تقييم نشاط مضاد للفطريات المعزولة من السنخية الضامة التي كتبها متحد البؤر المجهري

الهدف العام من هذا الإجراء هو مقارنة قدرة البلاعم على التحكم في نمو ceto الفطرية candia ex vivo. يتم تحقيق ذلك عن طريق وضع العلامات الأولى على البلاعم السنخية في الجسم الحي بصبغة محبة للدهون PKH 26. الخطوة الثانية من الإجراء هي حصاد البلاعم السنخية من الفئران الملقحة عن طريق غسل القصبات الهوائية.

الخطوة الثالثة هي استزراع وجمع الجراثيم الفطرية الإيجابية ل GFP. تتمثل الخطوات النهائية في تحدي البلاعم باستخدام كانديا إيجابية GFP وخلايا ثابتة في نقاط زمنية محددة مسبقا. في النهاية ، مع الحد الأدنى من التلاعب بالخلايا خارج الجسم الحي ، يمكن أن يكشف الفحص المجهري متحد البؤر عن قدرة البلاعم السنخية على التحكم في نمو البلعمة.

الجراثيم أولا تخفف الصبغة المحبة للدهون P HK 26 ، من 1 إلى خمسة. في المخفف C ، سيتم امتصاص الصبغة بواسطة الخلايا الحمضية FOC. قم بتحميل 100 ميكرولتر من P HK 26 المخفف في حقنة نصف سم مكعب وحقن الصبغة عن طريق الوريد خلف الحجاج ، أو عن طريق الوريد الذيل.

قدر أن كل ماوس سيوفر ثلاثة إلى 500،000 من البلاعم المسمى بعد 10 أيام. قتل الفئران الرحيم والاستعداد لفتح تجويف الصدر من الحجاب الحاجز. اقطع ثقبا صغيرا في القفص الصدري على يمين الصدر لتفريغ الرئتين ولعرض تضخم الرئتين لاحقا.

بعد ذلك ، حدد موقع القصبة الهوائية وعزلها عن الأنسجة المحيطة. ثم باستخدام ملقط منحني ، قم بقطع المغامرة بعناية ، والتي غطت القصبة الهوائية. بمجرد تعرضها ، أدخل قسطرة في القصبة الهوائية.

من المهم جدا تجنب ثقب القصبة الهوائية. عند تنفيذ هذه المناورة ، قم بتأمين القسطرة بطول 10 سم من الخيط الملتفة حول القصبة الهوائية. ثم قم بإزالة الإبرة من القسطرة.

بعد ذلك ، املأ حقنة سعة ستة ملليلتر بسائل الغسيل وقم بتثبيتها على قضيب إيقاف رباعي الاتجاهات. قم بتوصيل حقنة فارغة سعة ستة ملليلتر في موضع آخر وقم بتوصيل المنفذ المفتوح بالقسطرة بعناية. مع وجود التجميع في مكانه ، افتح قضيب الإيقاف على المحقنة الكاملة وقم بحقن حوالي مليلتر واحد من المحلول ببطء في الرئتين.

بعد ذلك ، أدر قضيب الإيقاف لإغلاق المحقنة وسحب السوائل. ثم اسحب بعناية سائل الرئة الغني بالبلاعم أثناء مراقبة انكماش الرئتين. كرر هذه العملية حتى يتم حقن كل المحلول وجمعه من الرئتين.

توقع بعض فقدان السوائل. لن تتمكن من إزالة السائل من الرئتين إذا كانت القسطرة في الوضع الخطأ. حرك القسطرة بعناية ذهابا وإيابا حتى يمكن سحب السائل بسهولة من الرئتين.

تأكد من عدم السماح للقسطرة بالسقوط. ثم انقل سائل الغسيل الذي تم جمعه إلى مخروطي 50 مليلتر لجمع الخلايا ، وقم بالطرد المركزي للسائل عند 300 جم لمدة خمس دقائق. في درجة حرارة الغرفة ، اسكب المادة الطافية وإذا رغبت في ذلك ، احفظها لتحليل السيتوكين.

أعد تعليق الخلايا في واحد إلى خمسة ملليلتر من RPMI 1640 مع 10٪ FBS وتحديد كثافتها. يجب أن يكون ما لا يقل عن 95٪ من الخلايا عبارة عن ضامة للثقافة. Aspergillus fumigatus التعبير عن GFP بيران تسريب قلب الدماغ.

أ الغلياطات الزراعية المعالجة ب 0.05 جرام من الكلورامفينيكول و 0.5 جرام من الجنتاميسين لكل لتر. احتضان الفطريات على الألواح المغطاة بشكل فضفاض في الظلام وفي درجة حرارة الغرفة. بعد سبعة إلى 10 أيام ، احصد كندا عن طريق غسل كل مائل ب 10 ملليلتر من 0.01٪ Tween 20 في DPBS استخدم STR PET لتخفيف الفطريات واستخدام عدة شطف لزيادة المحصول.

مرر المعلق عبر مصفاة 100 ميكرون واجمع المرشح الذي يحتوي على الكيديا. في بركة مخروطية سعة 50 مليلتر ، تدور kedia مع 10 دقائق عند 400 Gs في درجة حرارة الغرفة. ثم أعد تعليقها في 50 مل من DPBS وحدد تركيزها باستخدام مقياس الخلوي الدموي.

أخيرا ، اغسل الكيديا مرتين أخريين باستخدام DBBS وأعد تعليقها بالتركيز المطلوب. يجب تحضير زلات الغطاء الأولى والألواح تحت خزانة السلامة البيولوجية. انقع غطاء مربع مقاس 22 ملم في 70٪ من الإيثانول لمدة خمس إلى 10 دقائق.

ثم اشطفها في PBS لكل نقطة زمنية للمعالجة ، استخدم الملقط لوضع زلات غطاء معقمة واحدة برفق في آبار ستة ألواح تحميل بئر لكل حالة تم اختبارها على كل بذرة زلة غطاء حوالي 1 مليون PKH 26 ضامة مسمى في 300 ميكرولتر من RPMI 1640 مع 10٪ FBS تحتضن الخلايا عند 37 درجة مئوية مع 5٪ ثاني أكسيد الكربون بين عشية وضحاها. في صباح اليوم التالي إلى كل زلة غطاء جالسة في 10 مليون GFP التعبير عن الرشاشيات fuma Gattis kedia في 100 ميكرولتر من RPMI الدافئة 1640 مع 10٪ FBS. أعد الألواح إلى الحاضنة طوال مدة التحدي وقم بإصلاح الخلايا على فترات زمنية محددة مسبقا لتسجيل النتائج.

لإصلاح صفيحة من الخلايا ، أضف حجما واحدا من 2٪ فورمالديهايد إلى كل بئر ، واترك اللوحة لمدة ساعتين في درجة حرارة الغرفة. بعد ساعتين ، حرك اللوحة إلى أربع درجات مئوية حتى يتم إصلاح الألواح الأخرى أيضا. أولا ، قم بإعداد شريحة زجاجية بستة ميكرولترات من وسط تركيب الفلورسنت مع dappy عندما يتم تثبيت جميع الألواح ، قم بإزالة زلات الغطاء برفق باستخدام ملقط واشطفها في حمام DPBS لمدة دقيقة.

ثم امسح حوافها لإزالة السوائل الزائدة. بعد ذلك ، ضع الغطاء برفق ، وانزلق لأسفل في وسط التثبيت المعد على الشريحة الزجاجية في وقت سابق. ليست هناك حاجة للضغط على الشريحة حتى ينتشر الوسيط.

أغلق الشريحة بطلاء الأظافر واتركها تجف في الهواء. قم بتخزين الشرائح في درجة حرارة الغرفة في الظلام حتى يمكن عرضها في الجسم الحي. المسمى السنخية.

تم جمع البلاعم ثم تعرضت لتحدي فطري. الفئران والفئران البرية التي تحمل طفرة في N-A-D-P-H. تم استخدام الأوكسيديز لحصاد البلاعم بعد ثلاث أو سبع ساعات.

كان البلعمة متشابهة في النوع البري والسلالات الطافرة. كانت الخلايا التي تحتوي على كانديا إيجابية لكل من PKH 26 و GFP وفيرة في جميع الأنماط الجينية الثلاثة ، ومع ذلك ، ظهرت اختلافات في 14 ساعة فيما يتعلق بقدرة الضامة على التحكم في نمو Candia البلعمة. تم العثور على العديد من البلاعم البرية السليمة التي تحتوي على بلعمة الكبض.

وقد لوحظ هذا أيضا في الخلايا التي تحتوي على إنزيم أوكسيديز N-A-D-P-H الوظيفي في NCF. على النقيض من ذلك ، كانت البلاعم السنخية السليمة التي تفتقر إلى أكسيداز N-A-D-P-H نادرة ، مما يشير إلى أن Phace toast Kedia قد نما لتدمير الخلايا. يشير هذا أيضا إلى أن التحكم في نمو توست فاسي Kedia يعتمد على N-A-D-P-H أوكسيديز بمجرد إتقانها ، يمكن إجراء تقنية الغسيل هذه في حوالي خمس دقائق لكل فأر إذا تم إجراؤها بشكل صحيح.