التنميط الجزيئي للالمكروية ورم الغازية في نموذج 3 الأبعاد للخلايا سرطان القولون والمستقيم و خارج الحي الخلايا الليفية
أبريل 29, 2014
التنميط الجزيئي للخلايا الليزر microdissected وسدى من الاصطناعية، ونماذج سرطان القولون والمستقيم الأنسجة المهندسة يمثل الرواية والنهج manipulatable لتوصيف وتشريح الأحياء المتميزة في مجال التفاعل بين الخلايا السرطانية في الجبهة الغازية وسرطان الخلايا اللحمية المرتبطة.
الهدف العام من هذا الإجراء هو توصيف البيولوجيا المميزة في الواجهة بين الخلايا الظهارية الخبيثة في جبهة الورم الغازية والخلايا اللحمية المرتبطة بالسرطان. يتم تحقيق ذلك عن طريق إنشاء مزارع الخلايا الليفية الأولية أولا من غرسات القولون. تتمثل الخطوة الثانية في بناء نماذج الزراعة العضوية المشتركة باستخدام الخلايا الليفية القولونية الأولية وخلايا سرطان القولون والمستقيم المستنبتة.
بعد ذلك ، يتم تثبيت النماذج العضوية في الشكلين ، مقسمة على شرائح مثبتة على الغشاء وملطخة باللون البنفسجي الكريستال. الخطوة الأخيرة هي التشريح المجهري بالليزر من أجل فصل الخلايا السرطانية الغازية عن الخلايا السرطانية غير الغازية والخلايا اللحمية المرتبطة بالسرطان. في النهاية ، يمكن استخدام تقنيات التنميط الجزيئي لتوصيف بيولوجيا الخلايا السرطانية الغازية وغير الغازية والخلايا اللحمية في البيئة المكروية للورم المحيطة.
خطرت لنا فكرة هذه الطريقة لأول مرة عندما أدركنا مدى وضوح تمييز الخلايا الغازية عن الخلايا غير الغازية في نماذج الزراعة العضوية المشتركة ثلاثية الأبعاد لسرطان القولون والمستقيم. للبدء ، احصل على عينات من أنسجة الغشاء المخاطي للقولون البشري مباشرة من غرفة العمليات الجراحية في المختبر. ضع عينة في وسط طبق زراعة الأنسجة بطول 10 سم ، ثم اغسل المزرعة ثلاث مرات بمحلول ملحي مخزن بالفوسفات أو PBS المكمل بالبنسلين والستربتومايسين ومنطقة الفطريات.
لا تشفط بعد الغسيل النهائي بالملقط المعقم والمشرط ، وقطع الأنسجة إلى قطع صغيرة. ثم ضع كل قطعة في وسط صليب مرسوم بشفرة المشرط. في صفيحة 12 بئر ، هز المشرط برفق فوق الأنسجة للسماح له بالالتصاق بالثقافة.
العينات في 750 ميكرولتر من وسائط نمو الخلايا الليفية الأولية ، والتي يجب أن تغمر الأنسجة دون تمكينها من الطفو. ثم ضع العينات في حاضنة 37 درجة مئوية ، من خمسة إلى 10٪ من ثاني أكسيد الكربون خلال الأيام الخمسة المقبلة. ستبدأ الخلايا الليفية في النمو ببطء من حافة الأنسجة في حوالي سبعة أيام.
سيكون هذا أكثر وضوحا بعد حوالي ثلاثة إلى أربعة أسابيع. وإذا كان هناك عدد كاف من الخلايا الليفية التي تنمو ، أضف 750 ميكرولترا من التربسين إلى كل بئر بعد فصل الخلايا وقم بنقلها إلى قارورة ثقافة الأنسجة T 25 للهلام العضوي المشبع بالخلايا الليفية. أولا ، قم بإعداد معلق خلية الخلايا الليفية يحتوي على 500،000 خلية لكل هلام في DMM المكملة.
قم بتكوين المواد الهلامية العضوية على الثلج بالنسب الموجودة في بروتوكول النص لتسعة مواد هلامية بمعدل واحد مليلتر لكل هلام. تحضير 10 مل واخلطها برفق لتجنب الفقاعات. ثم أضف ملليلترا واحدا إلى كل بئر من صفيحة 24 جيدا واحتضنها لمدة ساعة عند 37 درجة مئوية في جو رطب.
للسماح للمواد الهلامية بالتماسك بعد ساعة واحدة ، أضف ملليلترا واحدا من DM EM المكممل فوق المواد الهلامية والعودة إلى الحاضنة طوال الليل. في اليوم التالي. وسط الشفط من أعلى المواد الهلامية ولوحة ملليلتر واحد من الوسط يحتوي على 500،000 الخلايا الظهارية لسرطان القولون والمستقيم لصفائح النايلون المطلية بالهلام.
قم بإعداد صفائح نايلون معقمة بقياس 1.5 سم × 1.5 سم مسبقا باستخدام ملقط معقم. ضع العدد المطلوب من صفائح النايلون في طبق ثقافة 10 سم. قم بإعداد خليط الجل على الثلج كما هو موضح في بروتوكول النص وأضف 0.1 مولي من هيدروكسيد الصوديوم إلى مزيج الجل حتى يتحول إلى اللون الوردي مما يشير إلى أن المحلول قد تم تحييده.
ثم أضف 250 ميكرولتر من هذا المحلول إلى كل لوح نايلون. ثم احتضن عند 37 درجة مئوية في جو مرطب بنسبة 5٪ من ثاني أكسيد الكربون لمدة 30 دقيقة للسماح للهلام بالتماسك. بعد ذلك ، أضف 10 مل من محلول جلوتارالديهايد بنسبة 1٪ في PBS إلى كل طبق استزراع 10 سم.
بمجرد أن يتماسك الجل قبل الحضانة عند أربع درجات مئوية لمدة ساعة واحدة ، اغسل صفائح النايلون ثلاث مرات في PBS ومرة واحدة في dme المكملة. احتضان الألواح طوال الليل في نفس المخزن المؤقت عند أربع درجات مئوية لرفع المواد الهلامية العضوية على شبكات فولاذية لشبكات السقالات المعقمة للغزو التي تم تحضيرها عن طريق طي صفائح الفولاذ المقاوم للصدأ في تشكيل ثلاثي القوائم. ثم استخدم الملقط والمعقم والإيثانول لوضع شبكة فولاذية في كل بئر من ستة آبار.
ضع ورقة نايلون مغلفة بالهلام مع جانب الكولاجين لأعلى على كل شبكة. انقل المواد الهلامية العضوية بعناية من صفيحة 24 بئر إلى لوح النايلون المرتفع باستخدام ملعقة ومعقمة وإيثانول. املأ البئر ب D mem المكمل حتى تتلامس لوح النايلون مع الوسط ولكن غير مغمورة.
تأكد من أن الوسيط لا يلمس الجل العضوي. احتضان لمدة 14 يوما عند 37 درجة مئوية في جو رطب بنسبة 5٪ CO2. استبدال الوسط كل يومين.
قم بإزالة النمط العضوي بالكامل بما في ذلك لوح النايلون من البئر وضعه على غلاف بلاستيكي. قم بتقسيم صفيحة النمط العضوي والنايلون باستخدام مشرط نظيف يمكن التخلص منه وقم بإصلاح كلا النصفين في الفورمالديهايد لمدة 24 ساعة. في درجة حرارة الغرفة ، استبدل الفورمالديهايد بنسبة 70٪ من الإيثانول بعد 24 ساعة واتركه طوال الليل قبل تضمينه في البارافين والتقطيع والتلوين لإجراء التشريح الدقيق بالليزر.
القسم الأول ، النمط العضوي بسمك 10 ميكرون على الشرائح المثبتة على الغشاء. بعد معالجة الأقسام كما هو موضح في بروتوكول النص ، استعد لإجراء الفحص الدقيق بالليزر باستخدام نموذج النظام الأساسي المختار. ضع الشريحة الزجاجية مع قسم البقع المراد تشريحها بالميكروس.
ووجهك لأسفل على مرحلة المجهر ، وقم بتركيب أنبوب طرد مركزي دقيق سعة 0.5 مليلتر في كاسيت التجميع وأضف 50 ميكرولترا من المخزن المؤقت لتحلل الخلايا إلى الغطاء الذي ستتجمع فيه الأنسجة التشريح الدقيقة تحت الرؤية المباشرة. استخدم عصا التحكم لتحديد الأنسجة ذات الأهمية واستخدام واجهة البرنامج ، وقم بالتعليق على القسم العضوي الملون ، وتسليط الضوء على الخلايا لتكون دقيقة في جبهة غزو الورم. قم بتوجيه الليزر لإطلاق النار ، والذي يجب أن يقطع القسم المميز ويدفع الأنسجة الدقيقة إلى غطاء أنبوب الطرد المركزي الصغير.
تابع معالجة العينات بطريقة مناسبة لاستخراج المادة التحليلية ذات الاهتمام. تظهر هنا صور التشريح المجهري بالليزر لخلايا سرطان القولون والمستقيم SW 480 التي تغزو السدى العضوي. يستخدم كريستال البنفسجي لتسليط الضوء على الخلايا الظهارية لسرطان القولون والمستقيم.
ثم يتم تحديد جزر الورم الغازية قبل حدوث التشريح بالليزر ونقل القطعة المقطوعة إلى جهاز التجميع. يتم تحديد الخلايا غير الغازية والخلايا اللحمية وعزلها باستخدام نفس المنهجية. تم تحليل الثقافات المشتركة ثلاثية الأبعاد عن طريق توصيف الحمض النووي الريبي الصغير لمقارنة الحمض النووي الريبي الصغير المعبر عنه تفاضليا بين الخلايا الموجودة في جبهة الورم الغازية وتلك الموجودة في مناطق الورم الطبقية.
تم فرز البيانات حسب التغيير الكامل وقيم البيانات زائد أو ناقص مزدوجة. يتم تقديم التغيير من تجربة تمثيلية تظهر التعبير الجيني التفاضلي للحمض النووي الريبي الصغير بين خلايا الهامش الغازية وخلايا الهامش غير الغازية. بعد مشاهدة هذا الفيديو ، يجب أن تكون لديك فكرة جيدة عن كيفية بناء نماذج عضوية مناسبة تشريحيا وكيفية استخدام التشريح الدقيق بالليزر لعزل مجموعات فردية من الخلايا لمزيد من الدراسة. قف.
اعرض النص الكامل واحصل على الوصول إلى آلاف الفيديوهات العلمية
النظرة العامة
تقدم هذه الدراسة نهجًا جديدًا لتمييز علم الأحياء عند واجهة الخلايا الظهارية الخبيثة والخلايا اللحمية المرتبطة بالسرطان في نماذج سرطان القولون والمستقيم. من خلال استخدام التقطيع المجهري بالليزر، يمكن للباحثين تشريح وتحليل البيئات الخلوية المميزة داخل البيئات المكروية للورم.
مكونات الدراسة الرئيسية
مجال العلم
- علم الأعصاب
- طب الأورام
- علم الأحياء الخلوية
الخلفية
- يتضمن سرطان القولون والمستقيم تفاعلات معقدة بين الخلايا الورمية واللحمة المحيطة.
- فهم هذه التفاعلات أمر بالغ الأهمية لتطوير علاجات مستهدفة.
- يتيح التقطيع المجهري بالليزر العزل الدقيق لأنواع معينة من الخلايا داخل الأورام.
- يمكن لهذه المنهجية تعزيز جهود التنميط الجزيئي.
هدف الدراسة
- لتمييز علم الأحياء في الجبهة الغازية لأورام القولون والمستقيم.
- للتمييز بين الخلايا الورمية الغازية وغير الغازية.
- لتحليل دور الخلايا اللحمية المرتبطة بالسرطان في تقدم الورم.
الطرق المستخدمة
- تأسيس ثقافات ليفية أولية من زراعات القولون.
- بناء نماذج زراعة مشتتة عضوية مع الخلايا الليفية وخلايا سرطان القولون والمستقيم.
- تثبيت وتقسيم النماذج العضوية للتحليل.
- استخدام التقطيع المجهري بالليزر لفصل الخلايا الورمية واللحمية.
النتائج الرئيسية
- يكشف التنميط الجزيئي عن خصائص بيولوجية مميزة للخلايا الورمية والخلايا اللحمية.
- تحديد اختلافات في التعبير الجيني بين الخلايا الغازية وغير الغازية.
- رؤى حول دور البيئة المكروية للورم في تقدم السرطان.
- إمكانية تطوير استراتيجيات علاجية مستهدفة بناءً على هذه النتائج.
الاستنتاجات
- يوفر هذا النهج نموذجًا قابلًا للتعامل لدراسة علم الأحياء لسرطان القولون والمستقيم.
- يعتبر التقطيع المجهري بالليزر أداة قيمة لعزل مجموعات خلوية معينة.
- يمكن أن يساعد فهم واجهة الورم-اللحمة في توجيه علاجات السرطان المستقبلية.
الأسئلة الشائعة
Executive Industry Relevance
Understanding the molecular dynamics at the tumor-stroma interface enables early de-risking of colorectal cancer target hypotheses by revealing phenotype-specific signaling and microenvironmental dependencies. This approach supports predictive confidence in target validation by isolating invading cell populations for mechanistic profiling, informing portfolio triage before significant investment. The methodology bridges discovery biology and translational relevance through direct analysis of invasion-competent cells in a near-physiological 3D context.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Scientific Value: Enables interrogation of therapeutic hypotheses by profiling gene expression differences between invading and non-invasive tumor cells at the invasive front.
- Operational Value: Provides a reproducible method to isolate phenotypically distinct cell populations for downstream molecular analysis.
- Strategic Value: Supports target de-risking by identifying stroma-dependent invasion mechanisms that may represent actionable nodes in CRC progression.
Screening & Assay Development
- Scientific Value: Generates quantitative molecular readouts (e.g., microRNA expression) from laser-dissected invading cells to inform biomarker-assay linkage.
- Operational Value: Standardizes stromal-tumor co-culture conditions to enable consistent, invasion-competent models for assay qualification.
- Strategic Value: Facilitates assay readiness by providing a defined biological system that recapitulates key stromal interactions relevant to drug response.
Translational & Preclinical Research
- Scientific Value: Links discovery-phase molecular profiles to disease-relevant stromal interactions, supporting translational biomarker exploration in CRC.
- Operational Value: Enables continuity from 3D invasion models to preclinical validation by defining stromal contributions to tumor progression.
- Strategic Value: Informs risk-adjusted advancement decisions by clarifying whether targets are operative in invasion-competent microenvironments.
Pipeline & Workflow Integration
The method integrates into the discovery continuum by enabling hypothesis-driven profiling of invasion-competent cells, supporting lead identification through microenvironmentally contextualized target validation, and informing preclinical work via stromal co-dependency mapping.
- Discovery Biology: Supports pathway clarification and biological de-risking by isolating invading tumor cells and associated stromal compartments for molecular profiling.
- Screening: Delivers assay-ready, reproducible 3D models that maintain stromal-tumor interactions critical for evaluating compound effects on invasion.
- Analytics: Provides quantitative dependent variable measurements (e.g., fold-change in microRNA expression) that enable statistical comparison between invasive and non-invasive phenotypes.
- Translational Research: Connects molecular signatures from the invasion front to preclinical continuity by highlighting stroma-mediated mechanisms relevant to disease progression.
- Enterprise Reuse: Establishes a scalable, standardized platform for repeated use across multiple cancer-stroma interaction studies in oncology discovery.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Increases predictive confidence in target validation by reducing mechanistic ambiguity through direct profiling of the invasive tumor microenvironment.
- Operational Value: Enhances reproducibility and standardization of stromal-tumor co-culture models across discovery teams.
- Strategic Value: Improves go/no-go decision-making by providing microenvironmentally contextualized target evidence, reducing late-stage biological attrition.
- Portfolio Impact: Enables risk-adjusted prioritization of targets based on their relevance in invasion-competent cellular contexts.
Implementation Considerations
- Requires expertise in primary cell culture, 3D organotypic model assembly, and laser microdissection techniques.
- Dependent on access to laser microdissection platforms, molecular profiling tools (e.g., for microRNA analysis), and standardized fixation/sectioning workflows.
- Necessitates cross-team standardization of co-culture conditions, staining protocols, and dissection parameters to ensure reproducibility across sites.
- Adaptation considerations include optimizing fibroblast-to-cancer cell ratios and matrix composition for different stromal contexts beyond colorectal cancer.
- Practical limitations include the technical complexity of isolating pure cell populations from dense 3D matrices and potential RNA yield constraints from microdissected samples.
Biopharma FAQs
Chapters in this video
0:05
Title
1:32
Establishment of Primary Fibroblast Cultures from Colonic Explants
3:18
Organotypic Preparation
8:47
Results: MicroRNA Expression Profiling of Tissue from Laser-microdissected Organotypic CRC Models
10:06
Conclusion
6:52
Organotypic Fixation and Laser Microdissection of the Invasive Margin
