تقييد أنزيم الاستنساخ القائم على أسلوب لتقييم في المختبر القدرة تكرار HIV-1 النوع الفرعي C-الكمامة MJ4 همي الفيروسات

الهدف العام من هذا الإجراء هو دمج جينات الكمامة المشتقة من النوع الفرعي CHIV واحد الأفراد المصابين في النسخ المتماثل المختص فيروس نقص المناعة البشرية واحد البلازميد. من أجل تقييم تأثير تعدد أشكال تسلسل الكمامة على قدرة النسخ المتماثل لفيروس نقص المناعة البشرية في المختبر ، يتم تحقيق ذلك عن طريق تضخيم جين الكمامة أولا من بلازما المريض. الخطوة الثانية هي استنساخ تسلسل الكمامة المشتق من المريض في استنساخ الجزيئات المعدية المختصة MJ أربعة.

بعد ذلك ، يتم نقل البلازميد MJ four chimera من أجل توليد مخزونات فيروسية معدية وتحويلها لتقييم العدوى على خط خلية مؤشر. الخطوة الأخيرة هي قياس قدرة النسخ المتماثل في المختبر في خط الخلايا التائية G XR 25. في النهاية ، يتم استخدام مقايسة النسخ العكسي للراديو لتحديد إنتاج الفيروس بمرور الوقت من أجل تصور حركية النسخ المتماثل الفيروسي.

يمكن أن تساعد الطريقة التي سنصفها اليوم في الإجابة على الأسئلة الرئيسية في مجال فيروس نقص المناعة البشرية. وتشمل هذه تحديد محددات اللياقة التكاثرية لفيروس العوز المناعي البشري وفهم كيفية تأثير لياقة فيروس العوز المناعي البشري على التسبب في المرض على المدى الطويل. وصف الأساليب اليوم سيكون جيسيكا برينس ودان كلابان ، وهما اثنان من طلاب الدراسات العليا.

لبدء هذا الإجراء ، قم بعكس نسخ CDNA من الحمض النووي الريبي وتضخيم منتجات الحمض النووي للجولة الأولى باستخدام النسخ العكسي وبوليميراز الحمض النووي المستقر حراريا في RT PCR بخطوة واحدة. ثم باستخدام ميكرولتر واحد من تضخيم تفاعل البوليميراز المتسلسل في الجولة الأولى كقالب الحمض النووي ، قم بإجراء تضخيم تفاعل البوليميراز المتسلسل في الجولة الثانية المتداخلة. بعد ذلك ، أضف ثلاثة ميكرولتر من صبغة التحميل خمسة × إلى خمسة ميكرولتر من حجم تفاعل الجولة الثانية.

قم بتشغيله عند 120 فولت على 1٪ aros ، هلام TAE يحتوي على صبغة DNA فلورية للأشعة فوق البنفسجية حتى يتم حل العصابات. ثم تصور نطاقات 1.6 كيلوبايت على إضاءة الضوء الأزرق. بعد ذلك ، قم بتشغيل حجم التفاعل المتبقي 45 ميكرولتر على هلام TAE بنسبة 1٪ يحتوي على صبغة الحمض النووي.

قم باستئصال الأربطة المناسبة بشفرة حلاقة نظيفة واجمع بين ثلاثة ردود فعل إيجابية لكل فرد. بعد ذلك ، قم باستخراج الحمض النووي من شريحة الجل باستخدام مجموعة تنقية الهلام وقم بتقطيعه في الماء الخالي من النوكلياز. قم بتجميد المنتج عند درجة حرارة 20 درجة مئوية تحت الصفر لاستخدامه لاحقا في هذا الإجراء.

بعد تضخيم الطرف الطويل ، كرر خمسة مناطق UTR أولية من البلازميد الأربعة MJ. تصور منتجات PCR 1.3 كيلوبايت على المصباح ، وقم باستئصال مكبرات الصوت الموجبة ، ثم تنقيها وتجميدها كما هو موضح سابقا. بعد ذلك ، قم بإنشاء MJ أربعة LTR المدمجة عبر PCR لتمديد تداخل اللصق.

تصور واستئصال وتنقية وتجميد مكبر الصوت بطول 3.2 كيلو بايت. الآن هضم 1.5 ميكروغرام من MJ أربعة بلازميد و 1.5 ميكروغرام من منتج LTR gag PCR المنقى مع نوكلياز التقييد BCL لمدة 1.5 ساعة عند 50 درجة مئوية. بعد ذلك ، أضف ميكرولتر واحد من NGOM أربعة إلى تفاعل الهضم واحتضنه عند 37 درجة مئوية لمدة ساعة واحدة.

بعد ذلك ، أضف خمسة × صبغة تحميل إلى تفاعلات هضم التقييد. ببطء كهربائي الحجم الكلي على 1٪ aros ، هلام TAE يحتوي على صبغة الحمض النووي لمدة ساعة إلى ساعتين عند 100 فولت. تصور واستخراج وتنقية النطاقات المشار إليها للاستنساخ كما هو موضح سابقا.

بعد ذلك ، قم بإعداد تفاعلات الربط باستخدام هفوة LTR المنقى. أدخل MJ أربعة متجه DNA عند ثلاثة إلى واحد نسبة إدراج إلى المتجه. احتضان تفاعلات الربط بين عشية وضحاها عند أربع درجات مئوية.

ثم قم بتحويل JM 1 0 9 بكتيريا مختصة كيميائيا بمنتجات ربط منتشرة على ألواح اوجير LB ب 100 ميكروغرام لكل مليلتر. ينمو الأمبيسلين البكتيريا المحولة عند 30 درجة مئوية لمدة 22 ساعة على الأقل. لتأكيد دقة الاستنساخ ، قم بقص الحمض النووي الإعدادي المصغر باستخدام إنزيمات التقييد غير الحكومية M four و HPA في هضم مزدوج عند 37 درجة مئوية لمدة ساعتين.

بعد ذلك ، قم بتحليله على 1٪ aros. جل TAE. احسب حجم الفيروس المطلوب من كل مخزون بناء على الوحدة الدولية لكل عيار ميكرولتر من مقايسة خلية TZM BL من أجل إصابة خمسة في 10 إلى خامس G XR خمستين بعدوى متعددة 0.05.

تأكد من ارتداء معدات الحماية الشخصية المناسبة للعمل مع فيروس نقص المناعة البشرية المختص بالتكاثر ، والتي تشمل ثوبا كاملا وقناع للوجه وقفازات مزدوجة في يوم الإصابة. قم بإزالة مخزون الفيروسات من الفريزر 80 درجة مئوية تحت الصفر وقم بإذابة الثلج. بعد ذلك ، قم بتخفيف الفيروس في وسائط C-R-P-M-I إلى حجم 100 ميكرولتر.

من أجل تحقيق 0.05 وزارة الداخلية ، قم بإضافته إلى لوحة 96 بئر معالجة لثقافة الأنسجة vbo ، بما في ذلك كل من التحكم الإيجابي والسلبي في كل مجموعة من تجارب النسخ المتماثل وإعداد اللوحة بحيث يكون كل عمود آخر فارغا للحد من التلوث المتبادل بين الآبار. بعد ذلك ، قم بحساب GXR خليتين خمستين باستخدام عداد خلية آلي واحسب عدد الخلايا المطلوبة إجمالا لجميع الإصابات. قم بتقسيم الحجم المطلوب في أنبوب مخروطي سعة 50 مليلتر وجهاز طرد مركزي لتكسير الخلايا.

ثم قم بشفط الوسائط بعناية وأعد تعليقها في C-R-P-M-I بتركيز خمسة أضعاف 10 إلى الخلايا الخامسة لكل 100 ميكرولتر ، وقم بتقطيع الخلايا إلى حوض معقم واخلطها جيدا. بعد ذلك باستخدام ماصة متعددة القنوات، أضف 100 ميكرولتر من الخلايا في كل بئر من لوحة البئر 96 التي تحتوي على الفيروس المخفف وتخلط جيدا. بعد ذلك ، أضف ميكرولترين من خمسة ملليغرام لكل مليلتر من محلول بولي الدماغ إلى كل بئر واخلط الخلايا جيدا.

ثم احتضان عند 37 درجة مئوية في حاضنة زراعة الأنسجة مع 5٪ CO2 لمدة ثلاث ساعات لغسل الخلايا المصابة بالطرد المركزي. اللوحة السفلية 96 بئر V لتكوير الخلايا. ثم قم بإزالة 150 ميكرولتر من الوسط بعناية واستبدلها ب 150 ميكرولتر جديد من C-R-P-M-I دون إزعاج حبيبات الخلية.

كرر الإجراء مرتين أخريين لغسل الخلايا بشكل كاف بعد آخر طرد مركزي وإضافة 150 ميكرولترا من C-R-P-M-I لإعادة تعليق حبيبات الخلية باستخدام ماصة متعددة القنوات. أضف الخليط من كل بئر إلى 800 ميكرولتر من C-R-P-M-I في بئر من صفيحة زراعة الأنسجة 24 بئر. ثم ضع اللوحة في حاضنة زراعة الأنسجة بنسبة 5٪ CO2 عند 37 درجة مئوية كل يومين.

انقل 100 ميكرولتر من المادة الطافية من سطح المزرعة جيدا إلى بئر 96 بئر أسفل الصفيحة وقم بتجميدها للتحليل اللاحق باستخدام مقايسة RT ، ثم أعد تعليق الخلايا جيدا وقم بإزالة نصف الحجم المتبقي لمنع فرط نمو الخلية. بعد ذلك ، قم باستعادة الحجم الأصلي عن طريق إضافة 550 ميكرولتر من C-R-P-M-I الطازج إلى كل بئر في هذا الإجراء ، أضف واحدا إلى اثنين من ميكرولتر من 10 مليكوري لكل مليلتر من DTTP وأربعة ميكرولترات من مولر واحد DIO ثلاثة إيتول لكل مليلتر واحد من مزيج رئيسي لدينا. امزج بعناية كل أنبوب طرد مركزي دقيق سعة 1.5 ملليلتر من مزيج DTT الرئيسي RT و DTTP مع ماصة سعة 1000 ميكرولتر وانقله إلى حوض معقم.

بعد ذلك ، قم بتوزيع 25 ميكرولترا من RT المسمى. امزج في كل بئر من لوحة PCR رقيقة الجدران 96 جيدا. أضف خمسة ميكرولترات من كل مادة طافية إلى لوحة تفاعل البوليميراز المتسلسل التي تحتوي على مزيج RT الرئيسي. ثم أغلق لوحة PCR بغطاء رقائق لاصقة واحتضنها لمدة ساعتين عند 37 درجة مئوية في جهاز تدوير حراري بعد الحضانة ، وقم بعمل ثقوب صغيرة في غطاء الرقاقة باستخدام ماصة متعددة القنوات سعة 200 ميكرولتر.

امزج العينات خمس مرات. انقل خمسة ميكرولترات من كل عينة إلى ورق DE 81 واترك جميع العينات تجف في الهواء لمدة 10 دقائق. ضع البقع في حاويات غسيل منفصلة.

بعد ذلك اغسل البقع خمس مرات باستخدام XSSC واحد. ثم مرتين مع 90٪ من الإيثانول لمدة خمس دقائق لكل غسلة قبل تركها تجف في الهواء. بمجرد أن تجف ، لف اللطخة بعناية في غلاف ساران وقم بتعريضها لشاشة الفوسفو في شريط مغلق بإحكام طوال الليل في درجة حرارة الغرفة.

بمجرد أن تصبح جاهزا ، قم بتحليل شاشات الفوسفو باستخدام جهاز تصوير فوسفو وحدد النصوص المشعة. تفعيلك. فيما يلي صور الهلام التمثيلية التي تصور الفصل الكهربائي لمختلف أمبليكون تفاعل البوليميراز المتسلسل الضروري لتوليد أمبليكون هفوة مشتق من المريض قادر على استنساخه في العمود الفقري للبلازميد الرباعي MJ. تصور صورة الهلام التمثيلية هذه الفصل الكهربائي لهضم التقييد لاستنساخ جينات هفوة المريض إلى MJ أربعة.

وتصور هذه الصورة الهلامية التمثيلية الفصل الكهربائي للتقييد هضم هفوة منقاة MJ أربعة وهم البلازميد DNA. يوضح هذا الرسم البياني قابلية تكرار مقايسة النسخ المتماثل بمرور الوقت في G XR خطين من خمس خلايا. تم استخدام نفس الكمامة MJ أربعة فيروسات خيمرية لإصابة G XR ، وخليتين خمستين في تجربتين مستقلتين تم إجراؤهما بفارق عام تقريبا.

تم إنشاء درجات النسخ المتماثل عن طريق حساب ميل قيم DLU المحولة في السجل وتطبيع هذا المنحدر إلى النوع البري MJ أربعة. يرتبط القياسان المستقلان ارتباطا وثيقا ويسلطان الضوء على قابلية استنساخ المقايسات التي يتم إجراؤها في أوقات مختلفة ومع الخلايا في ممرات مختلفة. مهدت هذه التقنية الطريق للباحثين في مجال الإيدز لفيروس نقص المناعة البشرية لاستكشاف المحددات الفيروسية للتسبب في المرض.

في العدوى من النوع الفرعي C الحادة ، النوع الفرعي الأكثر انتشارا في جميع أنحاء العالم. يمكن أن يكون العمل مع النسخ المتماثل المختص بفيروس نقص المناعة البشرية خطيرا للغاية. يجب تنفيذ جميع الخطوات التي تنطوي على فيروس حي في منشأة BSL two plus.

يجب تطهير جميع الأسطح بانتظام وارتداء قفازات مزدوجة في جميع الأوقات.