A منصة رواية تمتد للتطبيقات في الخلايا والأنسجة Mechanobiology

الهدف العام من هذا الإجراء هو إثبات حداثة منصة تمدد متناحية، يمكن استخدامها للتحقيق في استجابات الخلية المفردة للتشوه الميكانيكي المعقد وتحديد الخواص الميكانيكية للأنسجة البيولوجية. يتم تحقيق ذلك عن طريق تصنيع الغشاء المرن أولا وتركيب هذا الغشاء على مجموعة من المشابك. الخطوة الثانية هي زراعة خلايا C اثنين من خلايا C 12 على الغشاء طوال الليل ، وفي اليوم التالي ، قم بتركيب المشابك على منصة التمدد.

بعد ذلك ، في مجموعة ثانية من التجارب ، يتم رفض أنسجة الأبهر الصدري من نموذج الفأر وتنظيفها من أي أنسجة ضامة. ثم يتم تثبيت الأنسجة الأبهرية على منصة التمدد باستخدام مجموعة مختلفة من المشابك. في النهاية ، يتم استخدام منصة التمدد لإحداث تشوه في الخلايا على طول اتجاهين متعامدين يمكن قياسهما باستخدام مجهر مقلوب.

أو بدلا من ذلك ، يتم دمج محول القوة في جهاز التمدد لقياس تصلب الأنسجة. الميزة الرئيسية لهذه التقنية على التقنيات الحالية ، مثل تمدد الخلايا أحادية الفعلية أو ثنائية المحور ، هي أنها تسمح لنا بالتحكم بشكل مستقل في التشوه في اتجاهين متعامدين في غشاء شفاف ترتبط به الخلايا ، وبالتالي السماح بتصوير الخلايا الحية. الفحص المجهري أيضا تصميم دقيق لمجموعة مختلفة من المشابك.

مع دمج مستخدم رباعي السلاسل على النظام الأساسي ، يسمح لنا بإجراء 10 اختبارات خلايا على الأنسجة البيولوجية لتقدير خصائصها الميكانيكية. يعرض هذا الفيديو منصة التمدد ثنائية المحور ، وهي جهاز مصمم خصيصا يمكن استخدامه للتحقيق في تأثير تشوه الركيزة على المستوى الخلوي ، وإجراء اختبارات الشد على الأنسجة البيولوجية. تم تفصيل تصميم وميزات منصة التمدد ثنائية المحور في المخطوطة المصاحبة للتحقيق في تأثير التشوه الميكانيكي للخلايا المفردة ، ويجب أولا تصنيع ركيزة مرنة وشفافة يمكن أن تلتصق بها الخلايا.

لبدء هذا الإجراء ، قم بتقطيع الماصة 500 ميكرولتر من محلول الكرة المجهرية الفلورية في أنبوب طرد مركزي دقيق سعة 1.5 ملليلتر وجهاز طرد مركزي عند 16 ، 200 جي ثانية لمدة 10 دقائق ، تخلص من السوبر وأضف 500 ميكرولتر من الأيزوبروبانول ، متبوعا بخمس دقائق من الدوامة. ضع القارورة جانبا طوال الليل في الظلام للسماح لأي مجاميع جسيمات كبيرة بالترسيب في صباح اليوم التالي ، انقل SNAT بعناية إلى قارورة طرد مركزي دقيقة نظيفة. يمكن استخدام محلول الخرزة هذا لتصنيع أكثر من خمس ركائز لأن محلول الخرزة سيستمر في الترسيب خلال الأيام الثلاثة المقبلة.

من المهم تجنب تعليق Resus للحبيبات. صب 0.5 جرام من عامل المعالجة المزود مع مجموعة PDMS في قارورة طرد مركزي دقيقة سعة 1.5 ملليلتر. أضف 15 ميكرولترا من حبات الفلورسنت والدوامة لمدة دقيقة واحدة.

كرر هذا خمس مرات أخرى لإضافة ما مجموعه 90 ميكرولتر من الخرز اتركه جانبا. وزن 10 جرامات من PDMS أضف 0.5 جرام من عامل المعالجة ، مع استكمال حبات الفلورسنت واخلطها لمدة 12 دقيقة على الأقل. بعد ذلك ، استخدم ماصة النقل لنقل أربعة ملليغرامات من PDMS مع الخرز إلى قالب SUH 2050 على شكل متقاطع تم تصنيعه مسبقا باستخدام تقنيات الطباعة الحجرية الضوئية القياسية.

ارتفاع القالب 320 ميكرومتر ومساحة 13.4 سم مربع ويمكن أن يحتوي على 428 ميكرولتر أو 440 ملليغرام من PDMS لمعالجة PDMS لمدة ساعتين عند 80 درجة مئوية. بعد معالجة قشر الركيزة من القالب ، يمكن حفظ الركيزة في طبق بتري في درجة حرارة الغرفة لمدة أسبوعين دون إظهار تغييرات كبيرة وخصائصها الميكانيكية. صب قطرات من PDMS في طبق بتري بحجم نهائي يبلغ قطره حوالي أربعة ملليمترات ، وقم بمعالجتها رأسا على عقب لمدة ساعتين عند 80 درجة مئوية ، ويجب الحفاظ على الطبق رأسا على عقب لمنع القطرات من التسطيح أثناء عملية المعالجة.

يمكن الاحتفاظ بميزات التثبيت هذه في طبق بتري لأسابيع. تعالج بلازما الهواء الركيزة وثماني ميزات تثبيت ، وتربط الميزات الموجودة على كل طرف من طرفي الركيزة على مسافة أربعة ملليمترات من المسافة البادئة المربعة الموجودة على الركيزة لتركيب الغشاء على المشابك. لف كل طرف من طرفي الركيزة حول الجزء الأسطواني من الأخدود من المشابك ، وثبته في مكانه باستخدام المسماري المثبتين من الأعلى.

برغي المشابك الأربعة على حامل المشبك. ثم صب PDMS في الواجهة بين الركيزة والجزء المحزز من المشابك. انشر PDMS غير المعالج حول الجزء الأسطواني المحزز باستخدام مفتاح سداسي 1.5 ملم.

صب PDMS في الأخاديد حتى تمتلئ بالكامل بعمل الشعيرات الدموية وتعالج التجمع عند 80 درجة مئوية لمدة ساعتين قبل زرع الخلايا على الغشاء. بلازما الهواء. عالج المجموعة بأكملها لتعقيم الركيزة وتشغيلها للسماح بطلاء الكولاجين.

قم بتشغيل مساحة الركيزة حيث سيتم زرع الخلايا بمليلتر واحد من حمض الخليك المولي 0.02 مع 16 ميكروغرام لكل مليلتر من كولاجين ذيل الفئران في درجة حرارة الغرفة لمدة ساعة واحدة. كثافة الكولاجين النهائية المطلوبة هي خمسة ميكروغرام لكل سنتيمتر مربع بعد ساعة واحدة ، اشطف الركيزة ثلاث مرات باستخدام عازلة الفوسفات واتركها تجف في درجة حرارة الغرفة لمدة 10 دقائق على الأقل. أضف 40 ميكرولتر من وسط الاستزراع ، مع 10٪ مصل بقري للجنين و 1٪ بنسلين.

الستربتومايسين على 2000 خلية في الجزء الأوسط من الركيزة لتغطية مساحة سنتيمتر مربع واحد. في هذا المثال، تبلغ كثافة الخلية 20 خلية لكل سنتيمتر مربع. ومع ذلك ، يمكن تغيير كثافة الخلايا وفقا للمتطلبات التجريبية.

ضع المجموعة بأكملها في حاضنة زراعة خلية قياسية بحيث تكون الركيزة متجهة لأعلى مع قطرة وسط الثقافة التي تحتوي على خلايا عليها. يجب أن تبقى التجميع مع توجيه الركيزة لأعلى لمدة ثلاث ساعات على الأقل للسماح للخلايا بالالتصاق بها بإحكام لمنع التبخر. يضاف 30 ميكرولتر من وسط الاستزراع الدافئ إلى القطرة الموجودة على الركيزة.

كل 45 دقيقة بعد ثلاث ساعات ، اقلب المجموعة بأكملها في طبق بتري مليء بوسط استزراع طازج لغمر الركيزة المحتضنة طوال الليل للسماح للخلايا بالتكاثر في اليوم التالي. قم بتركيب الإعداد على تباين الطور المقلوب أو مجهر الفلورسنت. قم بتركيب مجموعة ركيزة المشبك على منصة التمدد ثنائية المحور ، وتملأ المحركات طبق بتري داخل سخان أطباق بتري بمحلول ملح مخزن حديثا من HEPs.

يستخدم هذا الحل الفسيولوجي للحفاظ على الخلايا في مرحلة المجهر عن طريق محاكاة بيئة دم الأنسجة الطبيعية. يمكن أيضا استخدام نفس منصة التمدد ثنائية المحور لتحديد صلابة عينات الأنسجة الصغيرة. سيتم استخدام الشريان الأورطي المعزول للفأر في هذا العرض التوضيحي.

قم بإزالة الحجاب الحاجز والقفص الصدري وفصوص الرئة من الفأر القتل رحيم لتقليل مخاطر إتلاف الأنسجة. حافظ على ارتباط القلب بالشريان الأورطي وتجنب لمس الوعاء الدموي مباشرة ولكن يتم التلاعب به. باستخدام القلب.

قم بإزالة القلب وجذر الأبهر والشريان الأورطي الصدري عن طريق القطع برفق بين الوعاء الدموي والعمود الفقري للحفاظ على البنية الداخلية للأنسجة سليمة. احرص على عدم إحداث أي استطالة في الوعاء أثناء الشق. اغمر القلب والشريان الأورطي على الفور واحتفظ بهما في محلول كريبس ، الذي يتم تحضيره يوميا والاحتفاظ به عند 37 درجة مئوية أثناء التجارب.

قص الشريان الأورطي وغسله بعناية في محلول كريبس لإزالة أي جلطات دموية تعمل تحت مجهر التشريح الجراحي. قم بإزالة النسيج الضام باستخدام مقص صغير وملاقط. من المهم الحفاظ على طول الوعاء الدموي بالكامل واستخدام جذر الأبهر لتحديد اتجاه الوعاء.

السفينة المفرغة مطلوبة لتحديد صلابة السفينة. قم بقص حلقة أورطي يبلغ طولها حوالي ملليمترين وقم بقياس طولها بدقة باستخدام إعداد مجهر معاير. ضع هذا الجزء جانبا في حل كريب.

بعد ذلك ، قم بقطع حلقتين صغيرتين من الأبهر من أقسام الشريان الأورطي المتبقية بعد إزالة الجزء المليمتري. حلقة واحدة من قسم الشريان الأورطي قبل الجزء المكون من ملليمترين ، وحلقة أخرى من قسم الشريان الأورطي. بعد الجزء المليمترين ، ضع حلقتي الأبهر على شريحة زجاجية مجهرية بحيث يكون التجويف متجها لأعلى وقم بقياس سمك الجدار باستخدام إعداد مجهر معاير.

يتم قياس سمك جدار الأبهر وحسابه باستخدام هاتين الحلتين. املأ طبق بتري على منصة التمدد ثنائية المحور بمحلول كريبس وأدخل الجزء الدائري الأورطي المليمتري على دبابيس السحب. في هذا البروتوكول ، تم استخدام منصة التمدد ثنائية المحور للتحقيق في الاستجابة الميكانيكية للنواة في خلايا الأرومة العضلية المفردة المعرضة لتشوه الركيزة بنسبة 25٪ من تشوه الإزاحة.

تظهر العلاقات من أداء التمدد المحوري الأحادي القياسي والنقي في هذه النتائج التمثيلية. يتم تحديد حبات الفلورسنت يدويا في الإطار الأول من الفيديو وتتبعها من إطار إلى آخر حتى يتم الوصول إلى الحد الأقصى للتمدد على طول الاتجاهين الأفقي والرأسي. يقوم البرنامج النصي MATLAB تلقائيا بحساب مكونات موتر الإجهاد الأخضر لكل إطار ، وينتج منحنى معايرة للإجهاد فيما يتعلق بإزاحة المحرك.

في هذه الرسوم البيانية ، يتوافق الخطان الأزرق والأحمر مع مكون الثقيل الأخضر المجهد على طول الاتجاهين الأفقي والرأسي على التوالي. توضح هذه النتائج قدرات منصة التمدد ثنائية المحور لإحداث تشوه في الركيزة على طول اتجاهين متعامدين. بالإضافة إلى المحور الأحادي القياسي لحقول الإجهاد ثنائية المحور EQU ، يمكن لمنصة التمدد ثنائية المحور أن تحفز حقول إجهاد معقدة في الركيزة.

توضح اللوحة G أن تمديد نفس الركيزة بمقدار أربعة ملليمترات على طول المحور x وتمتد قليلا على طول المحور Y بمقدار 1.5 ملم مظللة باللون الأحمر ، ينتج مجالا محوريا أحادي نقيا بدون تشوه انضغاطي في الركيزة. توضح اللوحة ، H أن تمديد الركيزة على طول المحور x بمقدار 3.5 ملم ينتج عنه تشوه بنسبة 25٪ وتشوه انضغاطي بنسبة 7٪ عندما يتم تثبيت نهايات الركيزة على طول المحور الرأسي ، مظللة باللون الأحمر مع القدرة على إجراء تصوير مجهري للخلايا الحية أثناء تمدد النوى تم تلطيخها بصبغة فلورية للخلية الحية تربط الحمض النووي ثم تمتد بنسبة 25٪ على طول كل محور تمدد متعامد مثل موضحة هنا بين كل مرحلة من مراحل دورة التمدد ، تم الحصول على صور تباين وصور فلورسنت epi للنواة غير المشكلة والمشوهة. تم تحديد أطوال المحور النووي الرئيسي والصغير على طول الحالة غير المشكلة وعندما تم تمديد النواة بالتتابع على طول محورها الرئيسي والثانوي باستخدام المكون الإضافي للصورة J واستخدامها لحساب التغيير النسبي في الطول.

على طول كل محور في هذا الرسم البياني الشريطي ، يظهر X أو المحور الرئيسي باللون الأزرق ، ويظهر المحور y أو الصغير باللون الأحمر. تظهر قدرة التشوه للنواة تباين ميكانيكي حيث تظهر قدرة تشوه أعلى بكثير على طول محورها الثانوي ، بالمقارنة مع محورها الرئيسي ، تم فحص دور الهيكل الخلوي للأكتين والأنابيب الدقيقة في تنظيم قدرة التشوه النووي عن طريق إزالة البلمرة ، خيوط الأكتين أو الأنابيب الدقيقة بشكل انتقائي باستخدام cyto D و neol على التوالي إزالة البلمرة. تم العثور على خيوط الأكتين أو الأنابيب الدقيقة للحث على فقدان قابلية تشكيل النواة متباينة الخواص.

تدعم هذه النتائج النتائج التي تفيد بأن مكونات الهيكل الخلوي تنقل القوى إلى النواة من الركيزة وهي ضرورية أيضا للحفاظ على السلوك الميكانيكي الطبيعي للنواة. أثناء التشوه ، تم استخدام منصة التمدد ثنائية المحور أيضا لتقييم تأثير الإفراط المزمن في التعبير عن بروتين الصدمة الحرارية 27 أو HP 27 على تصلب الوعاء HSP على التعبير. في نموذج الفأر المعرض لتصلب الشرايين ، يعدل POE السلبي متماثل اللواقح التركيب النسيجي لآفات تصلب الشرايين عن طريق زيادة خلايا العضلات الملساء الحميمة ومحتوى الكولاجين.

لتحديد تأثير إعادة التشكيل النسيجي هذه على الخصائص الميكانيكية للوعاء ، تم استخدام منصة التمدد لقياس صلابة الأبهر. يوضح هذا الرسم البياني منحنى إجهاد إجهاد نموذجي تم الحصول عليه من شد وعاء أورطي بينما يتم حساب الصلابة عند 30٪ من الإجهاد. الصلابة هي ميل الظل المشار إليه بالخط الأحمر للمنحنى.

وجد أن صلابة الأجزاء الأبهرية من HSP 27 على الفئران المعبرة قد زادت بشكل ملحوظ بنسبة 41٪ مقارنة بنموذج الفأر الضابط. أظهر التقييم الميكانيكي جنبا إلى جنب مع أنسجة الأوعية الدموية والبلاك أن الإفراط في التعبير عن HSP 27 يتميز بزيادة تصلب الأوعية الدموية ومحتوى خلايا العضلات الملساء بالكولاجين. تشير هذه النتائج إلى أن HSP 27 يمكن أن يزيد من استقرار آفات تصلب الشرايين وبالتالي يقلل من خطر تمزق البلاك بعد تطوره.

تدفع هذه التقنية طريقة جديدة للباحث في مجال الهندسة الحيوية لاستكشاف استجابة الخلية للتشوه الميكانيكي المعقد والتقلص العضلي للتطبيقات في البيولوجيا الميكانيكية ، ولكن أيضا لمراقبة ميكانيكا الأنسجة البيولوجية في المرض.