تحليل Phosphopeptide من القوارض بربخي المني

الهدف العام من التجربة التالية هو تحديد تغيرات ببتيد الفوسفو التي تحدث داخل المنوية أثناء نضوج خلايا المنوية. يتم تحقيق ذلك عن طريق إزالة البربخ الملل من الفأر ، وإجراء التنظيف الخلفي للخلف لخلايا المنوية وجمع الخلايا في أنبوب شعري دقيق. بعد ذلك ، يسمح لخلايا المنوية بالسباحة إلى محلول ملح متوازن ، مما يتيح إزالة البروتينات الملوثة ، ثم يتم غسلها وترسبها من أجل إزالة الأملاح والدهون الملوثة.

يتم هضم البروتينات الجلدية باستخدام التربسين ثم يتم إثرائها باستخدام ثاني أكسيد التيتانيوم من أجل إثراء ببتيدات الفوسفو. تظهر النتائج تغيرات كمية في حالة فسفرة البروتينات بناء على الكروماتوغرافيا السائلة وتحليل الطيف الكتلي. يمكن أن تساعد هذه الطريقة في الإجابة على الأسئلة الرئيسية في مجال البيولوجيا التناسلية ، مثل ما هي التغيرات الفوسفوروبروتية أثناء عبور المنوية لأجهزة التحصين الموسع أو أثناء السعة.

على الرغم من أن هذه الطريقة قدمت نظرة ثاقبة لبيولوجيا خلايا المنوية ، إلا أنه يمكن تطبيقها أيضا على الكائنات الحية النموذجية ، ودراسات الأمراض مثل السرطان ، والأمراض العصبية ، ومسارات نقل الإشارات العامة. يعد العرض المرئي لهذه الطريقة أمرا بالغ الأهمية لأنه من الصعب تحديد تشريح المناطق التي سيتم فيها التلاعب ب EPIs. ابدأ بصنع 200 مل من محلول ساق بيجرز أو ويتن وويتن أو BWW عن طريق إضافة ما يلي إلى لتر واحد من ماء Milli Q لصنع قنية.

استخدام أنابيب البولي إيثيلين بأقطار داخلية وخارجية 0.4 ملم و 1.1 ملم على التوالي. امسكها على نار خفيفة حتى يبدأ الأنبوب في الذوبان. اسحب نهايات الأنبوب على الفور للخارج لتمديده ، وبالتالي تقليل القطر الخارجي.

قم بقص الأنبوب لإنتاج تضييق في أحد طرفيه ، مما سيسمح بتسهيل قنية S deens. قطع الطرف المقابل إلى حوالي 15 سم. ثم أدخل إبرة قياس 30 في الطرف الحاد ، وقم بإرفاق حقنة ثلاثة ملليلتر متراجعة بالكامل.

اصنع قطعة لسان حال الشفط عن طريق قطع أنبوب البولي إيثيلين بطول 20 سم وإدخاله في أحد طرفي القنية. أدخل حامل الأنبوب الزجاجي الشعري الصغير والشعرية الزجاجية الصغيرة. بعد القتل الرحيم للفأر وفقا لبروتوكول النص ، قم بعمل شق صغير في كيس الصفن لفضح epi.

ثم استخدم زوجا من صانعي الساعات. عدد خمسة ملقط لسحب الخصية والبربخ من التجويف. قم بقص لإزالة كل ما عدا حوالي سنتيمتر إلى سنتيمترين من الاحترام الكبير من كاتا البربيه.

ثم قم بقص لإزالة قنوات EENT القريبة والأنسجة التي تربط البربخ بالخصية وإزالة المسار التناسلي الذكري بالكامل تحت مجهر تشريح باستخدام تكبير يتراوح بين خمسة × و 40 ×. ضع سنتيمترا إلى سنتيمترين من الطرف الضيق للقنية في مجال الرؤية واستخدم شريطا لتثبيتها بملقط صانع الساعات رقم خمسة. امسك برفق كل جانب من جوانب الاحترام الواسع واسحبه فوق الجزء المرئي من القنية.

ثم باستخدام الحرير المضفر الأسود غير القابل للامتصاص، اربط عقدة محكمة حول الأنسجة المقنية باستخدام صانعي الساعات. ملقط رقم خمسة. أمسك بالطرف البعيد من كاتا إيبي إيدس وقم بإزالة الغلالة يوجينيا.

من أجل كشف نبيبات بشرة واحدة ، قم بتعريض النبيبات برفق وفصلها عن بعضها البعض لإنشاء فتحة لإطلاق المنوية. بعد ذلك ، اضغط برفق على مكبس المحقنة لطرد الهواء إلى الاحترام الواسع. سيؤدي الضغط إلى خروج المنوية من النبيبات المكسورة.

ثم ضع الشفط على لسان حال لسحب المنوية إلى الشعيرات الدموية الزجاجية. انفخ برفق في قطعة الفم أو قم بإرفاق حقنة وطرد المنوية من الشعيرات الدموية الزجاجية إلى مليلتر واحد من محلول B WW قبل الحرب. واستخدم المحلول لغسل الخلايا ثلاث مرات لإزالة أي بروتينات ملوثة.

بعد إزالة الغسيل النهائي ، قم بتجميد المنوية لاستخدامها لاحقا أو استخدم 4٪ فصول ، واثنين من اليوريا المولار ، و 50 ملليمولار تريس درجة الحموضة 7.4 لإذابة البروتينات التي تحتضن لمدة ساعة واحدة مع دوامة متقطعة. ثم قم بالطرد المركزي للمحلول عند 10 ، 000 GS لمدة 20 دقيقة وانقل المادة الطافية إلى أنبوب جديد لتقليل روابط ثاني كبريتيد وألكل البروتينات في DTT بتركيز نهائي قدره 10 مللي مولار لمحلول البروتين. دوامة واحتضانها في درجة حرارة الغرفة لمدة 30 دقيقة.

ثم أضف 50 ملليمولار من أسيتاميد IO إلى دوامة المحللة واحتضانها لمدة 30 دقيقة في درجة حرارة الغرفة في الظلام. لترسيب البروتينات ، اجمع بين حجم واحد من المحللة ، وحجم واحد من الميثانول ، و 0.5 حجم من الكلوروفورم. بعد دوامة العينة ، قم بتدويرها بسرعة 10 ، 000 جي ثانية لمدة دقيقتين ، واجمع الطبقة العليا ، واترك حوالي ملليمترين لتجنب شفط الواجهة.

بعد إضافة حجم واحد من الميثانول ، اقلب الأنبوب برفق وقم بالدوران مرة أخرى. تخلص من المادة الطافية وجفف الحبيبات بالهواء لمدة ثلاث إلى أربع دقائق لإجراء التربسين والهضم وتخصيب الببتيد الفوسفو. ابدأ باستخدام بيكربونات الأمونيوم 25 مللي مولار تحتوي على يوريا مولية واحدة.

لإعادة تكوين التربسين ، امزج F 50 إلى وزن واحد لكل وزن من البروتين إلى التربسين واحتضنه على خلاط حراري عند 37 درجة مئوية و 700 دورة في الدقيقة بين عشية وضحاها. بعد الغزل لحبيبات المادة غير المهضومة ، انقل المادة المطفية إلى أنبوب جديد. باستخدام المخزن المؤقت DHB المحضر وفقا لبروتوكول النص ، قم بتخفيف الببتيدات المحاولات عشرة أضعاف وقم بتطبيقها على 200 ميكروغرام من حبات ثاني أكسيد التيتانيوم الجافة التي تحتضن على دوار لمدة ساعة واحدة في درجة حرارة الغرفة بعد الحضانة ، استخدم المخزن المؤقت DHB لغسل العينة مرة أخرى قبل استخدام مخزن الغسيل الذي يتكون من 80٪ A CN و 2٪ TFA لغسل العينة ثلاث مرات بعد الطرد المركزي النهائي لتصفية ببتيدات الفوسفو بواسطة إضافة 2.5٪ هيدروكسيد الأمونيوم مباشرة بعد الغزل وجمع المادة الطافية.

استخدم 0.3 ميكرولتر من حمض الفورميك لتحمض العينة كما هو موضح هنا. تتمثل إحدى ميزات هذا البروتوكول في عزل المنوية. في حالة الهدوء ، تتكتل العديد من الخلايا بعد الطرد مباشرة في وسط B WW.

ومع ذلك ، بعد 10 دقائق ، تصبح مشروطة ويصبح المحلول متجانسا. ينتج المستحضر الموصوف في هذا الفيديو عادة 200 في 10 إلى ستة زوا. يوضح هذا الشكل نقاء المنوية من الفئران AR Cota Epididymus.

إحدى القضايا الرئيسية المتعلقة بإعداد العينة هي العائد من الرحلات والهضم. على عكس ترسيب TCA ، والذي يتطلب غالبا تعديل درجة الحموضة للعينة ، فإن ترسيب كلوروفورم الفينول سريع ولا يحمض العينة الموضحة هنا هي حبيبات البروتين التي تظهر عادة من 100 ميكروغرام من العينة بين الواجهة السفلية والعلوية الموضحة. هنا قابلية استنساخ هذا البروتوكول.

الخطوط الزرقاء التي تظهر بمرور الوقت هي ببتيدات تلمح إلى عمود نانو C 18. مع زيادة تركيز الأسيتونيتريل في عدد المشروطات ، توجد مجموعة ببتيد عند حوالي 651.5 دالتون غائبة تماما في النطاق غير المحدد. بمجرد أن يكون بروتوكول تخصيب ببتيد الفوسفات تقنية فعالة.

أثناء محاولة هذا الإجراء ، من المهم أن تتذكر أن تحضير العينة هو جانب رئيسي للحصول على نتائج قابلة للتكرار للبروتينات. يمكن تكييف هذه الطريقة لعزل البروتينات السكرية ، والتي يمكن استخدامها للإجابة على أسئلة إضافية مثل البروتينات التي تخضع لتغيير في محتوى حمض السيك في البروتينات.