Name: الفخذ نخاع العظم الطموح في الفئران لايف (فيديو) | JoVE Journal
Uploaded: 2014-07-05T15:00:00.000+00:00
Duration: 7 min 10 s
Description: تعلم طريقة سحب نخاع العظم من فخذ الفئران الحية باستخدام محقنة صغيرة ومحلول ملحي. تتيح هذه التقنية إجراء دراسات طولية متكررة على الخلايا المكونة للدم دون إنهاء حياة الحيوان.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

O.A.-W. مدعوم بجائزة المحقق السريري NIH K08 (1K08CA160647-01) ، وجائزة زميل ما بعد الدكتوراه من وزارة الدفاع الأمريكية في أبحاث فشل نخاع العظام (W81XWH-12-1-0041) ، وبرنامج المحققين Josie Roberston ، وجائزة Damon Runyon Clinical Investigator بدعم من مؤسسة إيفان.

وأجريت كافة الإجراءات الحيوانية وصفها في هذا البروتوكول وفقا للمبادئ التوجيهية لرعاية واستخدام الحيوانات المختبرية وتمت الموافقة من قبل لجنة رعاية الحيوان واستخدام المؤسسية (IACUCs كانت) في مركز ميموريال سلون كيترينج للسرطان. 1. تطلع نخاع العظم (BM) خلايا من عظم الفخذ <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> تخدير الماوس الذي سيخضع الفخذ تطلع نخاع العظام مع isoflurane و(1-4٪) تدار مع المرذاذ الدقة. عمق التخدير وينبغي رصد كل 5-10 دقيقة في جميع أنحاء الداخلي من خلال مراقبة أنه لا يوجد تغيير في معدل التنفس المرتبطة التلاعب الجراحية و / أو الأذن، أخمص القدمين، وذيل قرصة. وبفعل التخدير مع isoflurane والمحافظة وأيضا في جميع أنحاء الإجراء مع isoflurane و. جرعة ما قبل إجرائية وقائية من البوبرينورفين بجرعة 0.05-0.1 ملغ / كغ تحت الجلد كل 6-12 ساعة يمكن استخدامها لمنع الألم الذي يصاحب الإجراء باعتباره صفةفريق الأمم المتحدة القطري إلى كاربروفين. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> تطبيق مرهم للعين للعيون من الماوس الحث التالية التخدير لمنع جفاف القرنية. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> يتم قص الفراء بعناية من مساحة الجلد ما يقرب من 150٪ أكبر من مساحة الموقع الطموح المنشود. تتم إزالة الفراء فضفاضة مع الشاش رطبة. يرجى الحفاظ على الماوس على لوحة تعميم الماء الدافئ أو غيرها من سطح يسيطر حراريا آمنة لمنع انخفاض حرارة الجسم أثناء العملية. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> تطهير الساق بأكملها التي تحتوي على عظم الفخذ الذي سيخضع الطموح مع ثلاث مجموعات من الدعك بالتناوب (بالتناوب إما مع بوفيدون اليود (بتدين) أو الكلورهيكسيدين (Nolvasan) فرك و 70٪ ايزوبروبيل أو الايثانول 70٪ غارقة الإسفنج الشاش). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> الرطب 0.5 مل حقنة السلين (حجم: 0.5 سم مكعب؛ قياس: 27.5 G) مع الفوسفات مخزنة المالحة عقيمة (PBS) قبل الشفط BM. ملء المحاقن مع 200-500 ميكرولتر من برنامج تلفزيوني وطرد على الفور برنامج تلفزيوني. كرر هذا الإجراء 2-3 روتتراوح. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> إبقاء عازمة الساق من عظم الفخذ عن طريق دفع الساق مع أي البنصر أو الإصبع الخامس. تأكيد ان طائرة مخدر مناسبة تم تحقيقه. يقام الحقنة باستخدام الإبهام والسبابة. وهذا يسمح للاللقم أن تتعرض ويسهل إدخال الإبرة. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> بعد ترطيب حقنة، أدخل الإبرة من خلال الوتر الرضفي بحيث يتم إيداع الإبرة بشكل آمن بين اثنين من اللقم من عظم الفخذ. من خلال عقد diaphysis بالقرب من الكردوس عظم الفخذ مع الإبهام والسبابة، يتم إدخال الإبرة إلى رمح من عظم الفخذ بسهولة. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> قطب الإبرة إلى الخارج وإلى أعلى بحيث يكون بالتوازي مع رمح من عظم الفخذ. هذا الإجراء يسهل استرجاع محتويات نخاع العظام من عظم الفخذ رمح. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> تحويل اتجاه عقارب الساعة وعكس عقارب الساعة إبرة بينما دفعت به ببطء في تجويف نخاع الفخذ. تأكيد الموضع الصحيح للإبرة عن طريق تحريك بلطف سيRINGE أفقيا. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> برفق على المكبس إبرة الظهر، وخلق الضغط السلبي، في حين تتحرك الإبرة ذهابا وإيابا داخل تجويف BM. ملاحظة: إن حجم BM يستنشق تكون حوالي 5 ميكرولتر الذي يتوافق عادة إلى 0.4-0.8 × 10 6 خلايا وحيدات النوى. وسوف يتم تأكيد الطموح الناجح بصريا من خلال ظهور الدم في الجزء العلوي من الإبرة في قاعدة الحقنة. إذا رأيت أي الدم في حقنة فمن المرجح أن العظم أو الأنسجة جزء صغير عالق في الإبرة. هذا يمكن إزالته من الإبرة عن طريق تحريك المكبس صعودا وهبوطا في برنامج تلفزيوني (وهذا هو أحد الأسباب التي تجعل ينبغي حقنة مملوءة مسبقا مع برنامج تلفزيوني قبل الشفط BM). إذا لا يمكن فكها الأنسجة من حقنة، واستخدام إبرة حقنة جديدة و(مرة أخرى تبلل المحاقن مع 200-500 ميكرولتر من برنامج تلفزيوني). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> مرة واحدة ويستنشق BM بنجاح من عظم الفخذ، وإزالة الإبر والمحاقن من عظم الفخذ والفأرة. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> التحرك يستنشق BM إلى أنبوب microfuge العلاقات العامةefilled مع 500 ميكرولتر من برنامج تلفزيوني. بالنسبة لمعظم التطبيقات، ثم ينبغي أن تبقى الخلايا BM على الجليد حتى مزيد من المعالجة إذا كان ذلك ممكنا. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> بعد الانتهاء من هذا الإجراء، وإدارة مسكن مع كاربروفين 5 ملغ / كغ تحت الجلد. ثم إزالة الماوس من التخدير ووضع على وسادة ساخنة حتى تعافى تماما. ملاحظة: يجب أن يكون هناك أي مضاعفات أو استغاثة من ذوي الخبرة باتباع الإجراء الطموح إذا فعلت بشكل صحيح. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> قبل أن تعود الفئران إلى منطقة السكن، وضمان أنها قادرة على تجول والوصول إلى الطعام والماء. مراقبة الفئران لعلامات الضائقة أو إجراء آخر العدوى في ساعة 24 المقبلة. وتشمل علامات: النزيف المستمر، وفقر الدم والخمول. إذا رأيت أي من هذه العلامات إجراء آخر، يجب أن يتم التخلص من الحيوانات (ق). ملاحظة: يمكن تكرار تطلع BM / أخذ العينات ولكن يجب أن يتم تنفيذ الإجراء تكرار على عظم الفخذ المعاكس لمنع الصدمات المتكررة لنفس الساق. هناك القليل من المعلومات المتاحة عن الابequency أن تطلع BM لا يمكن أن يؤديها. ويتكرر الفخذ تطلع نخاع العظام عموما لا أكثر من مرة كل 2 أسابيع. </li></ol> 2. تقييم المحتوى الخلوي في خلايا يستنشق BM <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> بيليه الخلايا التي تم استردادها من BM الطموح ومكان في أنبوب microfuge بواسطة الطرد المركزي في 300 x ج لمدة 5 دقائق في 4 درجة مئوية أو RT. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> نضح طاف ثم resuspend وبيليه في 500 ميكرولتر من الدم الحمراء ACK العازلة تحلل الخلية (&quot;الأمونيوم كلوريد البوتاسيوم&quot; تحلل العازلة). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> احتضان الخلايا في الحمراء العازلة تحلل الخلية لمدة 10 دقيقة ثم قم بإضافة 1 مل من برنامج تلفزيوني وتدور باستمرار الخليط مرة أخرى في 300 x ج لمدة 5 دقائق في 4 درجة مئوية أو RT. ملاحظة: يتكون هي lysed بيليه خلايا الدم الحمراء من خلايا وحيدات النوى الآن BM. هذه يمكن معلق لFACS تلطيخ، عد الخلايا، زراعة الأعضاء، تحليل cytospin و / أو أي استخدام آخر (تماما كما خلايا BM تحصد من الفئران ضحى ستستخدم). </li></ol>

<ol><li>Sundberg, R., Hodgson, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Aspiration+of+bone+marrow+in+laboratory+animals%5BTitle%5D)+AND+%22Blood%22%5BJournal%5D)">Aspiration of bone marrow in laboratory animals.</a> Blood. 4, 557-561 (1949).</li>
<li>Schmitz, M., Bourquin, J. -P., Bornhauser, B. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Alternative+technique+for+intrafemoral+injection+and+bone+marrow+sampling+in+mouse+transplant+models%5BTitle%5D)+AND+%22Leukemia+%26+lymphoma%22%5BJournal%5D)">Alternative technique for intrafemoral injection and bone marrow sampling in mouse transplant models.</a> Leukemia & lymphoma. 52, 1806-1808 (2011).</li>
<li>Warner, J. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Direct+evidence+for+cooperating+genetic+events+in+the+leukemic+transformation+of+normal+human+hematopoietic+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Leukemia%22%5BJournal%5D)">Direct evidence for cooperating genetic events in the leukemic transformation of normal human hematopoietic cells.</a> Leukemia. 19, 1794-1805 (2005).</li>
<li>Chiu, P. P., Jiang, H., Dick, J. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Leukemia-initiating+cells+in+human+T-lymphoblastic+leukemia+exhibit+glucocorticoid+resistance%5BTitle%5D)+AND+%22Blood%22%5BJournal%5D)">Leukemia-initiating cells in human T-lymphoblastic leukemia exhibit glucocorticoid resistance.</a> Blood. 116, 5268-5279 (2010).</li>
<li>Guan, Y., Gerhard, B., Hogge, D. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Detection%2C+isolation%2C+and+stimulation+of+quiescent+primitive+leukemic+progenitor+cells+from+patients+with+acute+myeloid+leukemia+%28AML%29%5BTitle%5D)+AND+%22Blood%22%5BJournal%5D)">Detection, isolation, and stimulation of quiescent primitive leukemic progenitor cells from patients with acute myeloid leukemia (AML).</a> Blood. 101, 3142-3149 (2003).</li>
<li>Nolta, J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+gold+standard+improves%3A+a+better+assay+for+HSCs%5BTitle%5D)+AND+%22Blood%22%5BJournal%5D)">The gold standard improves: a better assay for HSCs.</a> Blood. 106, 1141-1142 (2005).</li>
<li>Kiel, M. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((SLAM+family+receptors+distinguish+hematopoietic+stem+and+progenitor+cells+and+reveal+endothelial+niches+for+stem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">SLAM family receptors distinguish hematopoietic stem and progenitor cells and reveal endothelial niches for stem cells.</a> Cell. 121, 1109-1121 (2005).</li>
<li>Purton, L., Scadden, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Limiting+factors+in+murine+hematopoietic+stem+cell+assays%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+stem+cell%22%5BJournal%5D)">Limiting factors in murine hematopoietic stem cell assays.</a> Cell stem cell. 1, 263-270 (2007).</li>
<li>Dykstra, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Long-term+propagation+of+distinct+hematopoietic+differentiation+programs+in+vivo%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+stem+cell%22%5BJournal%5D)">Long-term propagation of distinct hematopoietic differentiation programs in vivo.</a> Cell stem cell. 1, 218-229 (2007).</li>
<li>Jordan, C., Lemischka, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Clonal+and+systemic+analysis+of+long-term+hematopoiesis+in+the+mouse%5BTitle%5D)+AND+%22Genes+%26+development%22%5BJournal%5D)">Clonal and systemic analysis of long-term hematopoiesis in the mouse.</a> Genes & development. 4, 220-232 (1990).</li>
<li>Challen, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Dnmt3a+is+essential+for+hematopoietic+stem+cell+differentiation%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+genetics%22%5BJournal%5D)">Dnmt3a is essential for hematopoietic stem cell differentiation.</a> Nature genetics. 44, 23-31 (2012).</li>
<li>Hess, D. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Selection+based+on+CD133+and+high+aldehyde+dehydrogenase+activity+isolates+long-term+reconstituting+human+hematopoietic+stem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Blood%22%5BJournal%5D)">Selection based on CD133 and high aldehyde dehydrogenase activity isolates long-term reconstituting human hematopoietic stem cells.</a> Blood. 107, 2162-2169 (2006).</li>
<li>Mazurier, F., Doedens, M., Gan, O. I., Dick, J. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Rapid+myeloerythroid+repopulation+after+intrafemoral+transplantation+of+NOD-SCID+mice+reveals+a+new+class+of+human+stem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Med%22%5BJournal%5D)">Rapid myeloerythroid repopulation after intrafemoral transplantation of NOD-SCID mice reveals a new class of human stem cells.</a> Nat Med. 9, 959-963 (2003).</li>
</ol>

والكتاب ليس لديهم ما يكشف.

المسلسل الطموح BM هو إجراء روتيني حاسمة لتحقيق السريرية للاضطرابات الدموية في البشر. القدرة على إجراء أخذ العينات المسلسل شابهه من BM في الفئران لتوصيف التركيب الخلوي ومكونات BM طوال التجارب المطولة هو بالمثل قيمة للغاية. هذا الإجراء مفيد لتوصيف وHSPC دون التضحية الماوس ولكن أيضا للكشف عن وجود أنواع الخلايا إضافية في BM في الحالات التي قد لا تكون محتويات الدم المحيطي عاكسة للخلايا المقيمين في BM. وقد استخدم المسلسل الطموح BM بشكل فعال جدا لهذا الغرض في وقت لاحق في رصد وجود خلايا ا...

جميع خلايا الدم مشتقة من الخلايا الجذعية المكونة للدم (HSCs). توفر الإجراءات التي تسمح بالوصول إلى نخاع العظم (BM) ، موقع الغالبية العظمى من HSC في الفئران والرجال ، دون الحاجة إلى التضحية بالحيوانات ، موردا لمراقبة مصدر تكون الدم بشكل متسلسل. الهدف العام من الإجراء الموصوف هنا هو توفير بروتوكول مفصل لأخذ عينات من خلايا BM من عظم الفخذ للفئران الحية والتي توفر مادة ممثلة للخلايا والتي سيتم استردادها عن طريق الحصاد التقليدي لخلايا BM من خلال التضحية بالفئران. تتمثل ميزة هذا الإجراء على الحصاد التقليدي لخلايا BM في أن هذا الإجراء لا يتطلب التضحية بالفئران وبالتالي يسمح بالدراسة الطولية لحجرة نخاع العظام للفئران بمرور الوقت. 
 على الرغم من أن إجراء شفط نخاع عظم الفئران قد تم استخدامه في عدد من الدراسات وتم وصفه سابقا (انظر Sundberg et al. لإجراء مراجعةتاريخية 1) ، لم يتم نشر الإجراءات الرسمية خطوة بخطوة التي توضح هذه التقنية من قبل. يتيح هذا البروتوكول أخذ عينات تسلسلية روتينية من BM لأغراض مثل تقييم النقش في BM للخلايا التي يتم إدخالها خارجيا في الفأر (كما هو الحال في دراسات الطعم الغريب على سبيل المثال2،3) ، وتحليل الخيميرية في BM للمقارنة مع الدم المحيطي (حيث لا تكون النتائج متطابقة بالضرورة) ، ومراقبة وفرة أنواع معينة من الخلايا المخصبة عادة في النخاع مثل الخلايا الجذعية المكونة للدم والخلايا السلفية ، واسترجاع خلايا BM للزراعة و / أو الزرع خارج الجسم الحي. بالإضافة إلى ذلك ، قد يكون تقييم محتويات النخاع مفيدا جدا في نماذج الفئران لمرض الدم حيث أن الشفط مفيد في تقييم عبء مرض الدم في النقاط الزمنية التي قد لا يكون فيها المرض واضحا في الدم المحيطي3-5. علاوة على ذلك ، يمكن استخدام هذه التقنية لتقييم استجابة مرض الدم في النخاع للأدوية التي تدار في الدراسات العلاجية. وبالتالي ، فإن الإجراء الموصوف هنا مثالي للباحثين الراغبين في الوصول إلى الخلايا المكونة للدم في نخاع العظم من الفئران للتحليل الخلوي ، وتحليل قياس التدفق الخلوي ، والزراعة في المختبر ، و / أو دراسات الزرع في الجسم الحي دون الحاجة إلى التضحية أو الإضرار بالفئران. 
بروتوكول أخذ عينات BM الموصوف هنا مشابه تماما للتقنية المستخدمة في الحقن داخل الفخذ للمادة مباشرة في تجويف النخاع3،6. يتمثل الاختلاف الرئيسي في أن هذا البروتوكول يفصل إجراء إزالة الخلايا من النخاع بدلا من غرس المادة مباشرة في مساحة تجويف النخاع كما هو الحال مع الحقن داخل الفخذ.

<table><tbody><tr><td>PBS</td><td>PAA</td><td>H15-002</td><td></td></tr><tr><td>ألبومين مصل الأبقار</td><td>PAA</td><td>K41-001</td><td></td></tr><tr><td>ACK المخزن المؤقت للتحلل</td><td>محلي الصنع</td><td></td><td>في 1 لتر ضبط الرقم الهيدروجيني 7.2 ~ 7.4 وتصفية معقمة مع 0.22 & mu ؛ م مرشح فراغ.</td></tr><tr><td>8.3 جم كلوريد الأمونيوم</td><td>فيشر Scientific</td><td>A661-500</td><td></td></tr><tr><td>1 جم بيكربونات البوتاسيوم</td><td>فيشر Scientific</td><td>P184-500</td><td></td></tr><tr><td>200 & ل 0.5 م EDTA درجة الحموضة 8</td><td>جيبكو</td><td>15575-038</td><td></td></tr><tr><td>RPMI 1640</td><td>PAA</td><td>E15-842</td><td></td></tr><tr><td>0.5 مل حقنة توبركولين 27.5 جرام</td><td>بيكتون ديكنسون</td><td>305620</td><td></td></tr><tr><td>مصفاة خلية معقمة 70 مو ؛ م</td><td>فيشر 22363548</td><td></td><td></td>العلمي</tr><tr><td>Isoflurane ، USP</td><td>Attane</td><td>NDC: 66794-014-25</td><td></td></tr> تقنيات <tr><td>الخلايا الجذعية</td><td>للإبرة</td><td>الحادة 28110</td><td></td></tr><tr><td>إبرة PrecisionGlide 23 جم</td><td>بيكتون ديكنسون</td><td>305193</td><td></td></tr><tr><td>3 مل حقنة طرف لور لوك</td><td>Becton Dickinson</td><td>309657</td><td></td></tr><tr><td>لوحة معالجة غير مزرعة الأنسجة ، 6 بئر</td><td>Becton Dickinson</td><td>351146</td><td></td></tr><tr><td>12 × 75 مم 5 مل أنابيب &nbsp;</td><td>Becton Dickinson</td><td>352054</td><td>FACS تلطيخ</td></tr><tr><td>12 × 75 مم 5 مل مع غطاء مصفاة الخلية</td><td>Becton Dickinson</td><td>352235</td><td>FACS تلطيخ</td></tr><tr><td>NK1.1 APC-Cy7</td><td>Biolegend</td><td>108723</td><td></td></tr><tr><td>CD11b APC-Cy7</td><td>Biolegend</td><td>101225</td><td></td></tr><tr><td>CD45R (B220) APC-Cy7</td><td>Biolegend</td><td>103223</td><td></td></tr><tr><td>CD3 APC-Cy7</td><td>Biolegend</td><td>100222</td><td></td></tr><tr><td>Ly-6G و Ly-6C (Gr-1) APC-Cy7</td><td>Biolegend</td><td>108423</td><td></td></tr><tr><td>Ter119 APC-Cy7</td><td>Biolegend</td><td>116223</td><td></td></tr><tr><td>CD19 APC-Cy7</td><td>Biolegend</td><td>302217</td><td></td></tr><tr><td>CD4 APC-Cy7</td><td>BioLegend</td><td>317417</td><td></td></tr><tr><td>CD117 (c-KIT) PE</td><td>BioLegend</td><td>105808</td><td></td></tr><tr><td>Ly-6A / E (Sca-1) PE-Cy7</td><td>Biolegend</td><td>122513</td><td></td></tr><tr><td>CD34 APC</td><td>Biolegend</td><td>128612</td><td></td></tr><tr><td>CD16 / 32 e450</td><td>eBioscience</td><td>48-0161-82</td><td></td></tr><tr><td>DAPI (4 & prime ؛ ، 6-Diamidino-2-phenylindole dihydrochloride)</td> <td>Sigma-Aldrich</td><td>32670</td><td></td></tr><tr><td>MethoCult GF M3434</td><td>STEMCELLTECHNOLOGIES</td><td>3434</td><td>لزراعة الميثوسليلوز</td></tr><tr><td>Carprofen</td><td>Crescent Chemical الشركة</td><td>C11045850</td><td>1 جرعة (5 ملغ / كجم) &nbsp;</td></tr><tr><td>مقياس التدفق الخلوي ، LSRFortessa</td><td>Becton Dickinson</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Puralube مرهم بيطري (مرهم معقم للفازلين للعين)</td><td>Dechra-US</td><td>17033-211-38</td><td></td></tr></tbody></table>

الفخذ نخاع العظم الطموح في الفئران لايف

Femoral Bone Marrow Aspiration in Live Mice

أخذ العينات التسلسلية للتركيب الخلوي لنخاع العظم (BM) هو إجراء روتيني بالغ الأهمية لأمراض الدم السريرية. يصف هذا البروتوكول إجراء تقنيا مفصلا خطوة بخطوة لإجراء مماثل في الفئران الحية يسمح بالتوصيف التسلسلي للخلايا الموجودة في BM. يسهل هذا الإجراء الدراسات التي تهدف إلى اكتشاف وجود خلايا تدار خارجيا داخل BM للفئران كما هو الحال في دراسات الطعم الغريب على سبيل المثال. علاوة على ذلك ، يسمح هذا الإجراء باسترجاع وتوصيف الخلايا المخصبة في BM مثل الخلايا الجذعية المكونة للدم والخلايا السلفية (HSPCs) دون التضحية بالفئران. بالنظر إلى أن التركيب الخلوي للدم المحيطي لا يعكس بالضرورة نسب وأنواع الخلايا الجذعية والسلفية الموجودة في النخاع ، فإن الإجراءات التي توفر الوصول إلى هذه الحجرة دون الحاجة إلى إنهاء الفئران مفيدة للغاية. يتم توضيح استخدام شفط نخاع عظم الفخذ هنا للتحليل الخلوي لخلايا النخاع ، وتوصيف التدفق الخلوي لحجرة الجذع / السلف المكونة للدم ، وثقافة HSPCs المصنفة التي تم الحصول عليها عن طريق شفط نخاع عظم الفخذ مقارنة بحصاد النخاع التقليدي.

وقد استخدمت الفخذ BM تطلع ماوس C57/B6 الحية للحصول على خلايا وحيدات النوى BM تليها الحصاد BM التقليدية من نفس الماوس بعد التضحية. الخلايا وحيدة النواة BM حصلت عليها طريقتين ثم تم تحليلها من قبل (1) التحليل الخلوي للخلايا BM، (2) تحديد التكرار النسبي للخلايا الجذعية / السلف المكونة للدم (HSPCs)، و (3) فيفو السابقين ثقافة HSPCs فرزها. في الأخير التجربة،-النسب السلبية Sca1 + ج-KIT تم فرز + (LSK) خلايا من خلايا وحيدات النوى التي حصل عليها تطلع BM وكذلك من الحصاد BM التقليدية....

يصف هذا البروتوكول إجراء لأخذ العينات التسلسلية لنخاع عظم الفخذ (BM) دون الحاجة إلى التضحية بالفئران. يسهل هذا الإجراء الدراسات الطولية لتكوين BM للفئران بمرور الوقت ويوفر وصولا تسلسليا إلى الخلايا داخل BM لدراسات خارج الجسم الحي والزرع.

Serial sampling of the cellular composition of bone marrow (BM) is a routine procedure critical to clinical hematology. This protocol describes a detailed ...

الهدف العام من هذا الإجراء هو سحب محتويات الخلايا المكونة للدم من الحيز النخاعي للفخذ في فأر حي بشكل آمن. يتم تحقيق ذلك أولاً عن طريق ملء حقنة توبيركلين بـ PBS. وفي الخطوة الثانية، يتم وضع ساق الفأر بعناية في الزاوية المثلى لاستعادة نخاع العظم.يتم بعد ذلك سحب الخلايا المكونة للدم من مساحة نخاع عظم الفخذ واستنفاد خلايا الدم الحمراء. وفي النهاية، يمكن التحقق من نجاح سحب محتويات نخاع العظم من خلال تحليلات التدفق الخلوي والتحليلات الخلوية. سيقوم الشاب Rock Chung، وهو فني موهوب جداً من مختبرنا، بتوضيح هذا الإجراء.تتمثل الميزة الرئيسية لهذه التقنية مقارنة بالطرق الحالية، مثل حصاد نخاع العظم التقليدي، في أنها تسمح باستعادة جزء من الخلايا المكونة للدم في نخاع العظم مع إبقاء الحيوان على قيد الحياة للمراقبة المستمرة والتحليل المتسلسل. بعد التأكد من التخدير عن طريق قرص إصبع القدم، يتم وضع مرهم العيون على عيني الفأر المخدر لمنع جفاف القرنية وحلاقة الساق للكشف عن الجلد. ثم يتم إجراء التحضير الجراحي المعقم للجلد عن طريق فرك المنطقة بمطهر الكلورهيكسيدين، يليه مسحة كحولية.تُكرر هذه العملية ثلاث مرات، مع استخدام حقنة وإبرة معقمة جديدة وغير مفتوحة لكل حيوان. تأكد من الوصول إلى مستوى التخدير المناسب. بعد ذلك، بلل حقنة توبيركولين سعة 0.5 milliliter بمحلول PBS المعقم، ثم اسحب وأفرغ فوراً من 200 إلى 500 milliliters من المحلول الملحي مرتين إلى ثلاث مرات.بعد ذلك، استخدم أحد الإصبعين الأخيرين من إحدى اليدين لثني الظنبوب (tibia) برفق بعيداً عن الفخذ (femur) لتسهيل كشف الحيز اللقمي لعظم الفخذ وإدخال الإبرة. الآن، أدخل الإبرة عبر الوتر الرضفي بحيث تستقر بإحكام بين اللقمتين في عظم الفخذ. استخدم إبهام وسبابة اليد الأخرى للإمساك بجسم العظم (diaphysis) بالقرب من مشاشة (epiphysis) عظم الفخذ للسماح بإدخال الإبرة بسهولة في ساق العظم.إذا لم يظهر دم في المحقنة، فمن المرجح أن تكون قطعة صغيرة من العظم أو النسيج عالقة في الإبرة. يمكن إزالة هذه القطعة من الإبرة عن طريق تحريك المكبس صعوداً وهبوطاً في محلول PBS. وإذا تعذر إخراج النسيج من المحقنة، استخدم إبرة ومحقنة جديدتين.مرة أخرى، قم بترطيب المحقنة باستخدام 200 إلى 500 µL من PBS. بعد ذلك، قم بتدوير الإبرة باتجاه عقارب الساعة وعكس اتجاه عقارب الساعة أثناء دفعها مقابل الحيز اللقيمة لكي تكون موازية لساق عظمة الفخذ. وذلك لتسهيل استعادة محتويات نخاع العظم من ساق عظمة الفخذ.أدر الإبرة باتجاه عقارب الساعة وعكس اتجاه عقارب الساعة أثناء دفعها ببطء داخل تجويف نخاع عظم الفخذ. تأكد من الوضع الصحيح للإبرة عن طريق تحريك المحقنة جانبياً بلطف. بعد ذلك، اسحب مكبس الإبرة للخلف برفق لإحداث ضغط سلبي مع تحريك الإبرة ذهاباً وإياباً داخل تجويف نخاع العظم.سيتم تأكيد نجاح عملية السحب بظهور الدم في الجزء العلوي من الإبرة عند قاعدة المحقنة. وبمجرد سحب نخاع العظم بنجاح من عظم الفخذ، قم بإزالة الإبرة من العظم وانقل نخاع العظم المسحوب إلى أنبوب طرد مركزي دقيق مملوء مسبقاً بـ 500 µL من PBS على الثلج. وبعد إعطاء المسكن، اترك الفأر ليتعافى تحت مصباح حراري قبل إعادته إلى منطقة الإيواء.تأكد من قدرتها على الحركة والوصول إلى الغذاء والماء. بعد ذلك، أعد الفأر إلى قفصه وراقب الحيوان بحثاً عن أي علامات ضيق أو عدوى بعد الإجراء خلال الـ 24 ساعة القادمة. وفي هذه الأثناء، قم بطرد خلايا نخاع العظم باستخدام جهاز الطرد المركزي، واسحب PBS بعناية ثم أعد تعليق الراسب.في 500 µL من محلول تحلل خلايا الدم الحمراء بعد 10 دقائق، تُغسل الخلايا في 1 mL من PBS. تحتوي الرواسبة على خلايا نخاع العظم أحادية النواة التي يمكن استخدامها في التحليل التجريبي. توضح هذه الأشكال الأولى كيف يمكن ملاحظة أنواع ونسب مماثلة من الخلايا الكلية والخلايا الجذعية والسلفية المكونة للدم من خلال التحليلات المورفولوجية والتدفق الخلوي، سواء باستخدام سحب نخاع العظم الفخذي أو حصاد نخاع العظم التقليدي.يوضح الشكل هنا النسبة المئوية للمجموعات الفرعية من الخلايا السلبية للسلالة (lineage negative) والموجبة لـ SKA1 والموجبة لـ C kit، بالإضافة إلى الخلايا السلفية النقوية، كتردد من إجمالي الخلايا الحية في ثلاث عمليات سحب مستقلة وعملية حصاد نخاع تقليدية. وتكشف هذه البيانات عن انخفاض في المجموعات الفرعية للخلايا السلبية للسلالة والموجبة لـ SKA1 والموجبة لـ C kit والخلايا السلفية النقوية في نخاع العظم الذي تم جمعه عن طريق السحب الفخذي مقارنة بحصاد النخاع التقليدي. ولم يكن هذا الفرق ذا دلالة إحصائية بالنسبة للمجموعة السكانية.ومع ذلك، فإن فرز الخلايا السلبية للسلالة (lineage negative) والموجبة لـ ska one والموجبة لـ cki، متبوعاً بالزراعة خارج الجسم (ex vivo) في وسط Methylcellulose، يؤدي إلى الحصول على أعداد من المستعمرات وأنواع من الخلايا مماثلة لتلك التي يتم الحصول عليها عن طريق سحب نخاع العظم الفخذي. وكما هو الحال في حصاد نخاع العظم التقليدي، تشمل أنواع المستعمرات المرصودة والمحصاة في كلتا الزراعتين وحدات تشكيل مستعمرات الخلايا المحببة، والخلايا الحمراء، والخلايا الوحيدة، والخلايا الميغاكاريوسيتية، ووحدات تشكيل مستعمرات الخلايا المحببة والوحيدة، ووحدات تشكيل الانفجارات الحمراء One master. يمكن إنجاز هذه التقنية في غضون 10 دقائق لكل فأر إذا تم تنفيذها بشكل صحيح وفقاً لهذا الإجراء.يمكن إجراء طرق أخرى، مثل الحقن داخل نخاع عظم الفخذ، للإجابة على أسئلة إضافية مثل: ما هو تأثير الطعم الغريب من الخلايا المكونة للدم البشرية في الفئران التي تعاني من نقص المناعة؟

femoral-bone-marrow-aspiration-in-live-mice

Research

JoVE Journal

Medicine

الطب

وكثيرا ما يستخدم نماذج حيوانية لدراسة الانبثاث السرطان إلى العظام. في هذا البروتوكول سنقوم بشرح طريقتين مشتركة من التلقيح الورم ورم خبيث العظام للدراسات ووصف بإيجاز بعض التحليلات المستخدمة لرصد وقياس هذه النماذج.

نماذج من الانبثاث العظام

يصف هذا الفيديو بروتوكولا مفصلا لعزل نخاع العظم الكامل الطازج من الأطراف الخلفية للفأر للتحقيق في عيوب BM الكاملة للمرضى الذين يعانون من اضطرابات الدم مثل سرطان الدم.

حصاد نخاع العظام من الطرف الخلفي للفأر

الخلايا الوحيدة هي المنظمين الرئيسيين للمناعة الفطرية وتلعب دورا مهما في تجديد نظام البلعمة أحادي النواة المحيطي وفي حالة الالتهاب. تصف هذه المخطوطة إجراء التصوير في الوقت الفعلي لنخاع عظم كالفاريا للفأر لدراسة آلية تعبئة الخلايا الوحيدة.

تتبع الماوس نخاع العظم وحيدات<em&gt; في فيفو</em

يتم تقديم استراتيجية لتحليل البيانات النسيجية كميا في نخاع العظام. ينتج عن الفحص المجهري متحد البؤر للخلايا المصنفة بالفلورسنت في أقسام الأنسجة صور ثنائية الأبعاد ، والتي يتم تحليلها تلقائيا. تتم مقارنة تحليلات التوطين المشترك لأنواع الخلايا المختلفة بالبيانات من الصور المحاكاة ، مما يعطي معلومات كمية حول التفاعلات الخلوية.

الكمي الآلي للخلية المكونة للدم - التفاعلات خلية انسجة في صور النسيجية من Undecalcified العظام

يصف البروتوكول نموذجا جديدا لغرفة نافذة عظم الفخذ الفئران يمكن استخدامه لتتبع حركة الخلايا في نخاع عظم الفخذ في الجسم الحي. يستخدم الفحص المجهري الفلوري متعدد الفوتون داخل الحيوية لتصوير ثلاثة مكونات لنخاع عظم الفخذ (الأوعية الدموية ومصفوفة الكولاجين والعدلات) بمرور الوقت.

عظم الفخذ نافذة الغرفة نموذج ل<em&gt; في فيفو</em&gt; تتبع الخلايا في الفئران نخاع العظام

يتم تطبيق مجهرية الأسفار إينترافيتال (إيففم) كالفاريوم في تركيبة مع الوراثية نماذج حيوانية لدراسة صاروخ موجه وانجرافتمينت من الخلايا المكونة للدم في نخاع العظم (بي أم) منافذ.

الجمع بين الفحص المجهري نيون إينترافيتال (إيففم) مع النماذج الوراثية لدراسة ديناميات Engraftment الخلايا المكونة للدم لمنافذ نخاع العظام

نموذج كسر فخذي مغلقة مورين هو منصة قوية لدراسة شفاء الكسر ورواية الاستراتيجيات العلاجية للتعجيل بتجديد العظام. والهدف من هذا البروتوكول الجراحية توليد الانفرادية كسور الفخذ مغلقة في الفئران باستخدام قضبان الصلب إينتراميدولاري لتحقيق الاستقرار في عظم الفخذ.

جيل كسور الفخذ مغلقة في الفئران: نموذج لدراسة شفاء العظام

هنا، نقدم بروتوكول لمعالجة نخاع العظم الطازج (BM) معزولة عن الماوس أو الإنسان لالكتلة عالية الأبعاد الخلايا (الخلايا من قبل وقت الرحلة، CyTOF) تحليل الخلايا العدلية النسب.

إعداد نخاع العظام كله لتحليل الكتلة الخلايا من الخلايا العدلية النسب

نحن نصف ثلاث طرق لزرع نخاع العظم (BMT): BMT مع تشعيع الجسم الكلي ، BMT مع التشعيع المحمية ، وطريقة BMT مع عدم وجود تكييف مسبق (BMT بالتبني) لدراسة التجويف الدموي الكلو في نماذج الماوس.

إجراءات زرع نخاع العظم في الفئران لدراسة الهيماتوبويز الكلونية

يصف هذا البروتوكول الحقن داخل الفخذ لعدد قليل من الخلايا الجذعية المكونة للدم أو سرطان الدم ، بما في ذلك الخلايا المعدلة جينيا ، في نماذج الطعم الغريب للفئران ، والتي لن تمكن فقط من الزرع السريع والآمن للخلايا ولكن أيضا التحليلات التسلسلية لنخاع العظام.

تسمح الحقن المبسطة داخل الفخذ باستخدام الفئران الحية بتحليل نخاع العظم المستمر

هنا يتم تقديم بروتوكول مفصل لعزل وتوصيف مجموعات البيئة الدقيقة لنخاع العظم من نماذج الفئران لمتلازمات خلل التنسج النقوي وسرطان الدم النخاعي الحاد. تحدد هذه التقنية التغيرات في مكانة نخاع العظم غير المكونة للدم ، بما في ذلك الخلايا اللحمية البطانية واللحمة المتوسطة ، مع تطور المرض.

تحديد مجموعات البيئة الدقيقة لنخاع العظم في متلازمة خلل التنسج النقوي وسرطان الدم النخاعي الحاد

تعلم طريقة سحب نخاع العظم من فخذ الفئران الحية باستخدام محقنة صغيرة ومحلول ملحي. تتيح هذه التقنية إجراء دراسات طولية متكررة على الخلايا المكونة للدم دون إنهاء حياة الحيوان.

الفخذ نخاع العظم الطموح في الفئران لايف

استكشف المزيد من الفيديوهات