Name: والتعديل في المختبر الغزو الفحص لتحديد الدور المحتمل للالهرمونات، السيتوكينات و / أو عوامل النمو في التوسط السرطان غزو الخلايا (فيديو) | JoVE Journal
Uploaded: 2015-04-24T14:00:00.000+00:00
Duration: 6 min 36 s
Description: تعلم تقييم غزو الخلايا السرطانية في المختبر باستخدام وسط مخلوط بالفحم لإزالة العوامل الذاتية. تساعد هذه الطريقة الباحثين على دراسة تأثير الهرمونات والسيتوكينات وعوامل النمو على انتشار السرطان.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

يقر المؤلفون بمصادر التمويل من كلية ديوفيل للصيدلة ، بوفالو ، نيويورك.

1. إعداد وسائل الإعلام المختلفة ومكونات إضافية <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> قبل التجربة، وإعداد وسائل الاعلام التي تتألف من DMEM أو وسائط أخرى محددة مع إضافة إما العادي FBS، والفحم جردت FBS، أو الفحم جردت FBS بالإضافة إلى مكون لفحصها. لاحظ أن مكونات متعددة يمكن اختبارها في كل تجربة. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> تزن بها ويخفف من الهرمونات، وعوامل النمو، أو السيتوكينات بشكل مناسب ليتم حلها في الفحم جردت المصل في التركيز الفسيولوجي. </li></ol> 2. إعداد مصفوفة الكولاجين على الجليد <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> إعداد 2 مل الكولاجين أنا المصفوفة على 2.2 ملغ / مل عن طريق إضافة مكونات تصفيتها العقيمة التالية على الجليد: 200 ميكرولتر 10X PBS (درجة الحموضة 7.4)، 5.4 ميكرولتر 1 N هيدروكسيد الصوديوم، 600 ميكرولتر من ضعف H المقطر 2 O، و 1.2 مل الكولاجين I (على 3.63 ملغ / مل). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> حافظ على حل أنا الكولاجين على الجليد حتى جاهزة للوحة. </li></ol> 3. إعداد الهجرة / الغزو لوحات لفحص &lt;/ P&gt; <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> لكل خط الخلية لفحصها، استخدم واحد 24-جيدا لوحة غرفة فيها 12 بئرا تحتوي على تدرج. استخدام 12 بئرا إضافية التي لا تحتوي على إدراج لإضافة وسائل الإعلام جاذب كيميائي ونقل إدراج لمجموعة تجريبية تصل. ملاحظة: مصفوفة الكولاجين على لوحات مع البولي ايثيلين teraphthalate (PET) الغشاء و 8 ميكرون حجم المسام هو الأمثل لخطوط الخلايا تستخدم هنا. ومع ذلك، مصفوفة matrigel في لوحات المكسوة مسبقا والمحمولة ويمكن أيضا أن تكون بديلا مع حجم المسام انخفضت وفقا لخط الخلية التي يجري التحقيق فيها. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> علامة واضحة على لوحة، وذلك باستخدام 3 آبار في حالة يجري تحليلها (FBS الهجرة، والهجرة CS-FBS، والغزو FBS، والغزو CS-FBS وكذلك FBS الهجرة لعنصر تحكم، خط خلية موسع). الهجرة الفحص من قبل الحركة من خلال المسام في غشاء PET، والغزو فحص من قبل الحركة من خلال الكولاجين أو matrigel مصفوفة ثم من خلال المسام في الغشاء. استخدام علامات لون مختلفة لكل حالة خلية إلىمعرف في عملية الطلاء. </li></ol> 4. الاستغناء مصفوفة الغزو <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ماصة بعناية 75 ميكرولتر من محلول مادة الكولاجين في إدراج لاستخدامها في المقايسات الغزو. توخي الحذر لتجنب الفقاعات. تفريق فقاعات من خلال تطبيق طرف ماصة مقلوب إلى السطح. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> نقل لوحة مع إدراج المغلفة الكولاجين إلى 37 درجة مئوية و 5٪ CO 2 الحاضنة لمدة 30 دقيقة لتمكين هلام لترسيخ. </li></ol> 5. لوحة خلايا على الغشاء أو الغزو مصفوفة <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> وفي الوقت نفسه، يعرض للتريبسين الخلايا وإضافة وسائل الإعلام مع 10٪ FBS. خلايا تدور في 200 x ج لمدة 5 دقائق على قمة الجدول الطرد المركزي وشطف 3X في وسائل الإعلام الحرة المصل. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> resuspend في وسائل الإعلام الحرة المصل. عدد الخلايا مع عدادة الكريات أو العداد الشريحة الآلي. إضافة وسائل الإعلام الحرة المصل إلى تركيز النهائي من 5 × 10 4 خلية / مل. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> عندما عزز مصفوفة الكولاجين (بعد 30 دقيقة)، إضافة 700 ميكرولتر من وسائل الاعلام مع أي2٪ FBS محددة أو الفحم-تجريد FBS إلى كل بئر. من 12 تدرج في لوحة: <ul style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> 3 إدراج لها الكولاجين وآبار مع وسائل الإعلام + 2٪ FBS </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> 3 إدراج لها الكولاجين وآبار مع وسائل الإعلام + 2٪ CS-FBS </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> 3 إدراج ليس لها الكولاجين وآبار مع وسائل الإعلام + 2٪ FBS </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> 3 إدراج ليس لها الكولاجين وآبار مع وسائل الإعلام + 2٪ CS-FBS </li></ul><ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> استخدام لوحات إضافية تبعا لعدد من العوامل التي يجري اختبارها ومع جهاز تحكم عن أي الكولاجين المقابلة لكل حالة. </li></ol></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> إضافة تعليق الخلية إلى إدراج في 5 × 10 4 خلية / مل، والطلاء 500 خلية ميكرولتر في إدراج في كل إدراج الهجرة والغزو. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> احتضان الخلايا لمدة 22 ساعة على 37 درجة مئوية. </li></ol> 6. تحديد عدد من ترحيل والخلايا الغازية <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> إعداد تلطيخ الآبار باستخدام مثبت الميثانول، يوزين، وhemotoxylin، في آبار منفصلة. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> استخدام قطعة قطن لإزالة الخلايا ومصفوفة من كل بئر.Rrepeat مع تطبيق مسحة الثاني لكل بئر. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> مع ملقط، وتراجع كل إدراج 5 مرات ل1 ثانية إلى كل من حلول 3 على التوالي. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> سماح إدراج لتجف O / N. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> إما ط) إزالة المرشحات مع مشرط، وقطع بعناية حول حواف وجبل على شريحة مع ساترة والغمر النفط، أو ب) السماح للتدرج لتجف O / N مقلوب واستخدام إدراج مباشرة للفحص المجهري. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> في اليوم التالي، وعرض الشرائح أو إدراج تحت المجهر مع هدف 20X وتأخذ 5 صور من مناطق مختلفة من التصفية. لتحسين الاتساق، واتخاذ 4 حقول الخارجي ومركز واحد. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> عد الخلايا لجميع الظروف باستخدام برنامج يماغيج وتنطبق على الصيغ أدناه. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> تحديد الغزو في المئة على النحو التالي: يعني # من الخلايا الغازية من خلال الكولاجين I إدراج = ل يعني # الخلايا المهاجرة من خلال إدراج السيطرة = ب ٪ الغزو = (أ / ب) * 100 </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> تحديد مؤشر الغزو في 2٪ FBS على النحو التالي: الغزو٪ من خلايا يجري يعاير (في 2٪ FBS) = ج ٪ غزو السيطرة خلايا موسع في (2٪ FBS) = د مؤشر الغزو (FBS) = (ج / د) </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> تحديد مؤشر الغزو في 2٪ CS-FBS على النحو التالي: الغزو٪ من خلايا يجري يعاير (في 2٪ CS-FBS) = ه الغزو٪ من سيطرة خلايا موسع في (2٪ CS-FBS) = و مؤشر الغزو (CS-FBS) = (ه / و) </li></ol> 7. كرر بروتوكول التجريبية مقارنة الفحم-تجريد FBS لFBS الفحم تجريد ل+ X ن مع عوامل متعددة جنبا إلى جنب <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> كرر الإجراء عدة مرات حسب الحاجة باستخدام المكونات المختلفة ل &quot;X&quot; أو مزيج من المكونات. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> تطبيق العمليات الحسابية لتحديد مساهمة كل عامل &quot;X&quot; إلى الهجرة والغزو الآثار. </li></ol>

<ol><li>Weinberg, R. A. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aWeinberg%2C+RA+%22The+Biology+of+Cancer%22">The Biology of Cancer</a>. , 2nd Edition, Garland Science. (2013).</li>
<li>Hanahan, D., Weinberg, R. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Hallmarks+of+cancer%3A+the+next+generation%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Hallmarks of cancer: the next generation.</a> Cell. 144 (5), 646-674 (2011).</li>
<li>Hanahan, D., Weinberg, R. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+hallmarks+of+cancer%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">The hallmarks of cancer.</a> Cell. 100 (1), 57-70 (2000).</li>
<li>Valastyan, S., Weinberg, R. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Tumor+metastasis%3A+molecular+insights+and+evolving+paradigms%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Tumor metastasis: molecular insights and evolving paradigms.</a> Cell. 147 (2), 275-292 (2011).</li>
<li>Dang, Z. C., Lowik, G. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Removal+of+serum+factors+by+charcoal+treatment+promotes+adipogenesis+via+a+MAPK-dependent+pathway%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Cell+Biochem%22%5BJournal%5D)">Removal of serum factors by charcoal treatment promotes adipogenesis via a MAPK-dependent pathway.</a> Mol Cell Biochem. 268 (1-2), 159-167 (2005).</li>
<li>Yohay, D. A., Zhang, J., Thrailkill, K. M., Arthur, J. M., Quarles, L. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Role+of+serum+in+the+developmental+expression+of+alkaline+phosphatase+in+MC3T3-E1+osteoblasts%5BTitle%5D)+AND+%22J+Cell+Physiol%22%5BJournal%5D)">Role of serum in the developmental expression of alkaline phosphatase in MC3T3-E1 osteoblasts.</a> J Cell Physiol. 158 (3), 467-475 (1994).</li>
<li>Zucker, S. N., Bancroft, T. A., Place, D. E., Des Soye,, Bagati, B., Berezney, A., R, <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+dominant+negative+Cx43+mutant+differentially+affects+tumorigenic+and+invasive+properties+in+human+metastatic+melanoma+cells%5BTitle%5D)+AND+%22J+Cell+Physiol%22%5BJournal%5D)">A dominant negative Cx43 mutant differentially affects tumorigenic and invasive properties in human metastatic melanoma cells.</a> J Cell Physiol. 228 (4), 853-859 (2013).</li>
<li>Fox, E. M., Andrade, J., Shupnik, M. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Novel+actions+of+estrogen+to+promote+proliferation%3A+integration+of+cytoplasmic+and+nuclear+pathways%5BTitle%5D)+AND+%22Steroids%22%5BJournal%5D)">Novel actions of estrogen to promote proliferation: integration of cytoplasmic and nuclear pathways.</a> Steroids. 74 (7), 622-627 (2009).</li>
<li>Meierjohann, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((MMP13+mediates+cell+cycle+progression+in+melanocytes+and+melanoma+cells%3A+in+vitro+studies+of+migration+and+proliferation%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+Cancer%22%5BJournal%5D)">MMP13 mediates cell cycle progression in melanocytes and melanoma cells: in vitro studies of migration and proliferation.</a> Molecular Cancer. 9, 201(2010).</li>
<li>Smalley, K. S., Haass, N. K., Brafford, P. A., Lioni, M., Flaherty, K. T., Herlyn, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Multiple+signaling+pathways+must+be+targeted+to+overcome+drug+resistance+in+cell+lines+derived+from+melanoma+metastases%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Cancer+Ther%22%5BJournal%5D)">Multiple signaling pathways must be targeted to overcome drug resistance in cell lines derived from melanoma metastases.</a> Mol Cancer Ther. 5 (5), 1136-1144 (2006).</li>
<li>Both, N. J., Vermey, M., Dinjens, W. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+comparative+evaluation+of+various+invasion+assays+testing+colon+carcinoma+cell+lines%5BTitle%5D)+AND+%22Br+J+Cancer%22%5BJournal%5D)">A comparative evaluation of various invasion assays testing colon carcinoma cell lines.</a> Br J Cancer. 81 (6), 934-941 (1999).</li>
<li>Fidler, I. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+pathogenesis+of+cancer+metastasis%3A+the+%27seed+and+soil%27+hypothesis+revisited%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Rev.+Cancer%22%5BJournal%5D)">The pathogenesis of cancer metastasis: the 'seed and soil' hypothesis revisited.</a> Nat. Rev. Cancer. 3, 453-458 (2003).</li>
<li>Huang, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Epithelial+to+mesenchymal+transition+in+human+breast+epithelial+cells+transformed+by+17beta-estradiol%5BTitle%5D)+AND+%22Cancer+Res%22%5BJournal%5D)">Epithelial to mesenchymal transition in human breast epithelial cells transformed by 17beta-estradiol.</a> Cancer Res. 67 (23), 11147-11157 (2007).</li>
<li>Huang, Y. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Thyroid+hormone+regulation+of+miR-21+enhances+migration+and+invasion+of+hepatoma%5BTitle%5D)+AND+%22Cancer+Res%22%5BJournal%5D)">Thyroid hormone regulation of miR-21 enhances migration and invasion of hepatoma.</a> Cancer Res. 73 (8), 2505-2517 (2013).</li>
<li>Scheel, C., Weinberg, R. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cancer+stem+cells+and+epithelial-mesenchymal+transition%3A+concepts+and+molecular+links%5BTitle%5D)+AND+%22Semin.+Cancer+Biol%22%5BJournal%5D)">Cancer stem cells and epithelial-mesenchymal transition: concepts and molecular links.</a> Semin. Cancer Biol. 22 (5-6), 396-403 (2012).</li>
<li>Kojima, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Autocrine+TGF-beta+and+stromal+cell-derived+factor-1+%28SDF-1%29+signaling+drives+the+evolution+of+tumor-promoting+mammary+stromal+myofibroblasts.Proc%5BTitle%5D)+AND+%22Natl+Acad+Sci+U+S+A%22%5BJournal%5D)">Autocrine TGF-beta and stromal cell-derived factor-1 (SDF-1) signaling drives the evolution of tumor-promoting mammary stromal myofibroblasts.Proc.</a> Natl Acad Sci U S A. 107 (46), 20009-20014 (2010).</li>
<li>Maehara, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Role+of+transforming+growth+factor-%CE%B21+in+invasion+and+metastasis+in+gastric+carcinoma%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Clin.+Oncology%22%5BJournal%5D)">Role of transforming growth factor-β1 in invasion and metastasis in gastric carcinoma.</a> J. Clin. Oncology. 17 (2), 607-614 (1999).</li>
<li>Lu, Z., Jiang, G., Blume-Jensen, P., Hunter, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Epidermal+growth+factor-induced+tumor+cell+invasion+and+metastasis+initiated+by+dephosphorylation+and+downregulation+of+focal+adhesion+kinase%5BTitle%5D)+AND+%22Mol.+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Epidermal growth factor-induced tumor cell invasion and metastasis initiated by dephosphorylation and downregulation of focal adhesion kinase.</a> Mol. Cell Biol. 21 (12), 4016-4031 (2001).</li>
<li>Korkaya, H., Liu, S., Wicha, M. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Breast+Cancer+stem+cells%2C+cytokine+networks%2C+and+the+tumor+microenvironment%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Clin.+Invest%22%5BJournal%5D)">Breast Cancer stem cells, cytokine networks, and the tumor microenvironment.</a> J. Clin. Invest. 121 (10), 3804-3809 (2011).</li>
<li>Rosen, E. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+interrogation+of+HGF-SF+with+other+cytokines+in+tumor+invasion+and+metastasis%5BTitle%5D)+AND+%22EXS%22%5BJournal%5D)">The interrogation of HGF-SF with other cytokines in tumor invasion and metastasis.</a> EXS. 65, 301-310 (1993).</li>
<li>Sanz-Moreno, V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((ROCK+and+JAK1+signaling+cooperate+to+control+actomyosin+contractility+in+tumor+cells+and+stroma%5BTitle%5D)+AND+%22Cancer+Cell%22%5BJournal%5D)">ROCK and JAK1 signaling cooperate to control actomyosin contractility in tumor cells and stroma.</a> Cancer Cell. 20 (2), 229-245 (2011).</li>
<li>Fleming, J. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Paracrine+interactions+between+primary+human+human+fibroblasts+enhance+murine+mammary+gland+humanization+in+vivo%5BTitle%5D)+AND+%22Breast+Cancer+Res%22%5BJournal%5D)">Paracrine interactions between primary human human fibroblasts enhance murine mammary gland humanization in vivo.</a> Breast Cancer Res. 14 (3), (2012).</li>
<li>Sikora, <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((M.J.%2C+V.%2C+M.E.%2C+M.D.%2C+J.M%5BTitle%5D)+AND+%22Mechanisms+of+estrogen-independent+breast+cancer+growth+driven+by+low+estrogen+concentrations+are+unique+versus+complete+estrogen+deprivation.Breast+Cancer+Res+Treat%22%5BJournal%5D)">M.J., V., M.E., M.D., J.M.</a> Mechanisms of estrogen-independent breast cancer growth driven by low estrogen concentrations are unique versus complete estrogen deprivation.Breast Cancer Res Treat. 134 (3), 1027-1039 (2012).</li>
</ol>

ليس لدى المؤلفين ما يكشفون عنه.

ورم خبيث هو عملية متعددة الخطوات. الخلايا يجب أن اختراق الغشاء القاعدي، intravasate إما إلى الجهاز الليمفاوي أو الدم microvessels، والتي يتم نقلها إلى مواقع بعيدة. الخلايا السرطانية ثم يتسرب واستعمار إلى macrometastasis 12. وقد تم تعزيز التقدم من خلال الظهارية للانتقال الوسيطة (EMT)، غزو الورم، والانبثاث بواسطة هرمونات الستيرويد 13،14، عوامل النمو 15-18، والسيتوكينات 19-21. هذه الجزيئات هي حرجة للغاية في التصدي للمسار الإشارات من تطور ال...

وقد تم وضع الغزو فحص رواية بهدف التعرف على إشراك هرمونات معينة، السيتوكينات و / أو عوامل النمو كما chemoattractants في غزو الخلايا السرطانية. قدرة الخلايا السرطانية لغزو من خلال المصفوفة خارج الخلية (ECM) هي السمة المميزة لالنمط الظاهري النقيلي 1-3. تم غرف الغزو تستخدم على نطاق واسع كما هو الحال في المختبر أدوات لدراسة غزو الخلايا السرطانية والهجرة ويمكن أن توفر المعرفة فيما يتعلق آليات في الجسم الحي غزو الورم والانبثاث. تتكون غرف أسطواني إدراج ثقافة خلية متداخلة ضمن الآبار لوحات ثقافة الخلية. قيعان من إدراج هي البولي أو البوليسترين أغشية شبه منفذة من أحجام المسام محددة. في غزو الفحص القياسية، هي المصنفة الخلايا على غشاء إدراج مع وسائل الإعلام الحرة المصل ووضعها في الآبار ثقافة الخلية التي تمتلئ المصل أو مثل مصل chemoattractants إلى sوآخرون تصل قوة chemoattractive. هذه الأقراص قوة خلايا للتحرك من خلال غشاء شبه منفذ (الهجرة) أو بدلا من ذلك، من خلال طلاء من المصفوفة خارج الخلية (الغزو)، ومن ثم يمكن الملون باستخدام الأصباغ التقليدية لكشف وتحديد عدد الخلايا. ثم يتم تطبيع عدد الخلايا وفقا لمدى الهجرة والغزو في خط خلية موسع. هذا الأسلوب يسمح محقق لتقييم إمكانية الغازية من أنواع مختلفة من الخلايا تحت مجموعة متنوعة من الظروف، بما في ذلك التلاعب الجيني. الهرمونات، والسيتوكينات وعوامل النمو هي المكونات الهامة للمصل ويتزايد أظهرت أن تترافق مع القيادة النمط الظاهري الغازية 4. ومع ذلك، فإن طبيعة ودور وخصوصية هذه الجزيئات في الدم chemoattractive في التوسط الغزو لا يزال لا تزال بعيدة المنال. ويبقى التحدي لتحديد ما هي العوامل المحددة في المصل أو مثل مصل chemoattractants هي المسؤولة عن القيادةالسرطان غزو الخلايا وكذلك ما الجزيئات قد تحول دون عملية الغزو. في هذا التقرير، وصفنا منهجية لتقييم تورط محتمل من الهرمونات، والسيتوكينات و / أو عوامل النمو الموجودة في مصل الدم، والجزيئات قيادة chemoattraction وغزو الخلايا السرطانية. في هذا البروتوكول المعدل المقترح، يتم استخدام الفحم تجريد لإزالة الهرمونات، والسيتوكينات وعوامل النمو من المصل 2٪ بقري جنيني (FBS) لتوليد FBS 2٪ الفحم تجريد (CS-FBS). وتستخدم على حد سواء 2٪ FBS و 2٪ CS-FBS وكلاء لإعداد القوة chemoattractive لدفع السرطان غزو الخلايا. باستخدام 2٪ CS-FBS كعامل chemoattractive مقارنة إلى وضعها الطبيعي 2٪ FBS يتيح العديد من المزايا بما في ذلك لأول مرة، وأبرزها، والقدرة على دراسة النمط الظاهري غزو السرطان في / الغياب النسبي انخفاض الهرمونات، والسيتوكينات وعوامل النمو. كما أنها تمكن المحقق لتقييم ما إذا كانت إزالة الجماعية من الهرمونات، وعوامل النمو، وقبرصييسبب tokines زيادة أو نقصان في مؤشر الغازية. ثم تم تصميم فحص لتحديد ما إذا كانت إضافة عنصر الفردي، وصفت بأنها &quot;X&quot; يمكن أن يمنع، نقصان، زيادة، أو استعادة مؤشر الغازية إلى قيمتها الأصلية (انظر الشكلين 2 و 3). على الرغم من أن هذه المنهجية هي محددة لتحقيق المستويات الفسيولوجية للعنصر الذي يتم إزالتها من المصل خلال تجريد الفحم، كما تجدر الإشارة إلى أن الفحم تجريد يمكن أن يؤثر أيضا مسارات نقل الإشارة. على سبيل المثال، تم الإبلاغ عن أن الفحم تجريد يمكن أن تقلل من نشاط إنزيم الفوسفاتيز القلوية الخلايا سليفة العظمية وتحفز تكون الشحم من خلال الحد من تفعيل MAPK 5. هي الفحم وسائل الإعلام جردت المتاحة تجاريا، وتستند على بروتوكول المبينة يجمع الفحم مع ديكستران وحضنت مع بقري جنيني المصل O / N 6. وقد تم تطوير هذا الفحص في RESPONSE إلى نتيجة ذكرت من قبل زوكر وآخرون. 7 تظاهر المؤلفون أن النمط الظاهري متحولة تؤثر على الاتصالات الفجوة تقاطع أظهرت زيادة في مؤشر الغزو عندما يهاجرون نحو وسائل الإعلام مع العادي 2٪ FBS. تم القضاء على هذه الزيادة مع استبدال المصل جردت الفحم. من هذه النتيجة، خلص الباحثون إلى أن هذه الهجرة متحولة المتضررين نحو جزيء محبة للدهون (وبشكل أكثر تحديدا، وهو هرمون، عامل النمو، أو خلوى) 7. ومن المعروف أن الهرمونات، عوامل النمو، والسيتوكينات تتوسط مسارات إشارات تشارك في تعزيز الورم والغزو 4. وبالتالي، فمن المهم للمحققين العلمي لتحديد ما عامل (ق) هي التي تقود غزو الورم من زنزاناتهم السرطان معينة أو المسوخ قيد الدراسة. تم تصميم مقايسة لمعالجة دور المكونات الفردية في تركيزهم الفسيولوجية كما هو محدد وفقا لاختلاف بين تركيز عنصر &amp;# 8220؛ X &quot;في FBS العادي وCS-FBS. من خلال تطوير هذا الفحص، يمكن المحققين كسب المزيد من التبصر في مسار محدد الغازية التي تحكم النظام الخاص بهم. وغالبا ما تصنف الهرمونات، عوامل النمو، والسيتوكينات كما المروجين الورم 8. وتستخدم بعض هذه العوامل مثل EGF كمصادر مباشرة للchemoattractants في غرف الغزو 9. وهكذا، يبدو من المرجح أن هذه تمثل المكونات الرئيسية للمصل أن غزو الورم المباشر. يقترح هذا البروتوكول بسيطة، ولكن كبير، تعديل التقليدية في المختبر فحص الغزو الذي يسمح محقق لتقييم مشاركة الهرمونات، عوامل النمو، والسيتوكينات في التوسط في إمكانية الغازية من الخلايا السرطانية. ومع ذلك، تم تصميم مقايسة لتوفير المحقق مع جوابا حول ما إذا كان الإجراء سوف تكون فعالة لدراستهم في خطوة مبكرة في التحليل، وذلك بعدم استخدام الوقت الثمين و resources إذا رأت لزوم لها. وتستخدم هذه الطريقة CS-FBS وتعتمد على تقدير المحققين على النحو الذي الجزيئات لمتابعة كمرشحين الرصاص التي يحتمل أن توسط غزو الخلايا السرطانية. ينبغي أن نتائج هذه التحليلات يثبت أنه مفيد في تحديد التي تخدم مكونات المصل كما chemoattractants أو مثبطات للخط خلية معينة أو متحولة التي تجري دراستها. وبالإضافة إلى ذلك، قد يساعد هذا النهج المحقق تحديد مسارات الإشارات الأساسية إما تشجيع أو تثبيط غزو الخلايا السرطانية. وبالتالي توجيه تصميم الأدوية في المستقبل.

<table><tbody><tr><td>إدراج التحكم BioCoat مع 8.0 & micro ؛ م غشاء PET</td><td>Corning</td><td>354578</td><td>12 في كل من لوحين بسعة 24 بئرا. PET = البولي إيثيلين تيرافثاليت</td></tr><tr><td>الكولاجين الأول ، ذيل الفئران</td><td>Corning</td><td>354236</td><td>المصدر = وتر ذيل الفئران ، النقاء = 90٪</td></tr> <tr><td>مثبت ؛ Diff-Quick</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>NC9844047</td> مثبت <td>قائم على الميثانول ، هيماتوكسيلين / يوزين</td></tr><tr><td>مصل بقري جنين</td><td>Life Technologies</td><td>16000</td><td>تم تعيينه على أنه</td></tr><tr><td>مصل بقري للجنين المجرد من فحم</td> FBS <td>Life Technologies</td><td>12676</td><td>تم تعيينه على أنه CS-FBS</td></tr><tr><td>مصل بقري للجنين</td><td>Thermo Scientific Hyclone</td><td>SH30070</td><td>تم تعيينه باسم FBS</td></tr><tr><td>مصل الأبقار الجنين المجرد بالفحم</td><td>Thermo Scientific Hyclone</td><td>SH30068</td><td>المعين على أنه CS-FBS</td></tr></tbody></table>

والتعديل<em&gt; في المختبر</em&gt; الغزو الفحص لتحديد الدور المحتمل للالهرمونات، السيتوكينات و / أو عوامل النمو في التوسط السرطان غزو الخلايا

A Modified In vitro Invasion Assay to Determine the Potential Role of Hormones, Cytokines and/or Growth Factors in Mediating Cancer Cell Invasion

يخدم مصل الدم كما جاذب كيميائي نحو الخلايا السرطانية التي تهاجر وتغزو، وتسهيل دخول الوعاء بهم إلى microvessels. ومع ذلك، تبقى جزيئات الفعلية نحو الخلايا التي تهاجر بعيد المنال. وقد تم تطوير هذا الفحص الغزو تعديلها لتحديد الأهداف التي تدفع الهجرة الخلية والغزو. هذه التقنية يقارن مؤشر الغزو تحت ثلاثة شروط لتحديد ما إذا كان هرمون معين، عامل النمو، أو خلوى يلعب دورا في التوسط في إمكانية الغازية من الخلايا السرطانية. وتشمل هذه الشروط ط) العادي مصل بقري جنيني (FBS)، والثاني)، الفحم جردت FBS (CS-FBS)، الذي يزيل الهرمونات، عوامل النمو، والسيتوكينات والثالث) CS-FBS + جزيء (الرمز &quot;X&quot;). وهناك تغير كبير في غزو الخلايا مع CS-FBS بالمقارنة مع FBS، يشير إلى تورط الهرمونات، والسيتوكينات أو عوامل النمو في التوسط في التغيير. ويمكن بعد ذلك أن تضاف الجزيئات الفردية إلى CS-FBS لفحص قدرتها على إعادةالآية أو إنقاذ النمط الظاهري الغزو. وعلاوة على ذلك، اثنين أو أكثر من العوامل يمكن الجمع بين لتقييم المضافة أو الآثار المستمرة للجزيئات متعددة في القيادة أو تثبيط الغزو. عموما، وهذه الطريقة تمكن الباحث من تحديد ما إذا الهرمونات، والسيتوكينات وعوامل / أو النمو تلعب دورا في غزو الخلايا من خلال خدمة كما chemoattractants أو مثبطات الغزو لنوع معين من الخلايا السرطانية أو متحولة محدد. من خلال تحديد chemoattractants ومثبطات محددة، قد هذا الفحص الغزو تعديل تساعد على توضيح مسارات الإشارات التي توجه غزو الخلايا السرطانية.

يتم حساب مؤشر غزو لكل حالة وفقا لتطبيع إلى خط الخلية موسع. لتجاربنا، ونحن نستخدم 1205Lu خط خلية سرطان الجلد وخطوط الخلايا مستقرة البديل أنشئت كخطوط الغازية لدينا فضلا عن البديل موسع للخبث، WM793 من التي كانت تستمد الخلايا 1205Lu 10 والتي هي بمثابة عنصر تحكم منطقية. ونحن أيضا استخدام الكولاجين أنا مثل المصفوفة الغزو لأن ذلك هو العنصر الأساسي في الأدمة. هذا هو وفقا لدراسة سابقة حيث مصفوفة الغزو المثلى يختلف على أساس خط الخلية ومدى التوافق مع المجراة النتائج ...

يصف مقال الفيديو هذا طريقة معدلة في المختبر لفحص دور الهرمونات و / أو السيتوكينات و / أو عوامل النمو في دفع غزو الخلايا السرطانية.

Blood serum serves as a chemoattractant towards which cancer cells migrate and invade, facilitating their intravasation into microvessels. However, the ...

الهدف العام من التجربة التالية هو إنشاء مقايسة مخبرية (in vitro) لفحص دور الهرمونات، أو السيتوكينات، أو عوامل النمو في تحفيز غزو الخلايا السرطانية. ويتم تحقيق ذلك من خلال تحديد ما إذا كان هناك فرق في مؤشر الغزو بين مختلف متغيرات الخلايا أو الطفرات في خطوة ثانية. وتُكرر مقايسة الغزو باستخدام وسط مُعالج بالفحم المنشط (charcoal stripped media)، والذي يعمل على إزالة أي هرمونات أو عوامل نمو أو سيتوكينات من المصل.يتم بعد ذلك تكرار مقايسة الغزو مع إضافة عامل محدد ومعروف إلى الوسط المنزوع بالفحم لتحديد ما إذا كانت الهجرة نحو ذلك العامل تعزز الغزو أو تثبطه. وتظهر النتائج التغيرات في مؤشر الغزو لمجموعات خلوية محددة والتي تحدث أثناء الهجرة نحو عوامل تجريبية معروفة، بناءً على تطبيع النتائج مقابل مؤشر الغزو لمجموعات خلوية غير غازية. لقد خطرت لي فكرة هذه الطريقة لأول مرة عندما كنت أجري مقايسة غزو تقليدية، ولاحظت وجود فرق معنوي بين مؤشرات الغزو لمطفرات خلوية مختلفة.تتمثل الميزة الرئيسية لهذه التقنية مقارنة بالطرق الحالية مثل مقايسة الغزو التقليدية، في أنها تتيح الاستقصاء الدقيق لدور الهرمونات وعوامل نمو محددة والسيتوكينات في تعزيز أو تثبيط غزو الخلايا. وقد تكون هذه الطريقة مفيدة في الإجابة على أسئلة جوهرية في مجال أبحاث السرطان، بما في ذلك تحديد العوامل التي تؤدي إلى انتشار السرطان. كما قد توفر تداعيات هذه التقنية نهجاً علاجياً لتصميم الأدوية في المستقبل. استخدم طبقاً يحتوي على 24 بئراً مع 12 قطعة إدراج (inserts) لكل خط خلوي سيتم اختباره.ثم قم بتسمية الأطباق وفقاً للشروط المراد تحليلها. بعد ذلك، وزع بعناية 75 µL من محلول مصفوفة كولاجين مُحضّر حديثاً في كل غشاء إدراج سيُستخدم في مقايسة الغزو، مع الحرص على عدم تكوين فقاعات. ثم قم بحضن الأطباق التي تحتوي على أغشية الإدراج المطلية بالكولاجين عند 37 °C و 5% carbon dioxide لمدة 30 دقيقة للسماح للهلام بالتصلب.بعد فصل الخلايا التجريبية باستخدام التريبسين، أضف الوسط المكمل بـ 10%FBS لتعطيل الإنزيم واغسل الخلايا ثلاث مرات في PBS. ثم أعد تعليق الراسب في وسط خالٍ من المصل وقم بعد الخلايا. أضف الوسط الخالي من المصل للوصول إلى تركيز نهائي قدره 50,000 خلية لكل ملليلتر عندما تتصلب مصفوفة الكولاجين.بعد مرور 30 دقيقة، أضف 700 µL من الوسط الذي يحتوي إما على 2%defined FBS أو 2%charcoal stripped FBS أو 2%charcoal stripped FBS بالإضافة إلى المكون الإضافي في كل بئر. أضف 500 µL من معلق الخلايا في وسط خالٍ من السيروم في الجزء العلوي من كل Insert للهجرة أو الغزو. حضّن المقاييس لمدة 22 ساعة عند 37 °C.ثم أضف الميثانول، والمادة المثبتة، والإيوسين، والهيماتين في ثلاث من الآبار الفارغة في لوحة الغرفة. بعد ذلك، قم بإزالة الخلايا والمصفوفة من الجزء العلوي من كل قطعة إدراج عن طريق مسحهما بمسحتي قطن متتاليتين. ثم باستخدام الملقط.اغمس كل قطعة إدخال خمس مرات، لمدة ثانية واحدة في كل مرة، في كل محلول من محاليل الصبغ الثلاثة على التوالي، واترك قطع الإدخال لتجف طوال الليل وهي مقلوبة. وفي اليوم التالي، استخدم عدسة شيئية بقوة 20x لالتقاط صور للخلايا الموجودة على قطع الإدخال من خلال الفحص المباشر لقطع الإدخال المصبوغة.يتم التقاط خمس صور لكل عينة، بما في ذلك أربع صور من الحقول الخارجية للغشاء وصورة واحدة من المركز. وأخيراً، وباستخدام برنامج Image J، يتم عد الخلايا في كل صورة وحساب مؤشر الغزو بعد تطبيعه بالنسبة لخط خلوي غير غازٍ. يوضح هذا النموذج النتائج المحتملة التي قد يتم مواجهتها أثناء مقايسة الغزو وكيفية تفسير البيانات المقابلة.توضح كل دائرة نتيجة ممثلة لمرشح مصبوغ من إحدى الحالات الثلاث التي تم اختبارها، وتمثل كل نقطة خلية نفذت عبر مصفوفة الغزو وتم صبغها على الجانب السفلي من الغشاء. بعد ذلك، يتم حساب مؤشر الغزو لكل حالة وفقاً لمعايرتها بالنسبة لخط خلوي غير غازٍ. على سبيل المثال، في هذه التجربة الممثلة، تم اختبار ثلاثة هرمونات لتحديد عامل x محتمل.لم يكن لهرمونين أي تأثير على مؤشر الغزو، بينما تم تحديد هرمون واحد أظهر خصائص تثبيطية. بمجرد إتقان هذه التقنية، يمكن تنفيذها في غضون أربع ساعات تقريباً في اليوم الأول وساعة واحدة في اليوم الثاني إذا تم تنفيذ جميع الخطوات بشكل صحيح. وأثناء استخدام هذه التقنية، من المهم وضع علامات تعريفية دقيقة على كل قطعة إدراج خلوية بعناية.استخدمنا نظاماً مرمّزاً بالألوان ونقاطاً مختلفة لتوسيم كل غرسة خلوية بعناية. وبناءً على ذلك، يمكن استخدام طرق أخرى مثل النماذج الفأرية في الجسم الحي (in vivo) لدراسة النقائل من أجل التحقق من النتائج التي تم الحصول عليها في المختبر (in vitro). بعد مشاهدة هذا الفيديو، سيكون لديك فهم جيد لكيفية تقييم الأهمية الفسيولوجية لعوامل مثل الهرمونات، وعوامل النمو، والسيتوكينات، سواء كانت معززة أو مثبطة لغزو الخلايا في نموذج مخبري (in vitro).نشكركم على اهتمامكم بالفيديو الخاص بنا، ونتمنى لكم التوفيق في تجاربكم.

a-modified-vitro-invasion-assay-to-determine-potential-role-hormones

Research

JoVE Journal

Medicine

الطب

يوصف لفحص لقياس كميا تحويل عامل النمو (TGF) - β بفعل الغزو في المواد الهلامية الكولاجين 3 الأبعاد. هذا الاختبار يستفيد من سلسلة MCF10A من خطوط الخلايا التي تمثل مراحل مختلفة من تطور مرض السرطان الثدي. ويمكن اعتماد هذه الطريقة ليتم استخدامها مع خطوط الخلايا الأخرى ، ويمكن استخدامها لتفعيل التحقيق المحتملين الآخرين أو مثبطات الغزو.

كروي الفحص لقياس TGF - β بفعل الغزو

نماذج لغزو الخلايا السرطانية في ثلاثي الأبعاد المصفوفة خارج الخلية تعكس على نحو...

النمذجة والتصوير 3 الأبعاد غزو الخلية الجماعية

يصف هذا الفيديو تقنية استخدام مصفوفة أصلية لدراسة غزو الخلايا السرطانية. توفر التقنية المستخدمة في هذا الاختبار القدرة على تقييم تفاعلات الخلايا الظهارية واللحمة المتوسطة في بيئة ثلاثية الأبعاد دون الحاجة إلى مصفوفة اصطناعية أو أجنبية.

فحص غزو الخلايا السرطانية: طريقة ثلاثية الأبعاد في المختبر تعتمد على المصفوفة الأصلية لتقييم تفاعلات الخلايا الظهارية واللحمة المتوسطة

تستخدم عادة، يتم وصف طرق للوصول للغاية لدراسة الهجرة الخلية والغزو في المختبر. الأسلوب الأول هو الجرح خلية إغلاق الفحص الذي يقيس حركية الخلية. الأسلوب الثاني هو transwell الهجرة والغزو الفحص أن يقيم الكيميائي والقدرة الغازية من الخلايا.

في المختبر الهجرة الخليوي والغزو فحوصات

غزو ​​الخلايا السرطانية في المبيض في بطانة الظهارية الصفاق هو عملية ديناميكية مع مرور الوقت. الاستفادة من وجود محلل في الوقت الحقيقي، والقدرة الغازية من خلايا سرطان المبيض في زنزانة نموذج التعاون ثقافة كروي-الظهارية يمكن قياس مدى فترات زمنية طويلة، وتوفير نظرة ثاقبة العوامل التي تنظم عملية النقيلي.

تقييم سرطان المبيض كروي مرفق وغزو الخلايا الظهارية في الوقت الحقيقي

غزو الأنسجة الطبيعية المحيطة هو سمة مميزة للأورام الخبيثة. نقدم هنا اختبارا بسيطا وشبه آليا للوحة الدقيقة للغزو في مصفوفة حيوية ثلاثية الأبعاد طبيعية تم تجسيدها بعدد من نماذج السرطانات البشرية المتقدمة.

ثلاثي الأبعاد (3D) ورم الجسم الشبه الكروي الغزو الفحص

هنا، نقدم بروتوكول لدراسة غزو الخلايا السرطانية إلى أجزاء يعيشون الأنسجة الطبيعية في ثلاثة أبعاد. يتم تطبيق هذه التقنية الثقافة الجهاز أساسا لاختبار الأدوية محتملة مكافحة الغازية في المختبر.

فرخ القلب الغزو الفحص لاختبار الغازية من خلايا سرطان وآخر للمركبات يحتمل مكافحة الغازية

تقوم هذه الطريقة بتقييم غزو الخلايا السرطانية من الكرات إلى مصفوفة ثلاثية الأبعاد محيطة.  يتم إنشاء الكرات الكروية عبر طريقة زراعة القطرات المعلقة ثم يتم تضمينها في مصفوفة تتكون من مواد الغشاء القاعدي والكولاجين من النوع الأول.  يتم مراقبة الغزو من الكرويات لاحقا.

خلية السرطان كروي الفحص لتقييم الغزو في إعداد 3D

ويصف هذا البروتوكول مقايسة غزو عمودي مقلوب التي يمكن أن تستخدم لقياس قدرات الهجرة وغزو الخلايا في أجواء ثلاثية الأبعاد مع الحفاظ على المكروية الخلية. هذا التحليل مناسبة لخلايا نادرة و/أو الحساسة.

تتحرك صعودا: بسيطة ومرنة في المختبر غزو ثلاثية الأبعاد مقايسة بروتوكول

يتم استخدام اختبار غزو الخلايا في المختبر لقياس إمكانات الانبثاث السرطاني من خلال قياس الإمكانات الخلوية للغزو والهجرة باستخدام إدراج ثقافة الخلايا التي تحتوي على مصفوفة البروتين. يتم تحدي الخلايا للهجرة من خلال مصفوفة البروتين والغشاء المسامي، نحو جاذبية كيميائية، ومن ثم قياسها كميا عن طريق الفحص المجهري الخفيف.

استخدام الخلايا السرطانية الثديية الماوس في مختبر الغزو الاختباري كمقياس لسلوك الخلايا الأنكجينية

الغزو هو ظاهرة بيولوجية رئيسية في تطور وتطور السرطان. تتأثر هذه العملية بالخلايا غير الورمية ومكونات البيئة المكروية للورم. الغرض من هذه الدراسة هو وصف طريقة بديلة لتحليل غزو الخلايا السرطانية في المختبر باستخدام الثقافات ثلاثية الأبعاد (3D).

استراتيجية بديلة لتحليل غزو الخلايا في المختبر من الثقافات 3D

تعلم تقييم غزو الخلايا السرطانية في المختبر باستخدام وسط مخلوط بالفحم لإزالة العوامل الذاتية. تساعد هذه الطريقة الباحثين على دراسة تأثير الهرمونات والسيتوكينات وعوامل النمو على انتشار السرطان.

والتعديل

استكشف المزيد من الفيديوهات