نموذج الفأر لالتهاب الناجم عن مسببات الأمراض المزمنة في مواقع المحلية والجهازية

الهدف العام من البروتوكول التالي هو فحص آثار العدوى الميكروبية على الالتهاب المزمن في الجسم الحي باستخدام نموذج حيواني ذي صلة من الناحية الفسيولوجية. يتم تحقيق ذلك عن طريق إصابة الفئران عن طريق الفم بالبورفيروموناس اللثة للحث على التهاب مزمن موضعي وجهازي. يمكن بعد ذلك استخدام التصوير بالرنين المغناطيسي لقياس تطور الالتهاب الجهازي في الحية ، بينما يتم تقييم فقدان العظام الالتهابي الموضعي عن طريق التصوير المقطعي المحوسب الصغير ويمكن تصور لويحات تصلب الشرايين عن طريق تلطيخ دهون الوجه بعد التضحية.

في النهاية ، يمكن قياس الاختلافات في حجم العظام السنخية وتراكم لويحات تصلب الشرايين بين الفئران المصابة ب P gingivalis والضوابط غير المصابة بناء على تحليل التصوير المقطعي المحوسب الدقيق وتلوين دهون الوجه على التوالي. الميزة الرئيسية لنموذجنا الحيواني هي أنه يسمح لك بفحص كل من الآليات المضيفة والممرضة المشاركة في الالتهاب المزمن وتحديدا في المواقع البعيدة عن العدوى. حتى تتمكن من إلقاء نظرة على المواقع الجهازية وكذلك المواقع المحلية للعدوى باستخدام الفئران المعدلة وراثيا والطفرات البكتيرية المحددة.

يمكن أن يساعد هذا النموذج في تحديد الجوانب الرئيسية للتسبب في المرض ، مثل العوامل المضيفة والميكروبية التي تساهم في المرض. على الرغم من أن هذه الطريقة يمكن أن توفر نظرة ثاقبة على المضيف المحدد وآليات مسببات الأمراض المشاركة في فقدان العظام الالتهابي وتصلب الشرايين ، إلا أنه يمكن أيضا تكييفها مع نماذج الفئران الأخرى للأمراض ، بما في ذلك التهاب المفاصل الروماتويدي والسكري والسرطان. هذه هي المنشأة الأساسية للتصوير بالرنين المغناطيسي عالية المجال لجامعة بوسطن ، وسيقوم زميلي في مرحلة ما بعد الدكتوراه نينغ بإظهار جوانب تصوير الفئران عن طريق وضع سيقان مجمدة من اللثة الخوخية 3 81 على ألواح أجار الدم اللاهوائية ، واحتضان الصفائح في غرفة لاهوائية عند 37 درجة مئوية.

بعد ثلاثة إلى خمسة أيام ، استخدم الكائنات الحية المزروعة على اللوحة لتلقيح خمسة مليلتر من مزارع سائل من مرق تسريب القلب في الدماغ ، أو BHI. بعد النمو بين عشية وضحاها ، انقل الثقافات إلى 45 مل من BHI واحتضان الثقافات بشكل لاهوائي لمدة 18 إلى 24 ساعة إضافية. في منتصف مرحلة السجل ، قم بحصاد البكتيريا عن طريق الطرد المركزي لمدة 10 دقائق عند 7 ، 000 GS ودرجة حرارة الغرفة ، ثم أعد تعليق الحبيبات تماما في خمسة ملليلتر من PBS باستخدام ماصة مصلية بعد غسل الحبيبات ثلاث مرات في 50 مل من PBS Resus ، الحبيبات في PBS بحيث يكون التخفيف من واحد إلى 10 للثقافة كثافة بصرية تبلغ 1.0 عند 660 نانومتر.

ثم قم بإخراج ما يكفي من كربوكسي ميثيل السليلوز متوسط اللزوجة لتحقيق محلول وزن بنسبة 2٪ إلى الحجم وإضافة إيثيل السليلوز ببطء إلى التعليق البكتيري أثناء الدوامة لتجنب التكتل. لقياس تطور الالتهاب في C الثاني. ضع أولا حامل برأس الفأر في وضع ضعيف في مسبار رأسي 30 ملم وفي التجويف الرأسي لماسح ضوئي 11.7 TMRI.

بعد عمليات التذبذب واللمعان ، استخدم تسلسلا نادرا للحصول على صور استكشافية على طول ثلاثة اتجاهات متعامدة لإنشاء صور إكلية وسهمية محورية. ثم بعد استخدام تصوير الأوعية بالرنين المغناطيسي منخفض الدقة للتأكد من أن الصور المكتسبة داخل المنطقة المستهدفة ، قم بإجراء تصوير الأوعية بالرنين المغناطيسي عالي الدقة للشريان غير المسمى مع تسلسل صدى متدرج ثلاثي الأبعاد غير متصل باستخدام المعلمات التالية. سمك البلاطة 1.5 سم ، وزاوية قلب 45 درجة ، ووقت تكرار 20 مللي ثانية ، ووقت صدى 2.2 مللي ثانية ، ومجال رؤية 1.5 × 1.5 × 1.5 سم ، ومصفوفة 1 28 × 1 28 × 1 28 ، وعدد من المتوسط أربعة لوقت مسح إجمالي يبلغ حوالي 22 دقيقة.

ثم حدد صورة محورية للشريان المقوم بمقدار 0.3 إلى 0.5 ملم أسفل التشعب تحت الترقوة لتحليل عائد الاستثمار لتثبيت الشريان الأورطي ، مع الحفاظ على الأنسجة مغطاة في PBS في جميع الأوقات. ابدأ بوضع الشريان الأورطي في الوضع التشريحي مع بصيلات الشريان الأورطي على اليسار. ثم ضع دبابيس منوشين المؤقتة على التوالي في المواقع الخمسة التالية ، الجزء العلوي من الشريان الأورطي أسفل الفرع الثالث من القوس ، في منتصف طريق الشريان الأورطي الهابط بالقرب من الطرف السفلي من الشريان الأورطي الهابط وفوق فرع الشريان الفخذي.

بعد ذلك ، استخدم مقصا زنبركيا دقيقا للغاية لقطع الجانب الأيسر من الشريان الأورطي بدءا من الفرع الأيسر من الشريان الفخذي وصولا إلى أسفل الفرع السفلي من الشريان الأورطي الصاعد. ثم بعد قطع وتثبيت كل فرع لفضح سطحه الداخلي ، استمر في تثبيت الأنسجة. السطح الداخلي بأكمله مكشوف ومرئي بوضوح من الأعلى وخالي من التداخل البصري من المسامير.

لتلطيخ الدهون وتحديد الآفات ، ابدأ بتغطية الشريان الأورطي المثبت بمحلول سودان فور طازج أو زيت أحمر. بعد 50 دقيقة ، اغسل المنديل بنسبة 70٪ من الأيزوبروبانول لمدة دقيقة إلى خمس دقائق ، ثم اشطف الشريان الأورطي برفق بالماء المقطر المزدوج حتى يختفي الماء الخارج من الأنسجة باللون الأحمر. بعد ذلك ، قم بتغطية الشريان الأورطي ب PBS وضع مسطرة بجوار الأنسجة للمساعدة في معايرة الصورة.

ثم التقط صورا للأنسجة باستخدام الكاميرا عالية الدقة المتصلة بمجهر تشريح ، واحفظ الصور كملفات TIFF. أخيرا ، في برنامج تحليل الصور ، تتبع كل سطح حميمي يدويا لتحديد مساحته. ثم لحساب منطقة الآفة باستخدام عتبة الألوان الآلي ، قم بتعيين عتبة لكل صورة لتحديد شدة اللون التي تميز الآفات عن المناطق الطبيعية.

يمكن بعد ذلك حساب النسبة المئوية للسطح الحميمي الذي تغطيه آفات تصلب الشرايين في هذه التجربة التمثيلية مع الفئران المصابة ب p gingivalis. كشف التحليل الحجمي أن الفئران المصابة تظهر فقدانا كبيرا في العظام مقارنة بالضوابط غير المصابة. يوضح الفحص البصري للفك العلوي النصفي المعاد بناؤه زيادة في مساحة السطح المكشوفة للجذور المولية في الفئران المصابة مقارنة بالسيطرة على التعرض لتصلب الشرايين.

فئران تعاني من نقص POE. تسبب اللثة P التهابا مزمنا يؤدي إلى فقدان العظام السنخية وترسب اللويحات الالتهابية داخل الجيب الأبهري والشريان الاسمي في وقت مبكر يصل إلى 24 ساعة بعد آخر عدوى ، والتي يمكن مراقبتها في الفئران الحية عن طريق التصوير بالرنين المغناطيسي التسلسلي في الجسم الحي في نقاط زمنية مختلفة بعد العدوى كما في هذه الصور التمثيلية. علاوة على ذلك ، أظهرت قياسات الوجه للسودان الشريان الأورطي المكون من أربعة بقع أن عدوى p اللثة تزيد بشكل كبير من ترسب الدهون ومناطق الآفة على السطح الداخلي.

بالإضافة إلى ذلك ، يكشف التحليل الكيميائي المناعي لآفات الجيوب الأنفية الأبهرية عن زيادة تسلل الميكروفاج والتعبير المرتفع عن المستقبلات الشبيهة بالحصيلة للمستقبلات المناعية الفطرية اثنين من الفئران المصابة بالوريد. أثناء محاولة هذا الإجراء ، من المهم مراعاة المدة التجريبية ، يجب أن تتوافق النقاط الزمنية التي يتم فيها تقييم الالتهاب بشكل مناسب مع تطور المرض. بعد التصوير بالرنين المغناطيسي للآخرين ، يمكن إجراء طرق أخرى مثل الوقوف على الوجه أو كيمياء الأنسجة المناعية للإجابة على أسئلة إضافية مثل عبء تصلب الشرايين العالمي أو المكونات الخلوية للآفة.

بعد مشاهدة هذا الفيديو ، يجب أن يكون لديك فهم جيد لنموذج الفأر في الجسم الحي ، والذي يسمح لك بفحص كل من العوامل المضيفة والممرضة المشاركة في الالتهاب المزمن. لا تنس أن العمل مع مسببات الأمراض يمكن أن يكون خطيرا للغاية وأن الاحتياطات مثل الاستخدام السليم لمعدات الوقاية الشخصية يجب دائما اتخاذ أثناء تنفيذ هذا الإجراء.