Name: بروتوكول SIVQ-LCM لالصك ArcturusXT (فيديو) | JoVE Journal
Uploaded: 2014-07-23T14:00:00.000+00:00
Duration: 7 min 37 s
Description: تعلم تقنية SIVQ-LCM لتحسين استئصال الأنسجة بالليزر بدقة عالية. تُسرّع هذه الطريقة عزل الخلايا للتحليل الجزيئي في البحوث العصبية والسريرية.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

وأيد هذه الدراسة في جزء من برنامج بحوث جماعية من المعاهد الوطنية للصحة، والمعهد الوطني للسرطان، ومركز أبحاث السرطان.

كان يعمل بروتوكول صفها وفقا للقواعد المعاهد الوطنية للصحة على استخدام عينات الأنسجة البشرية. 1. إعداد الأنسجة <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> قبل البداية، الحصول على عينات الأنسجة البشرية وفقا لمجلس المراجعة المؤسسية (IRB) البروتوكولات. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> اختيار نوع من كتلة الأنسجة / خلية والمقابلة طريقة معالجة [الثابتة الفورمالين جزءا لا يتجزأ من البارافين (FFPE)، والمجمدة، أو الثابتة الإيثانول (EFPE) جزءا لا يتجزأ من البارافين]. يوفر التثبيت الفورمالين الأنسجة الأمثل، تليها تثبيت الإيثانول وفلاش المجمدة. ومع ذلك، يمكن تثبيت والأنسجة طرق المعالجة تؤثر على الحمض النووي، والجيش الملكي النيبالي، وكمية البروتين والجودة للتحليل الجزيئي المصب وينبغي النظر فيها. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> قطع المقاطع كتلة الأنسجة / خلية على نوع الشريحة (الزجاج، والزجاج الغشاء، أو إطار معدني الغشاء) في الاختيار. تحليل SIVQ يعمل بشكل جيد على قدم المساواة على جميع أنواع الشرائح الثلاث. يرجى ملاحظة أن الطريقة الزائفة ساترة (موضح أدناه) مع الزيلين وايثانرأ لا يمكن أن يؤديها على الشرائح غشاء إطار معدني منذ يجب مقلوب الشريحة على المسرح. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> حدد وصمة عار الأنسجة الكيميائية أو بناء IHC لتحديد الخلايا من الاهتمام من الخلفية. ملاحظة يمكن أن تؤثر أيضا على أساليب تلطيخ DNA، RNA، ونوعية البروتين وكمية من الأنسجة. اختبار الأنسجة بعد تلطيخ لتقييم جودة خط الأساس من الجزيئات الحيوية قبل الشروع في البروتوكول. وقد تم تنفيذ SIVQ-LCM على شرائح الأنسجة / علم الخلايا ملطخة: المناعية (IHC) مع DAB 15، المناعي، والأحمر بسرعة، دي نوفو الأحمر، الأزرق طولويدين، والهيماتوكسيلين ويوزين (H &amp; E) (بيانات غير منشورة). </li></ol> 2. عينة التصوير <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> تحميل الشرائح على خشبة المسرح الآلية الصك تسليخ مجهري وإطلاق البرامج ذات الصلة. حدد خانات الاختيار لتعيين مواقف الشرائح تحميل الملفات والتأكد من الصورة الملتقطة هي ليتم حفظها بتنسيق JPEG. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> تحسين ايمجودة العمر عن طريق ضبط السطوع وتركيز الصورة على الشاشة، وذلك باستخدام إما عجلة التركيز اليدوي أو من خلال برامج الصك تشريح لل. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> باستخدام أدوات الصورة داخل البرنامج أداة تشريح، وضبط سطوع المصباح وكاميرا ربح مناسب. القيم هي المثال سطوع = 60 وكسب = 220، مع الناشر. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> تركز إما يدويا أو مع ميزة التركيز التلقائي في البرنامج. </li></ol></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> التقاط صورة نظرة عامة المصغرة في الشريحة لتوفير خارطة طريق لعملية تشريح. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> للحصول على جودة الصورة المثلى لشريحة uncoverslipped، واستخدام الناشر أدناه المكثف على الصك، أو إضافة كمية صغيرة (~ 30 ميكرولتر) إما الإيثانول أو الزيلين لتحسين مؤشر الحرارية (الزائفة ساترة). عند استخدام الزيلين، أن ندرك ويجب استخدام تدابير السلامة السامة والسليم لها، بما في ذلك استخدام غطاء الدخان ومعطف المختبر واقية، ونظارات العيون، وقفازات. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> لا تضع غطاء على الشريحة LCM حتى حل الإيثانول أو الزيلين وتطهيرها بالكامل أو سيتم مشوهة البوليمر على الغطاء. </li></ol></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> التنقل الشريحة والتقاط الصور من المجالات التي سيتم تشريح في 10X، 20X، 40X أو التكبير. إذا لزم الأمر، وتعزيز صورة مع البرمجيات مثل التصحيح التلقائي (في Microsoft Office مدير صورة) كما هو موضح سابقا 22. يجب التقاط الصور بصيغة JPEG للسماح لهم أن أعيد استيراد في البرنامج اختيار الآلية. </li></ol> 3. تحليل خوارزمية للصورة <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> القبض على نقل الصور من أداة تسليخ مجهري إلى المجلد SIVQ. تثبيت وفتح حزم البرمجيات ArcturusXT، اوتوسكان وSIVQ على الكمبيوتر تعلق على صك تشريح. للوصول إلى البرنامج SIVQ، يرجى الاتصال بالدكتور يوليسيس باليس (ulysses@med.umich.edu). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> مفتوحة SIVQ وتحميل الصورة التي تم التقاطها (JPEG) من الفائدة. &lt;/ لى&gt; <li style=";text-align:right;direction:rtl"> انتقل إلى مجال الاهتمام و / أو ضبط حجم نوافذ العرض (منفذ العرض 5 و 6). في البرنامج SIVQ، منفذ العرض 5 يظهر الصورة السابقة للتجهيز ومنفذ العرض 6 يظهر الصورة بعد المعالجة 16. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> اختيار حجم ناقلات حلقة وعدد الحلقات التي سيتم استخدامها. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> حدد ميزة الصورة الأصلية ليتم القبض عن طريق النقر على الحق في ذلك في إطار العرض 6. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> انقر على زر &quot;مسح&quot; لتحليل الصورة. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ضبط الاحتمال الإحصائي للصورة مطابقة باستخدام اثنين من قضبان الانزلاق. شريط العلوي يضبط خصوصية الشاملة ناقلات، ويستخدم لاستبعاد المنطقة من الفحص الأولي (مع حساسية على النحو المحدد من قبل &quot;ستات&quot; متغير مختارة) التي قد تمثل المنطقة شملت المفرطة. على العكس، يستخدم أقل المنزلق لزيادة الحساسية، وبعد إجراء الفحص، بقصد زيادة المساحة التي تصنف على كونها المباراة. كل من هذه الضوابط المنزلق التهاب المسالك البوليةليز على &quot;ستات&quot; المتغير كما عتبة حساسية خط الأساس الأولي. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> لحفظ الصورة، انقر فوق &quot;حفظ ك JPEG&quot; (يتم حفظ الصورة الآن في ج :/ vq_test مجلد / صورة). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> تحليل الصورة مع الخوارزمية. الناتج من تحليل الخوارزمية يحتاج أن ينتج في صورة مشروحة لذلك لاستخدامها في SIVQ-LCM. في الوقت الحاضر، والإصدار الحالي من المحرك الأساسي SIVQ هو في مرحلة تجريبية إصدار الاختبارات مع توقع أن النسخة الإنتاج الكامل (متاح Q1) 2014 ستضم مجموعة كاملة تطوير البرمجيات (SDK) واجهة برمجة التطبيقات (API) للتكامل مبسطة المرشحات المكانية المقدم من المستخدمين وخطوات سير العمل معالجة البيانات المصب مع المحرك الأساسي حلقة مطابقة. وسيتم توزيع هذا SDK مع مجموعة كاملة من الوثائق. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> تأكد من أن heatmap SIVQ يتم تغيير إلى لون أحمر موحدة. </li></ol></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> تصدير الصورة. فمن الضروري لإعادة ترسيخ-الإحداثيات الموضعية في عمعاهدة الفضاء الخارجي تحليل صورة JPEG باستخدام محرر HEX للصق في رأس الملف من الصورة أداة تشريح الأصلي. ويمكن الاطلاع على البيانات المناسبة بين &quot;بداية الصورة&quot; علامة (عشرية 0xFF، 0xD8) وأول &quot;تعريف الجدول تكميم&quot; علامة (عشرية 0xFF، 0xDB). </li></ol> 4. تسليخ مجهري <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> وضع غطاء LCM في مركز المنطقة من الفائدة، حيث تم القبض على الصور لتحليل SIVQ. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> معايرة وضبط الجودة (QC) الليزر الأشعة فوق البنفسجية / الأشعة تحت الحمراء وتحسين المعلمات، بما في ذلك الطاقة، والمدة، مواقع ليزر، وسرعة القطع الأشعة فوق البنفسجية (على النحو الموصى به من قبل الشركة المصنعة). تنفيذ هذه المعايرة قبل إعادة المستوردة للصورة تحليلها. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> مفتوحة AutoScanXT (البرمجيات الاختيار الآلي) واستيراد الصورة تحليلها من ج :/ vq_test مجلد / بلدان جزر المحيط الهادئ. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> تدريب البرنامج الاختيار الآلي للاعتراف الشرح SIVQ وخلق خريطة تشريح. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> لإنشاء تريملف نينغ، حدد أربع مناطق من الفائدة (تميزت &quot;الدوائر الزرقاء&quot;) على &quot;طلاء أحمر&quot; من SIVQ صورة تحليلها. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> حدد المناطق الخلفية (تميزت &quot;المربعات الحمراء&quot;) التي هي في عدم تشريح. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> انقر على زر &quot;تحليل&quot; لإنشاء ملف التدريب، والتي يمكن حفظها لاستخدامات لاحقة. </li></ol></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> أداء تسليخ مجهري باستخدام (UV) وأشعة الليزر المناسب والأشعة تحت الحمراء (IR) و / أو الأشعة فوق البنفسجية. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> نسخ مناطق مختارة على &quot;العيش&quot; الصورة. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> في &quot;microdissect&quot; الأدوات، حدد التقاط الأشعة تحت الحمراء المناسبة أو أزرار القطع الأشعة فوق البنفسجية. </li></ol></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> بعد تشريح كاملة، حرك غطاء LCM إلى محطة مراقبة الجودة والتقاط صورة للتشريح الأنسجة / الخلايا. نهج آخر هو وضع غطاء على منطقة خالية في الشريحة قبل نقله إلى محطة مراقبة الجودة، وهذا يتيح للمستخدم التقاط الصور في تكبير مختلفة. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl">التقاط صورة للمنطقة الأنسجة من الاهتمام بعد تسليخ مجهري لمواصلة تقييم ورفع الكفاءة. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> إذا كان قد تم تشريح الخلايا المطلوب بنجاح، انقر على زر &quot;المرحلة الحالية&quot; في البرنامج ArcturusXT وإزالة الغطاء LCM للشروع في إجراء استخراج الجزيئية لتحليل المصب. </li></ol>

<ol><li>Bonner, R. F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Laser+capture+microdissection%3A+molecular+analysis+of+tissue%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Laser capture microdissection: molecular analysis of tissue.</a> Science. 278, 1481-1483 (1997).</li>
<li>Emmert-Buck, M. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Laser+capture+microdissection%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Laser capture microdissection.</a> Science. 274, 998-1001 (1996).</li>
<li>Edwards, R. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Laser+capture+microdissection+of+mammalian+tissue%5BTitle%5D)+AND+%22J+Vis+Exp%22%5BJournal%5D)">Laser capture microdissection of mammalian tissue.</a> J Vis Exp. (8), (2007).</li>
<li>El-Serag, H. B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Gene+expression+in+Barrett%27s+esophagus%3A+laser+capture+versus+whole+tissue%5BTitle%5D)+AND+%22Scandinavian+journal+of+gastroenterology%22%5BJournal%5D)">Gene expression in Barrett's esophagus: laser capture versus whole tissue.</a> Scandinavian journal of gastroenterology. 44, 787-795 (2009).</li>
<li>Espina, V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Laser-capture+microdissection%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Laser-capture microdissection.</a> Nature. 1, 586-603 (2006).</li>
<li>Harrell, J. C., Dye, W. W., Harvell, D. M., Sartorius, C. A., Horwitz, K. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Contaminating+cells+alter+gene+signatures+in+whole+organ+versus+laser+capture+microdissected+tumors%3A+a+comparison+of+experimental+breast+cancers+and+their+lymph+node+metastases%5BTitle%5D)+AND+%22Clinical+%26+experimental+metastasis%22%5BJournal%5D)">Contaminating cells alter gene signatures in whole organ versus laser capture microdissected tumors: a comparison of experimental breast cancers and their lymph node metastases.</a> Clinical & experimental metastasis. 25, 81-88 (2008).</li>
<li>Rodriguez-Canales, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Optimal+molecular+profiling+of+tissue+and+tissue+components%3A+defining+the+best+processing+and+microdissection+methods+for+biomedical+applications%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+in+molecular+biology%22%5BJournal%5D)">Optimal molecular profiling of tissue and tissue components: defining the best processing and microdissection methods for biomedical applications.</a> Methods in molecular biology. 980, 61-120 (2013).</li>
<li>Silvestri, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Protein+pathway+biomarker+analysis+of+human+cancer+reveals+requirement+for+upfront+cellular-enrichment+processing%5BTitle%5D)+AND+%22Laboratory+investigation%3B+a+journal+of+technical+methods+and+pathology%22%5BJournal%5D)">Protein pathway biomarker analysis of human cancer reveals requirement for upfront cellular-enrichment processing.</a> Laboratory investigation; a journal of technical methods and pathology. 90, 787-796 (2010).</li>
<li>Eberle, F. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Immunoguided+laser+assisted+microdissection+techniques+for+DNA+methylation+analysis+of+archival+tissue+specimens%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+molecular+diagnostics+%3A+JMD%22%5BJournal%5D)">Immunoguided laser assisted microdissection techniques for DNA methylation analysis of archival tissue specimens.</a> The Journal of molecular diagnostics : JMD. 12, 394-401 (2010).</li>
<li>Kim, H. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Distinctions+in+gastric+cancer+gene+expression+signatures+derived+from+laser+capture+microdissection+versus+histologic+macrodissection%5BTitle%5D)+AND+%22BMC+medical+genomics%22%5BJournal%5D)">Distinctions in gastric cancer gene expression signatures derived from laser capture microdissection versus histologic macrodissection.</a> BMC medical genomics. 4, 48(2011).</li>
<li>Klee, E. W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Impact+of+sample+acquisition+and+linear+amplification+on+gene+expression+profiling+of+lung+adenocarcinoma%3A+laser+capture+micro-dissection+cell-sampling+versus+bulk+tissue-sampling%5BTitle%5D)+AND+%22BMC+medical+genomics%22%5BJournal%5D)">Impact of sample acquisition and linear amplification on gene expression profiling of lung adenocarcinoma: laser capture micro-dissection cell-sampling versus bulk tissue-sampling.</a> BMC medical genomics. 2, 13(2009).</li>
<li>Zheng, J., Garg, S., Wang, J., Loose, D. S., Hauer-Jensen, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Laser+capture+microdissected+mucosa+versus+whole+tissue+specimens+for+assessment+of+radiation-induced+dynamic+molecular+and+pathway+changes+in+the+small+intestine%5BTitle%5D)+AND+%22PloS+one%22%5BJournal%5D)">Laser capture microdissected mucosa versus whole tissue specimens for assessment of radiation-induced dynamic molecular and pathway changes in the small intestine.</a> PloS one. 8, e53711(2013).</li>
<li>Boone, D. R., Sell, S. L., Hellmich, H. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Laser+capture+microdissection+of+enriched+populations+of+neurons+or+single+neurons+for+gene+expression+analysis+after+traumatic+brain+injury%5BTitle%5D)+AND+%22J+Vis+Exp%22%5BJournal%5D)">Laser capture microdissection of enriched populations of neurons or single neurons for gene expression analysis after traumatic brain injury.</a> J Vis Exp. (74), (2013).</li>
<li>Iyer, E. P., Cox, D. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Laser+capture+microdissection+of+Drosophila+peripheral+neurons%5BTitle%5D)+AND+%22J+Vis+Exp%22%5BJournal%5D)">Laser capture microdissection of Drosophila peripheral neurons.</a> J Vis Exp. (39), (2010).</li>
<li>Hipp, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((SIVQ-aided+laser+capture+microdissection%3A+A+tool+for+high-throughput+expression+profiling%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+pathology+informatics%22%5BJournal%5D)">SIVQ-aided laser capture microdissection: A tool for high-throughput expression profiling.</a> Journal of pathology informatics. 2, 19(2011).</li>
<li>Hipp, J. D., Cheng, J. Y., Toner, M., Tompkins, R. G., Balis, U. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Spatially+Invariant+Vector+Quantization%3A+A+pattern+matching+algorithm+for+multiple+classes+of+image+subject+matter+including+pathology%5BTitle%5D)+AND+%22J+Pathol+Inform%22%5BJournal%5D)">Spatially Invariant Vector Quantization: A pattern matching algorithm for multiple classes of image subject matter including pathology.</a> J Pathol Inform. 2, 13(2011).</li>
<li>Hipp, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Optimization+of+complex+cancer+morphology+detection+using+the+SIVQ+pattern+recognition+algorithm%5BTitle%5D)+AND+%22Anal+Cell+Pathol+%28Amst%29%22%5BJournal%5D)">Optimization of complex cancer morphology detection using the SIVQ pattern recognition algorithm.</a> Anal Cell Pathol (Amst). , (2011).</li>
<li>Hipp, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Integration+of+architectural+and+cytologic+drive+n+image+algorithms+for+prostate+adenocarcinoma+identification%5BTitle%5D)+AND+%22Analytical+cellular+pathology%22%5BJournal%5D)">Integration of architectural and cytologic drive n image algorithms for prostate adenocarcinoma identification.</a> Analytical cellular pathology. 35, 251-265 (2012).</li>
<li>Hipp, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Automated+area+calculation+of+histopathologic+features+using+SIVQ%5BTitle%5D)+AND+%22Anal+Cell+Pathol+%28Amst%22%5BJournal%5D)">Automated area calculation of histopathologic features using SIVQ.</a> Anal Cell Pathol (Amst. 34, (2011).</li>
<li>Cheng, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Automated+vector+selection+of+SIVQ+and+parallel+computing+integration+MATLAB%3A+Innovations+supporting+large-scale+and+high-throughput+image+analysis+studies%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+pathology%22%5BJournal%5D)">Automated vector selection of SIVQ and parallel computing integration MATLAB: Innovations supporting large-scale and high-throughput image analysis studies.</a> Journal of pathology. 2, 37(2011).</li>
<li>Roy Chowdhuri, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Semiautomated+laser+capture+microdissection+of+lung+adenocarcinoma+cytology+samples%5BTitle%5D)+AND+%22Acta+Cytol%22%5BJournal%5D)">Semiautomated laser capture microdissection of lung adenocarcinoma cytology samples.</a> Acta Cytol. 56, 622-631 (2012).</li>
<li>Hipp, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Image+Microarrays+%28IMA%29%3A+Digital+Pathology%27s+Missing+Tool%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+pathology%22%5BJournal%5D)">Image Microarrays (IMA): Digital Pathology's Missing Tool.</a> Journal of pathology. 2, (2011).</li>
<li>Hanson, J. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Expression+microdissection+adapted+to+commercial+laser+dissection+instruments%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Expression microdissection adapted to commercial laser dissection instruments.</a> Nature. 6, 457-467 (2011).</li>
</ol>

مايكل ر إيميرت-باك هو المخترع على براءة اختراع عقد NIH-يغطي الليزر التقاط تسليخ مجهري ويتلقى المدفوعات القائمة على الملوك من خلال برنامج نقل تقنية المعاهد الوطنية للصحة.

نقدم بروتوكول لتطبيق SIVQ-LCM إلى microdissect الخلايا الظهارية immunostained من FFPE أنسجة الثدي البشري. استخدام خوارزمية تحليل الصور، مثل SIVQ، يقلل من كمية التدريب العملي على الوقت اللازم لعملية تسليخ مجهري. هذا يمثل تقدما مهما محتملا للحقل منذ وقت مشغل والجهد هو عادة الحد من معدل خطوة لتشريح دقيق للخلايا الفائدة. في هذا البروتوكول، ونحن تكييفها خصيصا الإجراء لدينا في الصك ArcturusXT، على الرغم من أنه من المرجح أن يكون من الممكن التكيف SIVQ وخوارزميات أخرى لغير ذلك من صكوك تسلي...

وضعت أصلا في منتصف 1990s، التقاط الليزر تسليخ مجهري (LCM) تمكن المستخدم من التقاط أدق خلايا معينة أو المناطق الخلوية من قسم الأنسجة النسيجية عن طريق التصور المجهرية 1، 2. العديد من الدراسات المقارنة بين التحليل الجزيئي للLCM مقابل الورطات الأنسجة توضيح قيمة الأسلوب 3-12. بالإضافة إلى ذلك، هناك ثلاثة منشورات بروتوكول الفيديو على التكنولوجيا المتوفرة للعرض 13، 14. ومع ذلك، على الرغم من قيمته ثبت، ويمكن أن تكون مملة LCM وشاقة عندما يكون الهدف من الفائدة هو السكان الخلية المتفرقة في قسم الأنسجة غير المتجانسة، أو عندما يطلب أعداد كبيرة من الخلايا للتطبيقات المصب محددة مثل البروتينات. العبء الملقى على عاتق المشغل الإنسان أدت بنا إلى وضع نهج تشريح شبه الآلي للLCM من خلال الجمع بين قوية خوارزمية تحليل الصور لتوجيه عملية LCM 15. &lt;ع الطبقة = &quot;jove_content&quot;&gt; وبالتعاون مع جامعة ميتشيغان، مختبرنا في المعاهد الوطنية للصحة مددت وضعت سابقا وذكرت ثابتة مكانيا ناقلات تكميم (SIVQ) خوارزمية بطريقة تسمح لها شبه أتمتة عملية الاختيار الأنسجة الذاتية لل تسترشد تسليخ مجهري، وبالتالي إتاحة أداة مع الطبيب الشرعي أو عالم الحياة في الاعتبار. ثابتة مكانيا ناقلات تكميم (SIVQ) هو خوارزمية التي تسمح للمستخدم ببساطة &quot;فوق&quot; على ميزة النسيجية التي تهم إنشاء عصابة ناقلات (ميزة صورة أصلية) التي يمكن استخدامها للبحث في صورة النسيجية بأكمله، وضبط عتبة الإحصائية حسب الحاجة 16-21. خريطة الحرارة الناتجة يعرض نوعية المباريات إلى ميزة الصورة الأصلية الأولية ويتم تحويلها لاحقا إلى لون واحد (الأحمر) خريطة الشرح التي يمكن استيرادها إلى الصك LCM. ثم يتم استخدام البرنامج الاختيار الآلي، AutoScanXT، لرسم خريطة مقرهاعلى الشرح SIVQ في توجيه القبض على الخلايا المستهدفة من عينة الأنسجة. يصف بروتوكول مفصلة أدناه تنفيذ SIVQ في سير العمل تسليخ مجهري.

<table><tbody><tr><td>شرائح زجاجية مشحونة إيجابية</td><td>Thermo Scientific</td><td>4951Plus-001</td><td></td></tr><tr><td>Xylenes ، كاشف ACS ، & ge ؛ 98.5٪ زيلين + أساس إيثيل بنزين</td><td>سيجما ألدريتش</td><td>247642</td><td>تحذير: يرجى استخدام إجراءات السلامة المناسبة.</td></tr><tr><td>الكحول الإيثيلي ، U.S.P. 200 Proof ، اللامائي</td><td>شركة Warner-Graham</td><td>6.505E + 12</td><td>تحذير: يرجى استخدام إجراءات السلامة المناسبة.</td></tr><tr><td>Arcturus CapSure Macro LCM Caps</td><td>Life Technologies</td><td>LCM0211</td><td></td></tr><tr><td>ArcturusXT Laser Microdissect Instrument</td><td>Life Technologies</td><td>ARCTURUSXT</td><td></td></tr><tr><td>AutoScanXT Software</td><td>Life Technologies</td><td></td><td>برنامج اختياري لتحليل الصور لجهاز التشريح الدقيق بالليزر ArcturusXT. هذا البرنامج مطلوب ل SIVQ-LCM.</td></tr><tr><td>تكميم المتجهات الثابتة مكانيا (SIVQ)</td><td>جامعة ميشيغان</td><td></td><td>مجموعة الأدوات هذه متاحة للجمهور للتعاون الأكاديمي. للوصول إلى خوارزمية SIVQ ، يرجى الاتصال بالدكتور أوليسيس باليس [Ulysses@med.umich.edu]</td></tr></tbody></table>

بروتوكول sivq-lcm لالصك arcturusxt

SIVQ-LCM Protocol for the ArcturusXT Instrument

SIVQ-LCM هو منهجية جديدة بأتمتة ويبسط عملية تشريح الليزر التي تعتمد على المستخدم أكثر تقليدية. انها تهدف الى خلق المتقدمة، تخصيص بسرعة منصة تكنولوجيا تشريح الليزر. في هذا التقرير، ونحن تصف التكامل بين برامج تحليل الصور الثابتة مكانيا ناقل تكميم (SIVQ) على الصك ArcturusXT. يحتوي على نظام ArcturusXT كلا من الأشعة تحت الحمراء (IR) والأشعة فوق البنفسجية (UV) ليزر، مما يسمح للخلية معينة أو تشريح منطقة واسعة. الهدف الرئيسي هو تحسين السرعة والدقة، واستنساخ تشريح الليزر لزيادة الإنتاجية عينة. هذا النهج رواية يسهل تسليخ مجهري كل من الحيوانات والأنسجة البشرية في مجال البحوث وسير العمل السريري.

تم immunostained قسم أنسجة الثدي الإنسان FFPE لcytokeratin AE1/AE3 باستخدام بروتوكول قياسي IHC 23. بعد تلطيخ، وضعت الشريحة الأنسجة على المسرح ArcturusXT وبدأ بروتوكول SIVQ-LCM كما هو موضح أعلاه. منذ الأنسجة لا يمكن لcoverslipped تسليخ مجهري، يمكن للخلايا IHC + ملطخة يكون من الصعب تمييز بصريا (الشكل 1A). وبالتالي، لتوفير أفضل مؤشر مطابقة وصورة محسنة، وأضيفت الزيلين إلى قسم الأنسجة لخلق الزائفة ساترة 15 (الشكل 1B). ثم تم القبض ...

SIVQ-LCM هو نهج المبتكرة التي يسخر خوارزمية الكمبيوتر، مكانيا ثابتة ناقل تكميم (SIVQ)، لدفع التقاط الليزر تسليخ مجهري (LCM) العملية. سير العمل SIVQ-LCM يحسن كثيرا من سرعة ودقة تسليخ مجهري، مع تطبيقات في كل من البحوث والمرافق الصحية.

بروتوكول SIVQ-LCM لالصك ArcturusXT

SIVQ-LCM is a new methodology that automates and streamlines the more traditional, user-dependent laser dissection process.&#160;It aims to create an ...

الهدف العام من هذا الإجراء هو استخدام تحليل الصور القائم على التكميم الشعاعي الثابت مكانيًا، أو SIVQ، بالاقتران مع التشريح الدقيق بالالتقاط الليزري أو LCM، لتحديد سمات الأنسجة ذات الأهمية وإجراء تشريح دقيق موجه وبسرعة. يتم تحقيق ذلك أولاً عن طريق التقاط صور للأنسجة المستهدفة لغرض تحليل SIVQ، ثم يتم إجراء تحليل SIVQ، واستيراد تعليقات SIVQ التوضيحية إلى جهاز التشريح الدقيق من أجل المعالجة.في النهاية، يمكن عزل الخلايا المستهدفة بواسطة S-I-V-Q-L-C-M لإجراء التحليلات الجزيئية اللاحقة. وتتمثل الميزة الرئيسية لهذه التقنية مقارنة بالطرق الحالية في أن S-I-V-Q-L-C-M تسهل عملية اختيار واستئصال دقيق لمناطق مستهدفة واسعة، والتي قد تكون صعبة وتتطلب وقتاً طويلاً عند استخدام تقنيات الاستئصال الدقيق بالليزر التقليدية. وسيقوم الدكتور Avi Rosenberg، وهو زميل إكلينيكي في مختبرنا، بتوضيح الإجراء الخاص بتصوير عينات الأنسجة المستهدفة.أولاً، ضع الشرائح على المنصة الآلية لجهاز التشريح المجهري وقم بتشغيل البرنامج ذي الصلة. بعد ذلك، حدد مربعات الاختيار المناسبة لتعيين مواقع الشرائح المحملة، وتأكد من حفظ ملفات الصور الملتقطة بتنسيق JPEG. اضبط السطوع والتركيز للصورة على الشاشة لتحسين جودة الصورة.بعد ذلك، باستخدام صندوق أدوات الفحص، قم بتفعيل المشتت الضوئي واضبط سطوع المصباح على 60 وكسب الكاميرا على 20. في نافذة العرض العام، انقر بزر الفأرة الأيمن للاختيار، ثم "تذكر الإعدادات" (remember settings) واحفظها. التقط صورة مصغرة عامة للشريحة لتكون بمثابة خريطة توجيهية لعملية التشريح.اضبط قوة التكبير وحدد المنطقة المراد دراستها. ثم التقط صورة للمنطقة لتحليل الصور الملتقطة بواسطة الخوارزمية. ابدأ بنقل الصور إلى مجلد SIVQ.افتح بعد ذلك برنامج SIVQ وقم بتحميل الصورة الملتقطة والمطلوبة. انتقل إلى المنطقة المستهدفة واضبط حجم نافذتي العرض الخامسة والسادسة دون تعديل تكبير الصورة. ثم حدد حجم متجه الحلقة وعدد الحلقات التي سيتم استخدامها للتحليل.انقر بزر الفأرة الأيمن على ميزة صورة المسند المراد التقاطها في نافذة العرض السادسة، واختر الخريطة الحرارية (heat map)، ثم انقر على "scan to X" لتحليل الصورة. بعد ذلك، استخدم الشريط المنزلق الأفقي العلوي من بين الشريطين لضبط خصوصية المتجه العامة. واستخدم الشريط السفلي لزيادة الحساسية بعد إتمام عملية المسح.لزيادة المساحة المصنفة كمطابقة، قم بإلغاء تحديد مربع اختيار الخريطة الحرارية للتأكد من تحويل الخريطة الحرارية لـ SIVQ إلى لون أحمر موحد، ثم قم بزيادة حجم التلوين. احفظ الصورة بالنقر على زر حفظ الصورة، ثم قم بتحويل مخرج BMP إلى تنسيق ملف JPEG.ثم استخدم محرر سداسي عشري (hex editor) لإعادة كتابة الإحداثيات الموضعية الموجودة بين علامة بداية الصورة وعلامة أول جدول تكميم محدد في رأس ملف JPEG الخاص بمرحلة ما بعد التحليل، والمستمدة من صورة جهاز التشريح الأصلية قبل البدء في التشريح المجهري. ضع غطاء التشريح المجهري بالتقاط الليزر (LCM) في مركز المنطقة المستهدفة التي التقطت منها الصور لتحليل SIVQ. بعد ذلك، وبعد معايرة ليزر الأشعة فوق البنفسجية (UV) والأشعة تحت الحمراء، قم بتحسين المعايير بما في ذلك مدة الطاقة، ومواقع الليزر، وسرعة القطع بالأشعة فوق البنفسجية.بعد ذلك، افتح برنامج الاختيار الآلي واستورد الصورة التي تم تحليلها. أنشئ ملف تحليل جديد لتدريب برنامج الاختيار الآلي على التعرف على تعليق SIVQ. الآن، حدد مناطق الخلفية المميزة بالمربعات الزرقاء في صورة SIVQ التي تم تحليلها.بعد ذلك، حدد مناطق الاهتمام (ROIs) المشار إليها بالدوائر الحمراء، وانقر على "learn" لإنشاء ملف التدريب. ثم انسخ المناطق المحددة إلى الصورة المباشرة. ولبدء التشريح المجهري، اختر صندوق أدوات التشريح المجهري (microdisect toolbox) ثم حدد أزرار الالتقاط بالأشعة تحت الحمراء أو القطع بالأشعة فوق البنفسجية المناسبة.بعد اكتمال عملية التشريح، انقل غطاء الـ LCM إلى محطة مراقبة الجودة والتقط صورة للعينة التي تم تشريحها. وأخيرًا، إذا تم تشريح العينات المطلوبة بنجاح، انقر فوق زر المرحلة الحالية وأزل غطاء الـ LCM لبدء إجراء الاستخلاص الجزيئي للتحليل اللاحق. في هذه التجربة النموذجية، تم إجراء صبغ مناعي لقطاع من أنسجة الثدي البشرية المثبتة بالفورمالين والمطمورة في البارافين للكشف عن cytokeratin AE one و AE three باستخدام بروتوكول كيمياء نسيجية مناعية قياسي.بما أن هذه الأنسجة لا يمكن تغطيتها بشريحة غطاء من أجل التشريح المجهري، فقد يكون من الصعب تقدير الخلايا المصبوغة كيميائيًا مناعيًا بصريًا. لذا، ومن أجل توفير مطابقة أفضل للمؤشر وتحسين الصورة، تمت إضافة الزيلين إلى مقطع النسيج لإنشاء شريحة غطاء وهمية. بعد ذلك، تم التقاط صورة JPEG للمنطقة ذات شريحة الغطاء الوهمية واستيرادها إلى SIVQ لإجراء تحليل الخوارزمية.قام المستخدم باختيار سمة صورة تنبؤية تظهر على شكل صبغة DAB بنية داكنة، ثم تم تشغيل خوارزمية SIVQ لتحليل الصورة. بعد ذلك، تم تحويل الخريطة الحرارية لـ SIVQ إلى طلاء أحمر يتعرف عليه برنامج الاختيار الآلي، وتُرِك الزيلين ليتبخر. ثم استورد برنامج الاختيار الآلي الخريطة الحرارية لـ SIVQ.وأخيراً، تم تشريح الخلايا المحددة باستخدام ليزر الأشعة تحت الحمراء. ثم نُقل غطاء LCM إلى محطة مراقبة الجودة في جهاز التشريح المجهري وفُحص بصرياً لتقييم نجاح عملية التشريح. كما تم فحص النسيج المتبقي وإعادة استيراد الخريطة الحرارية لـ SIVQ.لتأكيد كفاءة التشريح الدقيق بشكل أكبر، بمجرد إتقان تقنية S-I-V-Q-L-C-M، يمكن تنفيذها في غضون دقائق لكل شريحة، مما يوفر بسرعة مدخلات مخصبة لمجموعة متنوعة من التقنيات التحليلية اللاحقة. بعد مشاهدة هذا الفيديو، يجب أن تكون لديك معرفة جيدة بكيفية دمج S-I-V-Q-L-C-M في سير عمل التشريح الدقيق الخاص بك.

sivq-lcm-protocol-for-the-arcturusxt-instrument

Research

JoVE Journal

Biology

علم الأحياء

هنا نقدم بروتوكول لبناء مطياف Brillouin السريع. المتتالية تصوير تقريبا مجموعة مرحلة (VIPA) etalons تحقيق سرعة قياس أكثر من 1000 مرة أسرع من المسح التقليدي الطيف فابري بيرو. يوفر هذا التحسن وسيلة لتحليل Brillouin من الأنسجة والمواد الحيوية عند مستويات منخفضة الطاقة في الجسم الحي.

عالية السرعة غيغاهرتز الفرعي مطياف لتحليل Brillouin نثر

توفر هذه المقالة دليلا متعمقا لتجميع وتشغيل مجهر إضاءة هيكلي يعمل مع إضاءة مضان الانعكاس الداخلي الكلي (TIRF-SIM) لتصوير العمليات البيولوجية الديناميكية بدقة بصرية فائقة بألوان متعددة.

دليل لهيكلة الإضاءة TIRF المجهري بسرعة عالية مع الألوان متعددة

توفر أطياف الأشعة السينية ثروة من المعلومات عن البلازما ارتفاع في درجة الحرارة. تقدم هذه المخطوطة تشغيل دقة عالية الطول الموجي التصوير مكانيا مطياف الأشعة السينية المستخدمة لعرض أيونات بالهيدروجين والهليوم مثل العناصر العدد الذري المتوسطة في البلازما توكاماك.

تطبيق الأشعة السينية التصوير الطيفي كريستال لاستخدامها بوصفها درجة الحرارة عالية البلازما التشخيص

تحديد هيكل الحل من البروتين زاوية صغيرة للأشعة السينية نثر (SAXS) يتطلب عينات monodisperse. هنا، نقدم احتمالين لضمان الحد الأدنى من التأخير بين إعداد العينات والحصول على البيانات: الإنترنت الحجم الاستبعاد اللوني (SEC) على الانترنت والتبادل الأيوني اللوني (IEC).

على الانترنت الحجم الاستبعاد والتبادل الأيوني اللوني على SAXS خط الأشعة

يتم وصف تفاصيل إنشاء الإشارة وتحسينها والقياس والحصول على البيانات ومعالجة البيانات لمطياف RAMan المحفز ة على وقت femtosecond. وتحفز الأشعة تحت الحمراء بالقرب من دراسة رامان على ديناميات متحمس الدولة من β كاروتين في التولوين يظهر كتطبيق تمثيلي.

فائق السرعة الوقت حل بالقرب من الأشعة تحت الحمراء حفز اختبارات رامان من أنظمة وظيفية مشبهة

نحن نقدم مخططا عاما لطرق التحليل الدقيق الكمية لتقدير إشغالات الموقع للشوائب وحالاتها الكيميائية من خلال الاستفادة من ظواهر توجيه الإلكترونات في ظل ظروف اهتزاز شعاع الإلكترون الحادث ، والتي تستخرج معلومات موثوقة من أنواع الأقليات ، وعناصر الضوء ، والشواغر الأكسجين ، وغيرها من عيوب النقطة / الخط / الخط.

تحليل الموقع الذري الكمي لعيوب Dopants / نقطة وظيفية في المواد البلورية عن طريق التحليل الدقيق المعزز لتوجيه الإلكترون

هنا ، نقدم بروتوكولا لإعداد العينات المبردة ونقل البلورات إلى المحطة النهائية الفراغية على خط الشعاع I23 في Diamond Light Source ، لتجارب علم البلورات بالأشعة السينية الجزيئية الكبيرة طويلة الطول الموجي.

بروتوكول تحضير العينات ونقلها لعلم البلورات طويل الطول الموجي داخل الفراغ على خط الشعاع I23 في مصدر ضوء الماس

يعد مطياف الحركة الأيونية (IMS) مكملا مثيرا للاهتمام لقياس الطيف الكتلي لتوصيف الجزيئات الحيوية ، لا سيما لأنه حساس للأيزومريا. يصف هذا البروتوكول تجربة IMS (IMS / IMS) جنبا إلى جنب ، والتي تسمح بعزل الجزيء وتوليد ملفات تعريف التنقل لشظاياه.

استخدام مطياف حركة الأيونات الدورية لتجارب التنقل الأيوني الترادفي

تقارن هذه الورقة بشكل مباشر بين الدقة والحساسية وتباين التصوير لتشتت رامان المحفز (SRS) وتشتت رامان المضاد لستوكس (CARS) المتكامل في نفس منصة المجهر. تظهر النتائج أن CARS لديها دقة مكانية أفضل ، و SRS يعطي تباينات أفضل ودقة طيفية ، وكلتا الطريقتين لهما حساسية مماثلة.

مقارنة مباشرة بين تشتت رامان المحفز فوق الطيف ومجهر تشتت رامان المضاد للستوكس للتصوير الكيميائي

هنا ، نستخدم مثبت البوليمر لإعداد معلقات الإطار المعدني العضوي (MOF) التي تظهر انخفاضا ملحوظا في التشتت في أطياف الحالة الأرضية والامتصاص العابر. مع تعليق الأطر العضوية العضوية هذه ، يوفر البروتوكول إرشادات مختلفة لتوصيف الأطر الفلزية العضوية طيفيا للحصول على بيانات قابلة للتفسير.

دليل تقني لإجراء القياسات الطيفية على الأطر المعدنية العضوية

تعلم تقنية SIVQ-LCM لتحسين استئصال الأنسجة بالليزر بدقة عالية. تُسرّع هذه الطريقة عزل الخلايا للتحليل الجزيئي في البحوث العصبية والسريرية.

بروتوكول SIVQ-LCM لالصك ArcturusXT

استكشف المزيد من الفيديوهات