التنميط الجزيئي للالمكروية ورم الغازية في نموذج 3 الأبعاد للخلايا سرطان القولون والمستقيم و

الهدف العام من هذا الإجراء هو توصيف البيولوجيا المميزة عند الواجهة الفاصلة بين الخلايا الظهارية الخبيثة في الجبهة الورمية الغازية والخلايا السدوية المرتبطة بالسرطان. يتم تحقيق ذلك أولاً من خلال إنشاء مستنبتات أولية للأرومات الليفية من غرسات قولونية. والخطوة الثانية هي بناء نماذج استنبات مشترك نمطية عضوية باستخدام أرومات ليفية قولونية أولية وخلايا سرطان قولون ومستقيم مستنبتة.

بعد ذلك، يتم تثبيت النماذج العضوية النمطية وتقطيعها إلى مقاطع ووضعها على شرائح مثبتة على أغشية، ثم تُصبغ بصبغة البنفسج البلوري. وتتمثل الخطوة النهائية في التشريح المجهري بالليزر من أجل فصل الخلايا الورمية الغازية عن الخلايا الورمية غير الغازية والخلايا السدوية المرتبطة بالسرطان. وفي النهاية، يمكن استخدام تقنيات التنميط الجزيئي لتوصيف البيولوجيا الخاصة بالخلايا الورمية الغازية وغير الغازية والخلايا السدوية في البيئة المجهرية الورمية المحيطة.

لقد خطرت لنا فكرة هذه الطريقة لأول مرة عندما أدركنا مدى وضوح التمييز بين الخلايا الغازية والخلايا غير الغازية في نماذج الزراعة المشتركة النسيجية ثلاثية الأبعاد لسرطان القولون والمستقيم. كبداية، احصل على عينات من نسيج مخاطية القولون البشرية الطبيعية مباشرة من غرفة العمليات الجراحية في المختبر. ضع العينة في مركز طبق زراعة أنسجة بحجم 10 سنتيمتر، ثم اغسل المزرعة ثلاث مرات باستخدام محلول ملحي منظم بالفوسفات أو PBS مضاف إليه البنسلين، والستربتومايسين، والفنغازون.

لا تقم بالشفط بعد الغسلة النهائية؛ وباستخدام ملقط معقم ومشرط، قطع النسيج إلى قطع صغيرة. ثم ضع كل قطعة في مركز علامة متصالبة رسمت بنصل المشرط. في طبق يحتوي على 12 بئراً، هز المشرط بلطف فوق النسيج للسماح له بالالتصاق بالوسط الزراعي.

ضع العينات في 750 µL من وسط نمو الخلايا الليفية الأولية، بحيث يغمر السائل النسيج دون أن يسمح له بالطفو. بعد ذلك، ضع العينات في حاضنة عند 37 °C وبتركيز 5 إلى 10% CO2 على مدار الأيام الخمسة التالية. ستبدأ الخلايا الليفية بالنمو تدريجيًا من حواف النسيج في غضون سبعة أيام تقريبًا.

سيكون هذا أكثر وضوحاً بعد ثلاثة إلى أربعة أسابيع تقريباً. وإذا كانت هناك أعداد كافية من الخلايا الليفية (fibroblasts) النامية، أضف 750 µL من التريبسين إلى كل بئر بعد انفصال الخلايا، ثم اجمعها وانقلها إلى قارورة زراعة أنسجة T 25 لتحضير الهلام النمطي العضوي المشبع بالخلايا الليفية. أولاً، قم بتحضير معلق من الخلايا الليفية يحتوي على 500,000 خلية لكل هلام في وسط dmm مُدعم.

قم بتحضير الهلامات ذات النمط العضوي (organotypic gels) على الثلج وفق النسب المذكورة في البروتوكول النصي لتسع هلامات بمعدل واحد ملليلتر لكل هلام. قم بتحضير 10 ملليلترات واخلطها برفق لتجنب تكون الفقاعات. بعد ذلك، أضف واحد ملليلتر إلى كل بئر في طبق مكون من 24 بئراً، ثم قم بالتحضين لمدة ساعة واحدة عند 37 درجة مئوية في جو رطب.

للسماح للهلام بالتصلب بعد مرور ساعة واحدة، أضف 1 mL من وسط DM EM المدعم فوق الهلام وأعده إلى الحاضنة طوال الليل. وفي اليوم التالي، اشفط الوسط من فوق الهلام وازرع 1 mL من الوسط الذي يحتوي على 500,000 خلية ظهارية لسرطان القولون والمستقيم على شرائح النايلون المغطاة بالهلام.

قم بتجهيز شرائح نايلون معقمة بواسطة الأوتوكلاف بمقاس 1.5 سنتيمتر في 1.5 سنتيمتر مسبقاً باستخدام ملاقط معقمة. ضع العدد المطلوب من شرائح النايلون في طبق زراعة مقاس 10 سنتيمتر. حضّر خليط الهلام على الثلج كما هو موضح في البروتوكول النصي، وأضف 0.1 مولار من هيدروكسيد الصوديوم إلى خليط الهلام حتى يتحول لونه إلى الوردي، مما يشير إلى تعادل المحلول.

أضف بعد ذلك 250 µL من هذا المحلول إلى كل شريحة نايلون. ثم قم بالتحضين عند 37 °C في جو رطب يحتوي على 5%CO2 لمدة 30 دقيقة للسماح للهلام بالتصلب. بعد ذلك، أضف 10 mL من محلول glutaraldehyde بتركيز 1% في PBS إلى كل طبق زرع بقطر 10 cm.

بمجرد أن يتماسك الهلام قبل تحضينه عند درجة حرارة 4 °C لمدة ساعة واحدة، تُغسل رقائق النايلون ثلاث مرات في PBS ومرة واحدة في dme المضاف إليه المكملات. تُحضن الرقائق طوال الليل في المنظم نفسه عند درجة حرارة 4 °C لنقل الهلامات ذات النمط العضوي إلى شبكات فولاذية، وهي عبارة عن شبكات تدعيم معقمة للغزو تم تحضيرها عن طريق طي رقائق الفولاذ المقاوم للصدأ على شكل حامل ثلاثي القوائم. بعد ذلك، تُستخدم ملاقط معقمة باستخدام الإيثانول لوضع شبكة فولاذية في كل بئر من أطباق الستة آبار.

ضع ورقة نايلون مغلفة بالهلام بحيث يكون جانب الكولاجين للأعلى على كل شبكة. انقل الهلامات النسيجية بعناية من طبق الـ 24 بئراً إلى ورقة النايلون المرتفعة باستخدام ملعقة مسطحة (spatula) مُعقمة بالإيثانول. املأ البئر بـ D mem المُدعم حتى تلامس ورقة النايلون الوسط الغذائي دون أن تُغمر فيه.

تأكد من أن الوسط الغذائي لا يلامس الهلام النسيجي (organotypic gel). يتم التحضين لمدة 14 يوماً عند 37 درجة مئوية في جو رطب يحتوي على 5%CO2، مع استبدال الوسط الغذائي كل يومين.

أزل المزرعة النسيجية العضوية بالكامل بما في ذلك ورقة النايلون من البئر وضعها على غشاء تغليف بلاستيكي. قم بشق المزرعة النسيجية العضوية وورقة النايلون إلى نصفين باستخدام مشرط طبي نظيف مخصص للاستخدام مرة واحدة، ثم ثبت كلا النصفين في الفورمالديهايد لمدة 24 ساعة. وفي درجة حرارة الغرفة، استبدل الفورمالديهايد بـ 70% ethanol بعد مرور 24 ساعة واتركها طوال الليل قبل البدء في عملية الطمر في البارافين، والتقطيع، والتصبيغ لإجراء التشريح الدقيق بالليزر.

المقطع الأول، وهو مقطع نسيجي عضوي بسمك 10 ميكرون مثبت على شرائح ذات غشاء. بعد معالجة المقاطع كما هو موضح في البروتوكول النصي، استعد لإجراء التشريح المجهري بالليزر باستخدام المنصة المختارة. ضع الشريحة الزجاجية التي تحتوي على المقطع المصبوغ المراد تشريحه مجهرياً.

قم بتثبيت أنبوب طرد مركزي دقيق سعة 0.5 milliliter وجهه للأسفل على قاعدة المجهر داخل كاسيت التجميع، وأضف 50 µL من محلول تحلل الخلايا (cell lysis buffer) إلى الغطاء الذي ستتجمع فيه الأنسجة المستأصلة مجهرياً تحت الرؤية المباشرة. استخدم عصا التحكم لتحديد النسيج المطلوب، وباستخدام واجهة البرنامج، قم بتحديد المقطع العضوي المصبوغ، مع إبراز الخلايا المراد استئصالها مجهرياً عند جبهة غزو الورم. وجه الليزر للإطلاق، والذي سيقوم بقص المقطع المحدد ودفع النسيج المستأصل مجهرياً إلى غطاء أنبوب الطرد المركزي الدقيق.

استمر في معالجة العينات باستخدام طريقة مناسبة لاستخلاص المادة المراد تحليلها. تظهر هنا صور التشريح الدقيق بالليزر لخلايا سرطان القولون والمستقيم SW 480 وهي تغزو السداة النسيجية العضوية. يُستخدم كريستال فيوليت لإبراز الخلايا الظهارية لسرطان القولون والمستقيم.

يتم بعد ذلك تحديد جزر الورم الغازية قبل إجراء التشريح بالليزر، ثم تُنقل القطعة المقتطعة إلى جهاز تجميع. كما يتم تحديد وعزل الخلايا غير الغازية وخلايا السدى باستخدام المنهجية ذاتها. وقد حُللت المزارع المشتركة ثلاثية الأبعاد عن طريق تحديد ملفات micro RNA لمقارنة جزيئات microRNAs ذات التعبير المتباين بين الخلايا الموجودة في جبهة الورم الغازية وتلك الموجودة في مناطق الورم الطبقية.

تم فرز البيانات بناءً على التغير الكلي وقيم البيانات بزيادة أو نقصان بمقدار ضعفين. وتعرض التغيرات من تجربة ممثلة التعبير الجيني التفاضلي لـ micro RNA بين خلايا الحافة الغازية وخلايا الحافة غير الغازية. بعد مشاهدة هذا الفيديو، يجب أن تتكون لديك فكرة جيدة عن كيفية بناء نماذج عضوية مناسبة تشريحيًا وكيفية استخدام التشريح الدقيق بالليزر لعزل مجموعات فردية من الخلايا لإجراء المزيد من الدراسات. واو.