تفعيل مراقبة من نمط المضادة للفيروسات الاعتراف المستقبلات RIG-I وPKR بواسطة البروتياز المحدودة الهضم وPAGE الأصلية

يتم تحفيز الدفاعات الفطرية ضد العدوى الفيروسية بواسطة مستقبلات التعرف على الأنماط أو prrs، والتي تتواجد في خلايا الجهاز المناعي الفطري أثناء العدوى. ترتبط مستقبلات التعرف على الأنماط السيتوبلازمية rig eye وPKR بجزيئات RNA ذات التوقيع الفيروسي، مما يؤدي إلى تغيير شكلها الفراغي وتنشيط إشارات مضادة للفيروسات. لمراقبة التغييرات الشكلية في rig eye وPKR وارتباطها بالليجاند في المختبر، يتم إصابة خلايا A 5 49 البشرية بفيروس حمى الوادي المتصدع.

استخدام المستنسخ 13 لتحفيز تنشيط PRR. بعد ذلك، يتم تحضير نواتج تحلل الخلايا لكل من الخلايا الضابطة والخلايا المصابة لتحليل التغيرات التشكلية في rig eye وPKR. ثم يُجرى هضم محدود باستخدام التربسين.

إذا حدثت تغيرات تشكيلية في بنية البروتين، يصبح البروتين أكثر مقاومة للهضم وتظهر حزم عند إجراء تحليل Western blotting لتحليل تكوين معقدات allgas native page متبوعاً بتحليل Western blotting. وفي حالة حدوث الربط الكامل، تظهر معقدات all liga rig eye و PKR ذات وزن جزيئي أعلى. وتتمثل الميزة الرئيسية للهضم المحدود باستخدام البروتياز وتقنية native page في أن هذه التقنيات تسهل القياس المباشر لتنشيط rega و PKR.

يمكن لهذه الطرق أن تساعد في الإجابة على أسئلة جوهرية في مجال المناعة الفطرية، مثل الطبيعة الدقيقة وأصل أنواع RNA ذات الصلة بتنشيط rig eye وPKR. كما يمكن لهذه الطرق توفير رؤى حول محفزات rig eye وPKR. ويمكن تطبيقها أيضاً على بروتينات استشعار سيتوبلازمية أخرى مثل MDA five، وسوف تقوم Mila Viva، طالبة الدكتوراه في مختبري، بتوضيح هذا الإجراء قبل البدء فيه.

يرجى ملاحظة أن سلالة فيروس حمى الوادي المتصدع clone 13، والمشار إليها فيما يلي باسم CL 13، هي طفرة فيروسية مضعفة، ويجب التعامل معها في ألمانيا وفقاً لشروط المستوى الثاني من السلامة البيولوجية BSL two. لتسخين وسط PBS الخالي من المصل ووسط زراعة الخلايا الذي يحتوي على 5%FCS مسبقاً، يوضع كلاهما في حمام مائي داخل أنبوب طرد مركزي دقيق سعة 1.5 milliliter. يتم تحضير تركيز 1.25 times 10 to the seventh PFU per milliliter من CL 13 في وسط خالٍ من المصل لإصابة 2.5 times 10 to the sixth.

قم بإصابة خلايا A 5 49 بتعددية عدوى (MOI) تبلغ 5، مع تحضير كمية تزيد بنحو 10% عن الكمية المطلوبة لتعويض أخطاء الماصة. أخرج خلايا A 5 49 من الحاضنة، وقم بشفط الوسط المزرعي وأضف 10 milliliters من PBS، ثم قم بتدوير قارورة المزرعة أو إمالتها لغسل الخلايا، وبعد ذلك تخلص من PBS. بعد ذلك، أضف 1 milliliter من CL 13 المخفف، أو استخدم التحكم غير المصاب في حالة العدوى الوهمية (mock infection).

أضف 1 mL من الوسط الخالي من المصل وحضن العينات لمدة ساعة واحدة مع الرج كل 15 دقيقة. أمل القارورة بعناية لضمان التوزيع المتساوي للوسط. بعد ساعة واحدة من العدوى، قم بإزالة اللقاح.

أضف خمسة ملليلترات من وسط زراعة الخلايا المُسخن مسبقاً والمحتوي على 5% FCS، ثم قم بالتحضين لمدة خمس ساعات. جهز محلول PBS مع 0.5%tritton X 100 وضعه في درجة حرارة أربع درجات مئوية. لا تضف مثبطات Syrian protease.

بعد ذلك، اغسل الخلايا بمحلول PBS البارد وأضف 10 milliliters من محلول PBS الطازج. ثم باستخدام كاشطة الخلايا، قم بفصل الخلايا عن الطبق. انقل معلق الخلايا إلى أنبوب مخروطي سعة 15 milliliter وقم بالطرد المركزي بسرعة 800 ×g لمدة خمس دقائق في درجة حرارة الغرفة.

بعد عملية الطرد المركزي، قم بإزالة الطافي وأعد تعليق كتلة الخلايا في 30 µL من PBS مع 0.5% Triton X 100. انقل المُحلل إلى أنبوب جديد سعة 1.5 mL واتركه في الحاضنة لمدة 10 دقائق على الأقل فوق الثلج. ثم قم بطرد المُحلل مركزياً عند 10,000 ×g لمدة 10 دقائق عند درجة حرارة 4 °C.

بعد عملية الطرد المركزي، انقل مستخلص الخلايا المصفى إلى أنبوب جديد. قم بإجراء مقايسة برادفورد (Bradford assay) لتحديد تركيز البروتين في مستخلص الخلايا المصفى. يُحفظ في درجة حرارة 20- درجة مئوية أو يتم البدء فوراً في عملية الهضم أو الفصل الكهربائي للهلام الأصلي (native PAGE) لفحص التغيرات التشكلية لمستقبلات التعرف على الأنماط. أولاً، قم بتخفيف TPCK trypsin أو TPCK-treated trypsin في محلول PBS إلى تركيز عمل نهائي قدره 2 µg/mL في أنبوبين جديدين لكل حالة. قم بضبط التركيز النهائي للبروتين في مستخلصات CL 13 والبروتينات الضابطة غير المصابة ليكون 25 µg في حجم نهائي قدره 9 µL باستخدام PBS. ستُستخدم مجموعة واحدة من المستخلصات كعينة ضابطة للمدخلات (input control)، بينما تُعالج المجموعة الأخرى بـ TPCK trypsin. أما في أنابيب العينة الضابطة غير المعالجة، فأضف 1 µL من محلول PBS إلى الأنبوبين المتبقيين.

أضف 1 µL من TPCK trypsin بتركيز 2 µg/µL لتصل التركيز النهائي إلى 0.2 µg/µL. اخلط التفاعلات باستخدام الماصة. حضن المحللات عند 37 °C لمدة 25 دقيقة.

أوقف التفاعل بإضافة خمسة أضعاف من محلول عازل العينات الممسخ (denaturing sample buffer)، ثم الغلي لمدة خمس دقائق عند 95 درجة Celsius. من المهم عدم تمديد وقت تحضين التريبسين. يرجى ملاحظة أن التوقيت الدقيق لهضم التريبسين أمر بالغ الأهمية للكشف عن الشظايا المقاومة دون وجود أي خلفية؛ فإذا لم يتم الكشف عن البروتينات المقاومة أو إذا تم الكشف عن عدد كبير جداً منها، يتم تعديل مدة الهضم وفقاً لذلك.

بعد الغليان، تُحفظ العينات عند درجة حرارة -20 °C أو يتم تحميل العينات على هلامين من بولي أكريلاميد وكبريتات دوديسيل الصوديوم (SDS-PAGE)، يتكون كل منهما من هلام تجميع (stacking gel) بنسبة 5% فوق هلام فصل (resolving gel) بنسبة 12%. يتم فصل البروتينات بتيار شدته 25 mA لكل هلام حتى يصل لون صبغة بروموفينول الأزرق (bromo phenol blue) إلى النهاية.

بعد تشغيل هلامات الفصل الكهربائي، يتم نقل البروتينات من أحد الهلامات إلى غشاء بولي فينيل فلورايد وتحليلها بواسطة تقنية اللطخة الغربية (western blotting) باستخدام أجسام مضادة موجهة ضد RIG-I وPKR، ويُصبغ الهلام الآخر بصبغة Coomassie brilliant blue G-250. بعد ذلك، يُحفظ الهلام في محلول مكون من 25% ethanol و8% acetic acid و4% glycerol عند درجة حرارة 4 °C أو يتم الانتقال إلى إجراء التصوير والتحليل. ولتحليل حالات التجمع القليلي (oligomeric states) لمستقبلات التعرف على الأنماط، يتم تحضير 50 µg من مستخلص الخلايا في حجم نهائي قدره 10 µL باستخدام PBS، ويُضاف منظم عينات بتركيز 5x ليصل التركيز النهائي إلى 1x.

قم بتحميل العينات فوراً على هلام بولي أكريلاميد طبيعي (native poly acrylamide gel) يحتوي على هلام تجميع (stacking gel) بنسبة 5% وهلام فصل (resolving gel) بنسبة 8%. حيث سيؤدي أي تأخير إلى فقدان المعقدات الطبيعية. قم بتشغيل الهلام بتيار قدره 20 milliamps لكل هلام عند درجة حرارة أربع درجات Celsius.

أوقف عملية الرحلان الكهربائي بعد 45 دقيقة من خروج حزمة Bromo phenol blue من الهلام، وذلك بعد مرور ما مجموعه من 1.5 إلى ساعتين تقريباً. قم بإجراء تحليل Western blotting باستخدام أجسام مضادة موجهة ضد rig eye و PKR كما هو موضح في المستند المرفق لفحص التبديل التشكيلي والتحفيز بـ oligo الناتج عن تعرف rig eye أو PKR على ناهض فيروسي. تم إجراء هضم محدود بالبروتياز و native page كما هو موضح في هذا الفيديو؛ حيث أدى هضم مستخلصات الخلايا المصابة وهمياً (mock) باستخدام التريبسين إلى تحلل سريع لـ rig eye، بينما أدت العدوى بـ clone 13 إلى توليد قطعة مقاومة من rig eye بحجم 30 kilodalton. كما يظهر PKR مقاومة جزئية لهضم التريبسين في العينات المصابة، وهو ما يتزامن مع فسفرته. ولمراقبة كفاءة وخصوصية هضم التريبسين، صُبغت الهلامات بـ kumasi brilliant blue G two 50. تظهر العينات غير المعالجة كميات متساوية من البروتينات المحملة، ويؤدي إخضاع مستخلصات خلايا mock و C 13 لهضم التريبسين إلى انخفاض مماثل في كميات البروتين الكلية.

يوضح هذا أن المعالجة بـ tripsin تمتلك الكفاءة ذاتها لكل من العينات الضابطة (mock) والعينات المصابة بـ CL 13 في الخلايا غير المصابة. وكإجراء رقابة إضافي، تم الكشف عن المونومرات الخاصة بـ R EYE و PKR فقط. كما تم إدراج عامل النسخ IRF three، والذي يتواجد في شكل مونومر، ولكن من المعروف أنه يتكون كدايمر عند التنشيط عبر R Eye.

تؤدي عدوى المستنسخ 13 (Clone 13) إلى تراكم قوي للمعقدات قليلة القسيمات لـ rig eye على شكل لطخة (smear)، ولثنائيات أو قليلة قسيمات PKR و IRF three على شكل حزمة بروتينية محددة. وتثبت هذه النتائج أن تقنيات الهضم المحدود والترحيل الكهربائي في ظروف طبيعية (native page) هي أدوات مفيدة لمراقبة التغيرات التشكلية وتكوين قليلات القسيمات لـ rig eye و PKR عند حدوث العدوى. بعد مشاهدة هذا الفيديو، يجب أن يكون لديك فهم جيد لكيفية مراقبة تحول التشكيل والتبلمر لـ WIC eye و PKR بمجرد إتقان هذه التقنيات.

يمكن تنفيذ هذه التقنية في يومين باتباع هذا الإجراء. كما يمكن إجراء اختبارات مماثلة لاختبارات pro للإجابة على أسئلة إضافية، مثل ما إذا كان هناك تفاعل مستقر مع الليجاند المحفز بعد تطويره. وقد مهدت هذه التقنية الطريق للباحثين في مجال المناعة الفطرية لاستكشاف حالة تنشيط مستقبلات التعرف على الأنماط في الخلايا المحفزة فيروسياً.