غرفة تدفق العدلات الإنسان التصاق الفحص

وتفيد التقارير ان طريقة quantitating العدلات التصاق. هذا الأسلوب يخلق بيئة ديناميكية تدفق مماثلة لتلك التي واجهتها في أحد الاوعية الدموية. لأنها تتيح التحقيق في العدلات التصاق إما جزيئات الالتصاق المنقى (يجند) أو البطانية الركيزة الخلية (HUVEC) في سياق مماثل على البيئة في الجسم الحي مع الإجهاد الهائل.

الهدف العام من هذا الإجراء هو قياس التصاق شركة العدلات باستخدام مقايسة غرفة التدفق التي تسمح بالتصاق العدلات البشرية في وجود إجهاد القص. يتم تحقيق ذلك عن طريق تحضير ركيزة من جزيئات الالتصاق المنقاة أو سطح الخلية البطانية ، مثل الوريد السري البشري أو الخلايا البطانية أو الوريد. الخطوة الثانية هي فصل العدلات عن الدم المحيطي البشري باستخدام طريقة الطرد المركزي لاستدعاء PHI من طبقتين.

بعد ذلك ، يتم تجميع غرفة التدفق للسماح بحقن العدلات البشرية المعزولة تحت ضغط القص على ركيزة الالتصاق أو الروابط أو الوريد. الخطوة الأخيرة هي تسجيل أحداث التصاق العدلات في غرفة التدفق ، متبوعة بتقدير دقيق للالتصاق الثابت. في النهاية ، يتم استخدام مقايسة غرفة التدفق لإظهار التصاق قوي للعدلات تجاه جزيئات الالتصاق المنقاة وسطح HX.

يمكن أن تساعد هذه الطريقة في الإجابة على الأسئلة الرئيسية في مجال المناعة الذاتية ، مثل الأهمية الوظيفية للاختلافات الجينية في جزيئات الأنسجة المعروفة بأنها مرتبطة بتطور المناعة الذاتية. أظهرت الدراسات الجينية في المرضى الذين يعانون من تدلي الجفون الذئبي الحمامي الجهازي ارتباطا قويا بالمتغيرات و Abeta two integrin ، وهو بروتين يشارك في التصاق شركة العدلات. قمنا بتطوير نظام الفحص هذا لتقييم العواقب الوظيفية للتباين الجيني في هذا الغدد الصماء التجريبية الثانية المسماة Mac one على التصاق قوي لتحضير أطباق الثقافة لاستخدامها في غرفة التدفق.

أضف ملليلترا واحدا من محلول الفيبرين والجيلاتين إلى كل طبق ماصة وزراعة أنسجة مقاس 35 ملم عدة مرات للتأكد من طلاء سطح اللوحة بالكامل. قم بإزالة محلول الفيبرونيكتين والجيلاتين الزائد وجفف الأطباق بالهواء لمدة 30 دقيقة على الأقل. لتحسين تكوين مصفوفة البروتين ، قم بحصاد الخلايا البطانية للوريد السري البشري أو qve التي تمت زراعتها إلى 80 إلى 90٪ التقاء باستخدام بذور التربسين EDTA 500،000 خلية في كل طبق زراعة أنسجة مغطى.

أضف ملليلترين من وسط النمو إلى كل طبق واحتضانه عند 37 درجة مئوية. 5٪ CO2 يجب فحص الخلايا بصريا يوميا مع تغييرات متوسطة كل يومين. اسمح للخلايا بالنمو إلى 80 إلى 90٪ التقاء.

لبدء هذا الإجراء ، استخدم قلم تحديد أو قلما لرسم دائرة قطرها 0.5 سم في وسط صفيحة طبق زراعة الأنسجة 35 ملم. 20 ميكرولتر من 20 ميكروغرام لكل مليلتر بروتين ، محلول في المنطقة المحددة. استخدم طرف الماصة لنشر البروتين، وهو محلول لتغطية المنطقة بأكملها داخل دائرة قطرها 0.5 سم.

من المهم عدم لمس أو خدش سطح الطبق. احتضان أطباق زراعة الأنسجة عند 37 درجة مئوية لمدة ساعة واحدة. بعد ذلك ، اغسل كل بروتين بطبق مغلف ثلاث مرات بمليلتر واحد من PBS.

بعد إزالة PBS من لوحة الغسيل الثالثة ، 50 ميكرولتر من 1٪ BSA في المنطقة المحددة لمنع الربط غير المحدد على اللوحة. احتضان عند أربع درجات مئوية لمدة ساعتين. بعد ساعتين.

اغسل اللوحة المسدودة ثلاث مرات بمليلتر واحد من PBS. قم بإعداد محاليل البروتين الخيمري لمستقبلات الالتصاق FC للطلاء وسيتم استخدام هذه التجربة و ICAM واحد FC Kyra بمعدل 25 ميكروغرام لكل مليلتر و P selectin FC Kyra بمعدل 0.5 ميكروغرام لكل ملليلتر. قم بتغطية المنطقة المحددة ب 50 ميكرولترا من الركيزة ، واحتضن أطباق زراعة الأنسجة طوال الليل عند أربع درجات مئوية.

يجب استخدام الأطباق في غضون يومين ويجب عدم السماح للمنطقة المطلية بالجفاف. إذا لزم الأمر. أضف PBS للحفاظ على 50 ميكرولتر من المحلول على اللوحة.

يتم عزل العدلات لهذه الدراسة عن دم المشاركين الذين أعطوا موافقة خطية مستنيرة. بعد جمع الدم عن طريق الفصد في أنبوب جمع الدم المضاد للتخثر أو الفراغ ، قم بتخفيف الدم واحدا لواحد باستخدام PBS قم بتنفيذ جميع الخطوات في هذا الإجراء. في درجة حرارة الغرفة ، قم بإعداد مكالمة فيزيائية من طبقتين لفصل خلايا الدم المحيطية أحادية النواة أو p BMCs والعدلات في أنابيب طرد مركزي سعة 50 ملليلترا.

أولا ، أضف 15 مل من مكالمة PHI الثقيلة ثم قم بطبقة 10 مل من مكالمة fi الخفيفة بعناية فوق مكالمة fi الثقيلة. يجب أن يكون هناك حد حاد بين مكالمة fi الخفيفة وطبقات المكالمات الثقيلة. أخيرا ، ضع بعناية 25 مل من عينة الدم المخففة فوق مكالمة الضوء دون إزعاج PHI.

استدعاء الطرد المركزي الأنابيب لمدة 30 دقيقة في درجة حرارة الغرفة بعد الطرد المركزي ، يجب أن تكون هناك طبقات متعددة. تقع طبقة العدلات التي تحتوي على عدد قليل من خلايا الدم الحمراء بين الطبقة الخفيفة والثقيلة. اتصل باستخدام حصاد ماصة النقل وانقل طبقة العدلات إلى أنبوب جديد سعة 50 مليلتر وأضف PBS إلى الحجم النهائي البالغ 50 ملليلترا.

جهاز طرد مركزي عند 225 مرة G لمدة 10 دقائق. في درجة حرارة الغرفة بعد الطرد المركزي ، قد لا تزال هناك خلايا دم حمراء ممزوجة بالعدلات. استنشق المادة الطافية حتى 10 ملليلتر.

مارك ريسوس. قم بتعليق حبيبات خلايا الدم الحمراء العدلات لفترة وجيزة ، ودوامة بسرعة منخفضة ثم اغسلها مرة أخرى باستخدام 50 مل من PBS لشفط المادة الطافية لإزالة خلايا الدم الحمراء الملوثة. أعد تعليق الخلايا المحببة في PBS المتبقي بواسطة دوامة قصيرة منخفضة السرعة.

أضف 25 مل من الماء ودوامة برفق لمدة 10 ثوان. للقمل. تضيف خلايا الدم الحمراء 25 مل من كلوريد الصوديوم 1.8٪ وتخلط على الفور عن طريق الطرد المركزي عند 225 مرة G لمدة 10 دقائق.

يجب الآن أن تكذب خلايا الدم الحمراء الملوثة تاركة حبيبات خلية العدلات البيضاء. اغسل حبيبات خلية العدلات باستخدام PBS ، وتخلص من المادة الطافية وأعد تعليق العدلات المعزولة في وسط RPMI باستخدام 10٪ FBS. بعد تحديد تركيز الخلية تحت مجهر ضوئي باستخدام مقياس الخلوي الدموي ، اضبط كثافة الخلية على 500 ، 000 خلية لكل مليلتر مع وسيط RPMI كامل 10٪ FBS.

قبل البدء في مقايسة التصاق غرفة التدفق ، قم بتجهيز VE ب 20 نانوغرام لكل ملليلتر من عامل نخر الورم البشري ألفا لمدة أربع إلى ست ساعات لتنظيم وتحفيز التعبير عن جزيء الالتصاق. عندما يكون VE جاهزا ، قم بتجميع غرفة التدفق. ضع الطبق مقاس 35 ملم الذي يحتوي على VE المتقارب على طاولة المجهر.

لأغراض هذا الفيديو ، سيتم فحص التصاق العدلات فقط ب VE ، ولكن نفس الإجراء ينطبق على دراسة التصاق العدلات بجزيئات الالتصاق النقية التي تربط غرفة تدفق اللوحة المتوازية بمضخة الحقنة ونظام التفريغ وتترك سطرا واحدا مفتوحا لإدخال العدلات. أدخل غرفة التدفق أعلى اللوحة واربط مجموعة غرفة التدفق. ابدأ تشغيل برنامج تسجيل الفيديو على الكمبيوتر المتصل بالمجهر.

اضبط مجال المجهر وتركيزه حتى يظهر مجال واضح مع التطرف العنيف كامل النمو. باستخدام مضخة الحقنة ، اشطف غرفة التدفق بوسط RPMI. تأكد من عدم وجود فقاعات هواء داخل الغرفة أو خط إدخال العدلات.

استخدم مضخة الحقنة لحقن العدلات في غرفة التدفق بسرعات محددة. سجل الفيديو لأن التصاق العدلات يمكن أن يحدث بسرعة ، وعادة ما يكون الفيديو من أربع إلى خمس دقائق كافيا لتحديد أحداث الالتصاق للتحليل. يعرض مقطع الفيديو هذا مثالا على ارتباط العدلات بغرفة التدفق المطلية ب HU E.

تعرف الخلية الملتصقة بأنها خلية تتحرك أقل من قطر خلية واحدة في غضون خمس ثوان. على سطح المغلفة HU e. تظهر هنا لقطات شاشة في نقاط زمنية مختلفة من عينة من مقاطع الفيديو للعدلات التي تلتصق بسطح مطلي ب ICAM واحد P selectin ، أو سطح مطلي ب uve.

في كلتا التجربتين ، تبلغ سرعة تدفق العدلات 350 ميكرولتر في الدقيقة مع كثافة عدلات تبلغ 500،000 خلية لكل مليلتر. في ظل الظروف النموذجية ، لوحظ أن 50 إلى 70 عدلة بشرية تلتصقت بقوة بالسطح المطلي بالترابط أو VE خلال فترة تسجيل مدتها أربع دقائق. ومع ذلك ، فإن المتغيرات الأليلية لجزيئات التصاق العدلات أو المتغيرات الأليلية في الركيزة يمكن أن تغير بشكل كبير الالتصاق الكمي للعدلات عن طريق تسجيل مقاطع فيديو متشابهة الطول مع متبرعين مختلفين.

العدلات ، يمكن حساب عدد خلايا الالتصاق في الدقيقة لمقارنة خصائص الالتصاق بين المتبرعين المختلفين. أثناء محاولة هذا الإجراء ، من المهم أن تتذكر فحص العدلات بصريا بحثا عن لقط الخلايا الناجم عن تنشيط الخلية الناجم عن العزلة. بالإضافة إلى ذلك ، يمكن إجراء تقييم التدفق الخلوي المتوازي لتنشيط الخلية لضمان مطابقة حالة تنشيط الخلايا بين المتبرعين وبين التجارب.

مهدت هذه التقنية الطريق للباحثين في مجال المناعة الذاتية لاستكشاف التصاق الخلايا في الخلايا البشرية الأولية من المتبرعين بالنمط الجيني الذين لديهم أليلات منطقة ترميز مختلفة لسلسلة CD 11 B من بيتا اثنين من الإنتجرين ، MAC واحد. سمحت هذه الدراسات بإجراء تقييم دقيق وكمي للتأثير الوظيفي لهذه المتغيرات الأليلية في النظام البشري.