خالية من التغذية اشتقاق الخلايا العصبية كريست السلف من افرة القوة البشرية الخلايا الجذعية

الهدف العام من هذا الإجراء هو توليد خلايا سلفية للعرف العصبي من خلايا جذعية بشرية متعددة القدرات وفق بروتوكول محدد وقابل للتكرار وقصير المدى. ويمكن بعد ذلك استخدام هذه الخلايا إما لدراسة الأمراض المرتبطة بالعرف العصبي في المختبر (in vitro) أو لمواصلة تمايز هذه الخلايا إلى خلايا نسلية. ويتم تحقيق ذلك من خلال زراعة كثافة عالية من الخلايا الجذعية البشرية متعددة القدرات أولاً في طبقة أحادية على الماتريجيل (matrigel).

تتمثل الخطوة الثانية في تمايز الخلايا إلى خلايا ظهارية عصبية باستخدام تسلسل وتوليفة محددة من الجزيئات الصغيرة التي تؤثر على مسارات تأشير رئيسية. بعد ذلك، يتم إعادة زراعة الخلايا الظهارية العصبية ومواصلة تمايزها إلى خلايا سلفية في العرف العصبي. وتتمثل الخطوة النهائية في عزل خلايا العرف العصبي باستخدام فرز الخلايا المفعل بالفلورة.

وفي النهاية، يُستخدم التألق المناعي والمقايسات الوظيفية، مثل قدرة الخلية على الهجرة، لإثبات توليد خلايا العرف العصبي المناسبة. وتتمثل الميزة الرئيسية لهذه التقنية مقارنة بالبروتوكولات الحالية لاشتقاق خلايا العرف العصبي من الخلايا الجذعية البشرية متعددة القدرات في كونها أقصر زمنياً، حيث تستغرق 18 يوماً فقط.

تتميز هذه الطريقة بقابلية أعلى للتكرار نظراً لعدم الحاجة إلى خلايا تغذية MS five. كما يسهل توسيع نطاقها، وهي عالية التكرار بين خطوط الخلايا الجذعية البشرية متعددة القدرات. وتمتد تداعيات هذه التقنية لتشمل دراسات آليات الأمراض البشرية المرتبطة بالسلالة العصبية، وتظهر إمكانات لتحسين تفاصيل النمذجة في المختبر وفحص الأدوية لهذه الأمراض.

قبل البدء في هذا البروتوكول، تأكد من أن مستعمرات الخلايا الجذعية البشرية متعددة القدرات كبيرة بما يكفي لرؤيتها بالعين المجردة، ولا تزال ذات حواف حادة مع وجود عدد قليل من الخلايا المتمايزة عند حدودها. بعد ذلك، عندما تصبح الخلايا الجذعية البشرية متعددة القدرات جاهزة للتقسيم، قم بشفط الوسط، واغسل مرة واحدة باستخدام 5 mL من 1xPBS، ثم أضف 4 mL من 0.05% trypsin-EDTA إلى الخلايا. بعد ذلك، قم برج الطبق أفقيًا وبقوة لمدة دقيقتين حتى يُلاحظ تحت المجهر انفصال الخلايا الليفية الجنينية للفأر عن الطبق كخلايا مفردة.

ستبقى مستعمرات HPSC ملتصقة بالطبق على شكل مستعمرات، ثم قم بشفط التريبسين فوراً وبشكل كامل واترك الطبق في درجة حرارة الغرفة لمدة تتراوح من دقيقتين إلى أربع دقائق. أضف 2 mL من وسط HES إلى الطبق واستخدم ماصة P 1000 لفصل الخلايا. إذا لم تنفصل الخلايا بسهولة، فقم بحضن الطبق لمدة إضافية تتراوح من دقيقتين إلى ثلاث دقائق.

في درجة حرارة الغرفة، انقل معلق الخلايا إلى أنبوب مخروطي سعة 15 milliliter يحتوي على ثمانية milliliters من وسط HES، المدعم بـ 10 micromolar من Y 2 7 6 3 2 dihydrochloride. بعد ذلك، اسحب الماتريجيل (matrigel) من طبق قطر 10 centimeter تمت معالجته مسبقاً، ثم ازرع الخلايا بنسبة واحد إلى واحد أو واحد إلى اثنين فوق الطبق المعالج بالماتريجيل. قم بتحضين الخلايا طوال الليل عند 37 degrees Celsius في حضانة تحتوي على 5% carbon dioxide.

قم بتغذية الخلايا يومياً باستخدام وسط HES حتى تصبح جاهزة للتمايز. ثم ابدأ عملية التمايز العصبي عندما تصل الخلايا إلى درجة تلاقي تتراوح بين 90% إلى 100%. ويُعتبر هذا اليوم هو اليوم صفر.

قم بتغذية الخلايا يومياً من اليوم صفر إلى اليوم الثالث باستخدام 10 milliliters من وسط تمايز KSR الذي يحتوي على 0.1 micromolar من LDN 1, 9 3, 8, 9 و 10 MICROMOLAR من SB 4 3 1 5 42. بعد ذلك، وفي اليومين الرابع والخامس، قم بتغذية الخلايا بـ 10 milliliters من وسط يحتوي على 75% من وسط تمايز KSR و 25% من وسط التمايز الثاني، مع إضافة 0.1 micromolar من LDN 1, 9 3, 1, 8, 9 و 10 micromolar من SB 4 3 1 5 42. وفي اليومين السادس والسابع، قم بتغذية الخلايا بوسط مُعدل ليحتوي على 50% من وسط تمايز KSR و 50% من وسط التمايز الثاني، بالإضافة إلى تدعيمه بـ 0.1 micromolar من LDN 1, 9 3, 1, 8, 9 و 10 micromolar من SB 4 3 1 5 2.

بالنسبة لليومين الثامن والتاسع، يتم تغذية الخلايا بوسط تمايز يحتوي على 25% KSR و75% N2، على أن يحتوي كلاهما على 0.1 µM من LDN 193189 و10 µM من SB 431542. بعد ذلك، في اليومين التاسع والعاشر، يتم تحضير أطباق الزرع باستخدام poly L-ornithine وlaminin 1 وfibronectin كما هو موضح في البروتوكول النصي، والتي ستُستخدم لإعادة زرع الخلايا. في اليوم الحادي عشر، يتم تغذية الخلايا بوسط تمايز N2 مضاف إليه 0.1 µM من LDN 193189 و10 µM من SB 431542. وفي اليوم الحادي عشر، يتم شفط محلول laminin 1 وfibronectin من أطباق الزرع التي تم تحضيرها مسبقاً، وتُترك لتجف في درجة حرارة الغرفة داخل غطاء زراعة الأنسجة لمدة تتراوح من 20 إلى 30 دقيقة.

بعد ذلك، قم بإزالة الوسط من الخلايا المتمايزة واغسل الخلايا مرة واحدة باستخدام XPBS. ثم أضف ثمانية ملليلتر من acuate إلى كل طبق بقطر 10 سنتيمتر، وحضن الأطباق لمدة 20 دقيقة عند 37 درجة مئوية. بعد فترة التحضين، استخدم رافعة خلايا لفصل الخلايا، ثم أعد تعليق الخلايا في محلول Accutane.

باستخدام ماصة سعة 5 mL، انقل معلق الخلايا إلى أنبوب مخروطي سعة 15 mL. بعد ذلك، أضف 5 mL من محلول 1x PBS إلى الأنبوب وقم بطرد الخلايا مركزياً لمدة خمس دقائق عند 115 ×g. تخلص من الطافي وأعد تعليق كتلة الخلايا في 10 mL من محلول 1x PBS. ثم قم بترشيح معلق الخلايا عبر مصفاة خلايا بمسام 40 micron لضمان الحصول على معلق خلوي أحادي.

قم بعدّ الخلايا باستخدام مقياس كرات الدم (hemo cytometer). قم بتركيز الخلايا مرة أخرى عن طريق الطرد المركزي لمدة خمس دقائق عند 115 Gs، ثم أعد تعليق الخلايا بتركيز يتراوح من 100,000 إلى 150,000 خلية لكل 10 µL من وسط التمايز N2 المدعم. استخدم ماصة مكررة لتوزيع قطرات بحجم 10 µL من معلق الخلايا على أطباق زراعة بقطر 15 cm تمت معالجتها مسبقاً بـ poly L-ornithine.

لامينين 1 وفيبرونيكتين. تُترك القطرات في درجة حرارة الغرفة لمدة تتراوح بين 15 إلى 20 دقيقة. بعد ذلك، يُضاف بحذر شديد 30 milliliters من وسط التمايز N2 المكمل إلى الطبق دون تحريك القطرات.

يتم تحضين الخلايا طوال الليل عند 37 °C في حاضنة تحتوي على 5% carbon dioxide. وفي اليوم 12، يتم تغذية الخلايا بعناية باستخدام 20 mL من وسط التمايز N two الذي يحتوي على 200 µM من as soic acid، و20 ng/mL من brain derived neurotrophic factor، و100 ng/mL من fiberblast growth factor eight، و20 ng/mL من sonic hedgehog لكل طبق بقطر 15 cm.

ثم من اليوم 14 إلى اليوم 17، يتم تغذية الخلايا كل يومين إلى ثلاثة أيام بوسط تمايز N2 يحتوي فقط على 200 micromolar من حمض الأوروتيك، و20 nanograms per milliliter من العامل العصبي المشتق من الدماغ، و100 nanograms per milliliter من عامل نمو الخلايا الليفية 8. قم بتجهيز أطباق تحتوي على poly L orin وlaminin 1 وfibronectin في اليومين 16 و17 لاستخدامها في إعادة زراعة خلايا العرف العصبي.

بعد تحليل FACS في اليوم 18، وبعد فرز الخلايا باستخدام تقنية فرز الخلايا المنشطة بالفلورة، يتم عدّ خلايا العرف العصبي ثم طردها مركزياً عند 115 Gs لمدة خمس دقائق. أعد تعليق كتلة الخلايا في وسط التمايز N2 المكمل بـ 10 nanograms per milliliter.

عامل نمو الأرومة الليفية 2 (FGF2) بتركيز 20 nanograms per milliliter، وعامل نمو البشرة (EGF)، وY 2 7 6 3 2 di hydrochloride بتركيز 10 micromolar، وبكثافة خلوية تبلغ 30,000 cells per 10 microliters. تجفف أطباق الزرع التي تم تحضيرها مسبقاً باستخدام poly L orhan laminin one وfibronectin تجفيفاً تاماً. بعد ذلك، يتم توزيع ما يقرب من 50 إلى 70 قطرة من معلق الخلايا في كل طبق بقطر 10 centimeter.

يتم تحضين الخلايا في درجة حرارة الغرفة لمدة تتراوح من 15 إلى 20 دقيقة، ثم يُضاف 20 milliliters من وسط التمايز N2 المكمل بـ 10 nanograms per milliliter من FGF2 و20 nanograms per milliliter من EGF و10 micromolar من Y 27632 dihydrochloride إلى كل طبق بقطر 10 centimeter دون تحريك القطرات.

بعد ذلك، تُحضن الخلايا طوال الليل عند 37 درجة مئوية في حضانة تحتوي على 5% ثاني أكسيد الكربون. وبعد انتهاء فترة التحضين، يتم الحفاظ على خلايا العرف العصبي وتمريرها، ووفقاً لبروتوكول النص المرفق، تم اشتقاق خلايا العرف العصبي من خلايا جذعية بشرية متعددة القدرات خلال 18 يوماً، باستخدام بروتوكول التمايز المختبري الجديد الخالي من الخلايا المغذية.

حدد تحليل FACS في اليوم 18 الخلايا التي كانت موجبة لكل من HNK-1 و P75، مما أكد وجود خلايا العرف العصبي. وفي كل من بروتوكول التمايز الخالي من الخلايا المغذية والبروتوكول المعتمد على الخلايا المغذية، مرت خلايا العرف العصبي بمرحلة الوردة العصبية. بالإضافة إلى ذلك، أظهرت الخلايا التي تم فرزها بواسطة FACS شكلاً ظاهرياً متطابقاً وعبرت عن علامات العرف العصبي HNK-1 و P75. ووجد مقارنة للتعبير الجيني الشامل لخلايا العرف العصبي المشتقة من هذين البروتوكولين للتمايز أن مجموعتي الخلايا تتجمعان بشكل وثيق معاً.

أظهر تحليل قدرة الهجرة للخلايا العرفية العصبية المشتقة باستخدام بروتوكول خالي من الخلايا المغذية أن الخلايا هاجرت بنجاح إلى منطقة الخدش بعد 48 ساعة. كما تمتلك هذه الخلايا القدرة على التمايز إلى خلايا من الجهاز العصبي الذاتي، وهو ما تم تأكيده من خلال الصبغ الإيجابي لـ mash one و touch one بعد أربعة أيام إضافية من التمايز. بعد مشاهدة هذا الفيديو، يجب أن يكون لديك فهم جيد لكيفية تحويل الخلايا الجذعية البشرية متعددة القدرات إلى خلايا عصبية واشتقاق الخلايا السلفية العرفية العصبية في المختبر.