تحليل شامل لديناميات النسخ من عينات المخ بعد تجربة السلوكية

الهدف العام من التجربة التالية هو دراسة ديناميكيات النسخ وأنوية دماغية محددة لدى الفئران عقب خبرة سلوكية. ويتم تحقيق ذلك أولاً من خلال تعويد الحيوانات وتسجيل نشاطها الحركي بعد حقن المحلول الملحي. وبمجرد اعتياد الحيوانات، يتم تسجيل النشاط الحركي بعد جرعة واحدة من الكوكائين، ثم تُجمع عينات من النواة المتكئة وتُستخدم لعزل RNA وتحضير CDNA.

يتم إجراء تحليل QPCR التالي لدراسة التعبير الجيني الناجم عن السلوك. وفي النهاية، يتم الحصول على نتائج توضح الديناميكيات النسخية التي تلي التعرض للكوكايين. سيقوم بتوضيح البروتوكول كل من الدكتور Hatu، مدير المختبر، وDum Muer، طالب الدراسات العليا في المختبر، وDuran، طالب المرحلة الجامعية من المختبر. ولمدة ثلاثة أيام متتالية، يتم تعويد كل فأر على إجراءات المناولة والحقن، مع تنظيم الفئران في أقفاص قبل بدء التجربة، بحيث لا يتم نقل الفئران بين الأقفاص مستقبلاً، وألا تُترك الفئران في عزلة لفترة زمنية طويلة.

قبل 30 دقيقة من بدء الاختبار، يجب نقل جميع أقفاص الاختبار إلى غرفة السلوك للسماح للحيوانات بالتأقلم مع البيئة. يتم إعطاء حقنة داخل الصفاق من 250 microliters من المحلول الملحى، وفور الحقن، يُوضع الفأر في غرفة السلوك لمراقبة النشاط الحركي لمدة 15 دقيقة. ويمكن وضع الفأر في غرفة السلوك لمدة 20 دقيقة.

تتم مراقبة النشاط من الدقيقة الثانية وحتى الدقيقة 17. كرر هذه الخطوات في نفس الوقت من اليوم لمدة اليومين التاليين. في اليوم الرابع، يتم إعطاء حقنة واحدة من الكوكايين أو المحلول الملحي، حسب المجموعة، ووضع الفأر فوراً في الغرفة لمراقبة النشاط الحركي الموضعي لمدة 20 دقيقة في نقاط زمنية مختارة بعد التعرض للكوكايين، ثم استخراج الدماغ ووضعه في محلول A CSF مبرد بالثلج لمدة دقيقة إلى دقيقتين للتبريد والتصلب.

بعد إزالة المخيخ وتجفيف السوائل الزائدة، قم بلصق الدماغ على منصة جهاز vibram بحيث يكون الجزء المنقاري متجهًا للأعلى. املأ الغرفة بـ A CSF مبرد بالثلج، وقم بعمل مقاطع بسمك 200 micron حتى يتم تحديد nucleus accumbens بوضوح. انتبه جيدًا لشكل corpus callosum، وموقع وشكل anterior commissure والبطينات أثناء عملية القطع.

بمجرد تحديد المنطقة الصحيحة، يتم قطع شريحتين بسمك 400 microns، ليتم بعد ذلك تشريح النواة المتكئة (nucleus accumbens) باستخدام المجهر الستيريوسكوب. استخدم شفرة دقيقة لفصل النواة المتكئة عن الشرائح. ستؤدي أربع تمريرات سريعة بالشفرة في المنطقة الصحيحة إلى عزل النسيج المناسب على الفور.

ضع النسيج المعزول في 900 µL من كاشف التحلل، واحفظه في درجة حرارة -80 °C حتى البدء في استخلاص الـ RNA؛ ابدأ بإذابة الأنابيب عند 37 °C ثم قم بالتجانس. باستخدام إبرة قياس 25، قد تكون الدورات القليلة الأولى صعبة وتتطلب دفع النسيج ضد جدار الأنبوب لتجانسه إلى قطع صغيرة. ولضمان التجانس السليم، انقل المستخلص باستخدام الماصة إلى عمود دوران صغير من نوع kaya shredder ثم قم بالطرد المركزي.

انقل المستخلص باستخدام الماصة إلى أنبوب طرد مركزي دقيق جديد واستخلص الـ RNA وفقاً لتعليمات الشركة المصنعة. بعد تنقية الـ RNA، يتم إجراء النسخ العكسي إلى cDNA، بالإضافة إلى تضخيم مسبق محدد للهدف للعينات باستخدام بادئات موجهة ضد مجموعة الجينات المختارة للتحليل. هذه الإجراءات موصوفة في النسخة النصية من البروتوكول.

تتوفر رقاقات الموائع الدقيقة التجارية المخصصة لتحليل QPCR الشامل بتنسيق 48 في 48، مما يتيح تحليل 48 عينة باستخدام 48 مجموعة من المجسات، أو بتنسيق 96 في 96 حيث يتم تحليل 96 عينة باستخدام 96 مجسًا. وفي معظم الحالات، يعتمد اختيار الرقاقة بشكل أساسي على عدد العينات التي سيتم تحليلها.

أولاً، قم بتحضير مزيج العينة وفقاً للشريحة المختارة للتجربة. توخَّ الحذر عند سحب كاشف تحميل العينة صبغة ربط 20 XDNA باستخدام الماصة. قم برجّ محاليل مزيج العينة لمدة 20 ثانية كحد أدنى، ثم ضعها في جهاز الطرد المركزي لمدة 30 ثانية على الأقل.

يمكن تخزين التفاعلات المُحضرة لفترات قصيرة عند درجة حرارة 4 °C حتى تصبح الشريحة جاهزة للتحميل. بعد ذلك، قم بتحضير خليط المقايسة، ورُج خليط العينة جيداً، ثم استخدم جهاز الطرد المركزي لترسيب جميع المكونات. وكما تم توضيحه سابقاً، تحتوي شريحة IFC ذات المصفوفة الديناميكية على مداخل للعينات والمقايسات، بالإضافة إلى مداخل محددة لسائل خط التحكم المستخدم لضغط الغرف الموائعية الدقيقة.

أولاً، قم بحقن سائل خط التحكم في كل مجمع على الرقاقة. بعد ذلك، قم بتحضير الرقاقة عن طريق وضعها في وحدة تحكم IFC وتشغيل السكريبت المناسب. عند انتهاء السكريبت، أخرج الرقاقة المحضرة من وحدة تحكم IFC واستخدم الماصة لسحب 5 µL من كل مقايسة.

امزج المكونات على الشريحة. أضف 5 µL من كل خليط عينة في المداخل الخاصة بها، ثم أعد الشريحة إلى جهاز التحكم IFC باستخدام برنامج التحكم IFC. قم بتشغيل البرنامج النصي لتحميل العينات والمقاييس داخل الشريحة.

عندما ينتهي نص تحميل المزيج، قم بإزالة الشريحة المحملة من وحدة تحكم IFC. بعد ذلك، قم بتحميل الشريحة على جهاز التدوير الحراري وأنشئ تشغيلًا جديدًا للشريحة يتضمن تحليل منحنى الانصهار. وباستخدام برنامج جهاز التدوير الحراري، تأكد من التعرف على غرف التفاعل بشكل صحيح واترك التفاعل يستمر حتى الاكتمال.

ظهرت زيادة في النشاط الحركي بعد حقنة واحدة حادة من الكوكائين. في هذا المقطع الإكليلي، تحددت مواقع القطوع التي تم إجراؤها لتعريف حدود النواة المتكئة بواسطة خطوط بيضاء سميكة. وخلال عملية التشريح، أظهرت منحنيات تضخيم البادئات الموجهة ضد CFOs و phos B أن أزواج البادئات تضخم النسخ المستهدفة بكفاءة تصل إلى 100% تقريبًا.

في كل دورة، أظهرت النتائج أن الكوكايين حفز تعبير CFOs و phos B في النواة المتكئة، وكان هذا التعبير في أعلى مستوياته بعد ساعة وساعتين من التعرض. وعقب هذا الإجراء، يمكن تنفيذ طرق أخرى مثل تسلسل الجيل القادم لتحديد نسخ غير معروفة وموصوفة حديثاً.