مظاهرة من بروتين تفعيل قناة الصوديوم الظهارية (عناق) من خلال الجمع بين المقاييس الحالية مع الكشف عن الشق شظايا

الهدف العام من التجربة التالية هو استقصاء تأثير البروتياز على قناة الصوديوم الظهارية أو ENaC التي يتم التعبير عنها بشكل غير متجانس في الخلايا البيضية لضفدع Xenopus laevis. ويتم تحقيق ذلك من خلال قياس التيار الخلوي الكامل الحساس للأمiloride أولاً في الخلية البيضية. وبعد السماح للخلية البيضية بالتعافي، يتم تعريضها للبروتياز وقياس التيار مرة أخرى.

بعد ذلك، يتم بيوتينة البويضات بالتوازي وإخضاعها لتقنية لطخة ويسترن لمراقبة ظهور شظايا انقسام gamma ENaC على سطح الخلية، وتظهر النتائج التي تم الحصول عليها وجود صلة سببية بين انقسام القناة وتنشيطها، وذلك استناداً إلى الجمع بين تقنية تثبيت الجهد ثنائي القطب ومنهج البيوتينة. وتتمثل الميزة الرئيسية لهذه التقنية مقارنة بالطرق الحالية مثل القياس غير المخطط له، في إمكانية تعريض البويضة للبروتياز أو العوامل الدوائية الأخرى بين القياسين لفترات زمنية متفاوتة في حجم صغير من محلول الاختبار. بعد يومين من عزل بويضات Xenopus laevis وحقنها بـ CN وفقاً للبروتوكول المذكور، استخدم ND 96 لملء حقنة واحدة من نظام تروية بالتغذية الجاذبية، وND 96 يحتوي على amide لملء حقنة ثانية.

بعد تثبيت المحاقن على ارتفاع 50 سنتيمتراً فوق غرفة الحمام، قم بتشغيل مصدر ضوء هالوجين بارد بقدرة 150 وات واضبطه ليكون على ارتفاع 10 سنتيمترات فوق غرفة حمام الخلايا، بما يسمح برؤية جيدة باستخدام المجهر الثنائي. قم بتشغيل جهاز الشفط وضع أنبوب الشفط في الجهة المقابلة لمحول أنبوب الإرواء الفائق في غرفة حمام البويضات. بعد ذلك، وباستخدام جهاز التحكم في تدفق الجاذبية للحقن الوريدي، اضبط سرعة الإرواء الفائق لكل محلول لتكون من 3 إلى 5 ملليلتر في الدقيقة. ثم، باستخدام محول، قم بتوصيل أنابيب الإرواء الفائق بغرفة حمام البويضات باستخدام شعيرات زجاجية مسحوبة مجهرياً للحصول على أقطار رؤوس تقل عن 1 ميكرومتر.

ثم استخدم كلوريد البوتاسيوم بتركيز ثلاثة مولار لملئها حتى الربع تقريباً. أدخل الشعيرات في حاملات الأقطاب الكهربائية لقطب التيار وقطب الجهد، وباستخدام الميكرومانيبولاتور (المتحكمات الدقيقة)، ضعها في ND 96 يحتوي على محلول Amide بتركيز اثنين ميكرومولار. لقياس تيارات الخلية الكاملة الحساسة لـ amide، ابدأ بضبط زر إزاحة VM لتصفير جهد قطب الجهد، وزر إزاحة VE لتصفير قطب التيار.

ضع موقع UO في غرفة الحمام على مقربة من قطب استشعار الجهد. ثم باستخدام كلا القطبين الدقيقين، قم بثقب موقع UO برفق، واضبط جهد التثبيت في المضخم على 60- millivolts وقم بتشغيل مسجل المخططات. بعد ذلك، قم بتشغيل المحلول المحتوي على الأميد.

بعد ذلك، ابدأ التسجيل، وقم بتعديل الكسب (gain) إذا لزم الأمر. بعد أن يصل التيار المقاس إلى هضبة مستقرة، انتقل إلى المحلول الخالي من الأميد. وبمجرد الوصول إلى هضبة التيار، أعد تحويل التروية إلى المحلول المحتوي على الأميد. ثم بعد أن يصل تيار موقع UO إلى تيار الخط القاعدي الأولي، قم بإيقاف تثبيت الجهد واسحب الأقطاب الكهربائية برفق للسماح بإعادة إغلاق الغشاء البلازمي في مواقع الاختراق.

ضع موقع Uoc في بئر واحد من طبق يحتوي على 96 بئراً، على أن يحتوي البئر على 100 إلى 150 µL من محلول ND 96 الخالي من البروتياز لمدة خمس دقائق، قبل نقل موقع UOC إلى محلول يحتوي على البروتياز أو إلى محلول ضابط خالٍ من البروتياز. ولمدة 30 دقيقة بعد التحضين، كرر القياس الحالي، وتخلص من البويضات التالفة تحت المجهر الستيريو، وجهز anti 96 مع وبدون البروتياز المناسب. جهز الماصات الرعوية عن طريق وضع علامات عليها وتعريض أطرافها للهب سريعاً لتجنب إصابة البويضات.

املأ كل بئر من أطباق الزرع ذات الستة آبار بـ 2.5 milliliters من وسط ND 96 بدرجة حرارة الغرفة، أو وسط ND 96 الذي يحتوي على البروتياز. ثم أضف 30 بويضة لكل بئر واتركها في الحضانة لمدة 30 دقيقة في درجة حرارة الغرفة. بعد إضافة 2.5 milliliters من وسط ND 96 إلى آبار طبق زرع سداسي جديد، انقل كل مجموعة من البويضات إلى بئر مملوء بوسط ND 96.

انقل الخلايا بالتتابع إلى بئرين إضافيين يحتويان على ND 96 لغسل أي بروتياز متبقٍ، ثم حضّنها في البئر الأخير لمدة خمس دقائق، وقم بتحضير البيوتين في محلول استخلاص البيوتين (biotin elation buffer) وفقاً للبروتوكول المكتوب. وبعد وضع كل مجموعة من البويضات في بئر يحتوي على 2.5 milliliters من محلول استخلاص البيوتين، حضّنها لمدة 15 دقيقة مع التقليب اللطيف. ثم بعد وضع كل مجموعة من البويضات في بئر يحتوي على 2.5 milliliters من محلول الإخماد (quench buffer) لإيقاف تفاعل البيوتين، انقلها إلى بئر ثانٍ من محلول الإخماد وحضّنها لمدة خمس دقائق.

بتحريك لطيف، انقل كل مجموعة من البويضات إلى أنبوب طرد مركزي دقيق سعة 1.5 milliliter، وباستخدام one milliliter من محلول التحلل (lysis buffer)، المدعم بمثبطات البروتياز، قم بتحليل الخلايا بتمريرها عبر إبرة قياس 27 gauge. قم بطرد نواتج التحلل مركزياً لمدة 10 دقائق عند 1500 ×g. انقل السائل الأعلى (supernatant) إلى أنبوب جديد سعة 1.5 milliliter يحتوي على TRITTON X 100 و MP 40، واحضن الأنابيب على الثلج لمدة 20 دقيقة. قم برج الأنابيب باستخدام جهاز vortex بشكل متكرر لإذابة البروتينات؛ وبعد موازنة 100 µL من حبيبات vagaro لكل مجموعة بويضات، أضفها إلى محاليل البروتين والمنظفات واحضن العينات مع تدوير علوي عند درجة حرارة 4 °C طوال الليل.

في اليوم التالي، يتم وضع العينات في جهاز الطرد المركزي لمدة ثلاث دقائق عند 1500 ×g. ثم يُنقل السائل الطافي إلى أنبوب جديد للكشف عن شظايا انقسام act على سطح الخلية. يتم تحضير عينات الهلام باستخدام محلول التحلل لغسل الخرز ثلاث مرات قبل إضافة منظم عينات 2X SDS-PAGE. وبعد طرد العينات مركزياً لمدة ثلاث دقائق عند 20,000 ×g، يُنقل السائل الطافي بواسطة الماصة إلى أنابيب طرد مركزي دقيقة جديدة.

قم بتحليل العينات باستخدام لطخة ويسترن (western blot) وفقاً للبروتوكول المكتوب لبحث ما إذا كان البروتياز البلازمين (plasmin)، وهو من نوع السيرين، قادراً على تنشيط التيارات التي يتوسطها ENaC. تم تحديد delta IE لكل خلية تعبر عن ENaC قبل وبعد تحضين الخلايا لمدة 30 دقيقة في محلول خالٍ من البروتياز أو محلول يحتوي على البلازمين. وباستخدام تقنية تثبيت الجهد ثنائية القطب (two electrode voltage clamp) كما هو موضح هنا، أدى التعرض للبلازمين إلى زيادة delta IE في كل خلية تم قياسها.

في المقابل، كان للحضن في محلول خالٍ من البروتياز تأثير ضئيل. تقارن هذه الصورة تأثير chio trypsin على ENaC من النوع البري وعلى ENaC ذات مواقع قطع طافرة لبروتيني prostasin وplasmin. كما يظهر هنا، فإن القناة الطافرة تؤخر وتقلل من تنشيط التيار الذي يتوسطه ENaC بواسطة chio trypsin.

بالإضافة إلى ذلك، فإنها تولد قطعة انشطار بمعدل منخفض مقارنة بنوع ENaC البري. بعد مشاهدة هذا الفيديو، يجب أن يكون لديك فهم جيد لكيفية استخدام مجموعة من الطرق الموصوفة لربط التأثير التحفيزي للبروتياز على الحدوث الداخلي بحدوث منتجات الانشطار على سطح الخلية. قد يكون هذا مفيداً لنطاق واسع من التطبيقات، على سبيل المثال، لمعالجة أسئلة مماثلة تتعلق بتنظيم القنوات الأيونية الأخرى أو الناقلات أو المستقبلات عبر الغشائية.