغيرات الأليلية في النظام البشري.