خالية من التغذية اشتقاق الخلايا العصبية كريست السلف من افرة القوة البشرية الخلايا الجذعية

الهدف العام من هذا الإجراء هو توليد خلايا سلفية للقمة العصبية من الخلايا الجذعية البشرية متعددة القدرات في بروتوكول قصير قابل للتكرار والتحديد. يمكن بعد ذلك استخدام هذه الخلايا إما لدراسة الأمراض المرتبطة بالقمة العصبية في المختبر أو التمايز المستمر لهذه الخلايا إلى خلايا ذرية. يتم تحقيق ذلك عن طريق طلاء كثافة عالية من الخلايا الجذعية البشرية متعددة القدرات أولا في طبقة أحادية على ماتريجل.

الخطوة الثانية هي تمييز الخلايا إلى خلايا ظهارية عصبية باستخدام تسلسل محدد ومجموعة من الجزيئات الصغيرة التي تؤثر على مسارات الإشارات الرئيسية. بعد ذلك ، يتم إعادة طلاء الخلايا الظهارية العصبية وتمايزها إلى خلايا سلف للقمة العصبية. الخطوة الأخيرة هي عزل خلايا القمة العصبية باستخدام فرز الخلايا المنشطة بالفلورة.

في النهاية ، يتم استخدام التألق المناعي والمقايسات الوظيفية مثل قدرة الخلية على الهجرة لإظهار أن خلايا القمة العصبية المناسبة قد تم إنشاؤها. الميزة الرئيسية لهذه التقنية على البروتوكولات الحالية لاشتقاق خلايا القمة العصبية من الخلايا الجذعية البشرية متعددة القدرات هي أنها أقصر. إنها 18 يوما فقط.

إنه أكثر قابلية للتكرار بسبب عدم وجود خمس خلايا مغذية للتصلب العصبي المتعدد. من السهل ترقيته وهو قابل للتكاثر بدرجة كبيرة بين خطوط الخلايا الجذعية البشرية متعددة القدرات. تمتد الآثار المترتبة على هذه التقنية إلى دراسات آليات الأمراض البشرية المتعلقة بنسب الخلايا العصبية وتظهر إمكانية تحسين التفاصيل في النمذجة المختبرية وفحص الأدوية لهذه الأمراض.

قبل البدء ، تأكد هذا البروتوكول من أن مستعمرات الخلايا الجذعية البشرية متعددة القدرات كبيرة بما يكفي لرؤيتها بالعين ولا يزال لها حواف حادة مع عدد قليل من الخلايا المتمايزة على حدودها. ثم عندما تكون H PSCs جاهزة للتقسيم ، قم بشفط الغسيل المتوسط مرة واحدة بخمسة ملليلتر من XPBS واحد وأضف أربعة ملليلتر من 0.05٪ من الرحلات في EDTA إلى الخلايا بعد ذلك بقوة. رج الطبق أفقيا لمدة دقيقتين حتى تظهر الخلايا الليفية الجنينية للفأر تحت المجهر وهي ترفع عن اللوحة كخلايا مفردة.

ستظل مستعمرات HPSC متصلة بالطبق كمستعمرات ، ثم تستنشق التربسين على الفور وبدقة وتترك الطبق في درجة حرارة الغرفة لمدة دقيقتين إلى أربع دقائق. أضف ملليلترين من وسط HES إلى اللوحة واستخدم ماصة P 1000 لفصل الخلايا. إذا لم ترفع الخلايا بسهولة ، فقم باحتضان اللوحة لمدة دقيقتين إلى ثلاث دقائق إضافية.

في درجة حرارة الغرفة ، انقل تعليق الخلية إلى أنبوب مخروطي سعة 15 مليلتر يحتوي على ثمانية ملليلتر من وسط HES ، مكملا ب 10 ميكرومولار Y 2 7 6 3 2 ثنائي هيدروكلوريد. ثم قم بشفط matrigel من طبق معالج مسبقا 10 سم وقم بوضع الخلايا بنسبة واحد إلى واحد أو واحد إلى اثنين على اللوحة المعالجة matrigel. احتضان الخلايا طوال الليل عند 37 درجة مئوية في حاضنة ثاني أكسيد الكربون بنسبة 5٪.

قم بتغذية الخلايا يوميا بوسط HES حتى تصبح جاهزة للتمايز. ثم ابدأ التمايز العصبي عندما تكون الخلايا متقاربة بنسبة 90٪ إلى 100٪. هذا هو اليوم صفر.

قم بتغذية الخلايا يوميا من اليوم صفر إلى اليوم الثالث ب 10 ملليلتر من تمايز KSR ، وسط يحتوي على 0.1 ميكرومولار ، LDN 1 ، 9 3 ، 8 ، 9 ، و 10 ميكرومولار SB 4 3 1 5 42. ثم في اليومين الرابع والخامس ، قم بتغذية الخلايا ب 10 ملليلتر من الوسائط التي تحتوي على 75٪ تمايز KSR ، متوسط 25٪ واثنين ، وسط التمايز ، 0.1 ، ميكرومولار LDN 1 ، 9 3 ، 1 ، 8 ، 9 ، و 10 ميكرومولار SB 4 3 1 5 42. في اليومين السادس والسابع ، قم بتغذية الخلايا بوسائط معدلة لتحتوي على 50٪ تمايز KSR ، متوسط و 50٪ واثنان ، وسط التمايز بالإضافة إلى استكمالها ب 0.1 ميكرومولار LDN ، 1 ، 9 3 ، 1 ، 8 ، 9 ، و 10 ميكرومولار SB 4 3 1 5 2.

في اليوم الثامن إلى التاسع ، قم بتغذية الخلايا بنسبة 25٪ تمايز KSR ، متوسط و 75٪ واثنان ، وسط تمايز ، كلاهما يحتوي على 0.1 ميكرومولار LDN 1 9 3 1 8 و 9 و 10 ميكرومولار SB 4 3 5 2. ثم في اليومين التاسع و 10 ، قم بإعداد أطباق الثقافة باستخدام بولي L orhan laminin واحد و fibronectin كما هو موضح في بروتوكول النص ، والذي سيتم استخدامه لإعادة طلاء الخلايا في اليوم 11 ، قم بتغذية الخلايا ب N اثنين من وسط التمايز ، مكمل ب 0.1 ميكرومولار L DN 1 9 3 و 109 و 10 ميكرومولار SB 4 31 5 42. في اليوم 10 من اليوم 11 ، قم بشفط محلول اللامينين الأول والفيبرونيكتين من أطباق الثقافة المعدة مسبقا واتركها تجف في درجة حرارة الغرفة في غطاء زراعة الأنسجة لمدة 20 إلى 30 دقيقة.

بعد ذلك ، قم بإزالة الوسيط من الخلايا المتمايزة واغسل الخلايا مرة واحدة باستخدام XPBS واحد. ثم أضف ثمانية ملليلتر من أكوات إلى كل صفيحة 10 سم واحتضن الألواح لمدة 20 دقيقة عند 37 درجة مئوية. بعد الحضانة ، استخدم رافع الخلايا لفصل الخلايا ثم إعادة تعليق الخلايا في محلول Accutane.

باستخدام ماصة سعة خمسة ملليلتر، انقل معلق الخلية إلى أنبوب مخروطي سعة 15 ملليلترا. بعد ذلك ، أضف خمسة ملليلتر من XPBS واحد إلى الأنبوب وقم بتدوير الخلايا لمدة خمس دقائق عند 115 Gs.تخلص من المادة الطافية وأعد تعليق حبيبات الخلية في 10 ملليلتر من XPBS واحد. ثم قم بتصفية تعليق الخلية من خلال مدرب خلايا 40 ميكرون لضمان تعليق خلية واحدة.

عد الخلايا باستخدام مقياس الخلوي الدموي. قم بتدوير الخلايا مرة أخرى لمدة خمس دقائق عند 115 Gs وأعد تعليق الخلايا إلى تركيز 100 ، 000 إلى 150 ، 000 خلية لكل 10 ميكرولتر من وسط التمايز N المكمل. استخدم ماصة مكرر لوضع 10 قطرات ميكرولتر من معلق الخلية على أطباق مزرعة 15 سم تمت معالجتها مسبقا ببولي L orhan.

لامينين واحد وفيبرونكتين. اترك القطرات تقف في درجة حرارة الغرفة لمدة 15 إلى 20 دقيقة. ثم بحذر شديد عند 30 مل من وسط التمايز N المكمل إلى اللوحة دون إزعاج القطرات.

احتضان الخلايا طوال الليل عند 37 درجة مئوية في حاضنة ثاني أكسيد الكربون بنسبة 5٪. في اليوم 12 ، قم بتغذية الخلايا بعناية ب 20 مل من N اثنين من وسط التمايز يحتوي على 200 ميكرومولار مثل حمض الصويك. 20 نانوجرام لكل ملليلتر من عامل التغذية العصبية المشتق من الدماغ ، 100 نانوجرام لكل ملليلتر من عامل نمو الخلايا الليفية ثمانية و 20 نانوجرام لكل مليلتر من القنفذ الصوتي لكل طبق 15 سم.

ثم من اليوم 14 إلى اليوم 17 ، قم بتغذية الخلايا كل يومين إلى ثلاثة أيام باستخدام N اثنين من وسط التمايز الذي يحتوي على 200 ميكرومولار فقط مثل حمض الأوريك. 20 نانوغرام لكل مليلتر من عامل التغذية العصبية المشتق من الدماغ و 100 نانوغرام لكل مليلتر من نمو الخلايا الليفية. العامل الثامن ، قم بإعداد الألواح التي تحتوي على بولي L orin laminin واحد وفيبرونيكتين في اليومين 16 و 17 لاستخدامها في إعادة طلاء خلايا القمة العصبية.

بعد تحليل الفاكس في اليوم 18 ، بعد فرز الخلايا عن طريق فرز الخلايا المنشطة بالفلورة ، قم بحساب خلايا القمة العصبية ثم قم بتدويرها عند 115 جيجابايت لمدة خمس دقائق. أعد تعليق بيليه الخلية في N اثنين. وسط التمايز مكمل ب 10 نانوجرام لكل مليلتر.

FGF اثنين 20 نانوغرام لكل مليلتر EGF و 10 ميكرومولار Y 2 7 6 3 2 ثنائي هيدروكلوريد بتركيز 30 ، 000 خلية لكل 10 ميكرولتر. أطباق مزرعة جافة تماما تم تحضيرها مسبقا باستخدام بولي ل أورهان لامينين واحد وفيبرونكتين. ثم لوحة ما يقرب من 50 إلى 70 قطرة من تعليق الخلية لكل طبق 10 سنتيمترات.

احتضان الخلايا في درجة حرارة الغرفة لمدة 15 إلى 20 دقيقة عند 20 مل من N اثنين. وسط التمايز مكمل ب 10 نانوجرام لكل مليلتر. FGF اثنين من 20 نانوغرام لكل مليلتر EGF و 10 ميكرومولار Y 2 7 6 3 2 ثنائي هيدروكلوريد لكل طبق 10 سم دون إزعاج القطرات.

ثم احتضان الخلايا طوال الليل عند 37 درجة مئوية في حاضنة ثاني أكسيد الكربون بنسبة 5٪. بعد حضانة خلايا القمة العصبية والحفاظ عليها وتمريرها ، وفقا لبروتوكول النص المصاحب ، تم اشتقاق خلايا القمة العصبية من الخلايا الجذعية البشرية متعددة القدرات في 18 يوما. باستخدام وحدة التغذية الجديدة هذه مجانا في بروتوكول التمايز في المختبر.

حدد تحليل الفاكس في اليوم 18 الخلايا التي كانت إيجابية لكل من HNK one و P 75 ، مما أكد وجود خلايا القمة العصبية. في كل من بروتوكول التمايز الحر للمغذي والبروتوكول المعتمد على الخلايا المغذية ، مرت خلايا القمة العصبية بمرحلة الروسيت العصبية. بالإضافة إلى ذلك ، فإن حقيقة الخلايا التي تم فرزها لها مورفولوجيا متطابقة وعبرت عن علامات القمة العصبية ، H و K واحد و P اثنين من المقارنة للتعبير الجيني العالمي لخلايا القمة العصبية المشتقة من هذين البروتوكولين للتمايز وجدت أن كلتا المجموعتين من الخلايا تتجمعان معا بشكل وثيق.

أظهر تحليل قدرة الهجرة لخلايا القمة العصبية المشتقة باستخدام بروتوكول التغذية الحر أن الخلايا هاجرت بنجاح إلى نقطة الصفر بعد 48 ساعة. هذه الخلايا لديها أيضا القدرة على التمايز إلى خلايا من الجهاز العصبي اللاإرادي كما أكد من خلال التلوين الإيجابي للهريس واحد ولمس واحد بعد أربعة أيام إضافية من التمايز. بعد مشاهدة هذا الفيديو ، يجب أن يكون لديك فهم جيد لكيفية عصبية الخلايا الجذعية البشرية متعددة القدرات واستخلاص الخلايا السلوية للقمة العصبية في المختبر.