التعبير عن المؤتلف سلولاز Cel5A من الترايكوديرما reesei في نباتات التبغ

الهدف العام من التجربة التالية هو التعبير عن البروتينات المستهدفة بشكل عابر في التبغ للحصول على فكرة عن جدوى التعبير عن الإنزيم النباتي في إطار زمني قصير. يتم تحقيق هذا التعبير العابر عن طريق تسلل أوراق التبغ بسلالة من الورم الزراعي ، والذي يحتوي على ناقل يشتمل على الجين محل الاهتمام كخطوة ثانية بعد الحضانة يتم حصاد أوراق النبات المتسللة وتنقية مستخلصات البروتين جزئيا للحصول على محلول إنزيم عامل. يتم إجراء تحليل البروتين التالي من أجل تقييم تأثيرات التعبير النباتي على الإنزيم والتحقق من نشاطه الأنزيمي.

تم الحصول على النتائج التي تظهر حجم البروتين وتأثيرات الجليكوزيل المحتملة والنشاط الأنزيمي بناء على فحوصات النشاف الغربي و zy وتدهور الركيزة. يمكن أن تساعد هذه الطريقة في الإجابة على الأسئلة الرئيسية حول تحويل الكتلة الحيوية للنبات ويمكن أن توفر أيضا نظرة ثاقبة لنشاط الإنزيمات بعد التعبير عنها بشكل عابر في التبغ. يعد العرض المرئي لهذه الطريقة أمرا بالغ الأهمية حيث يصعب تعلم خطوات التسلل بسبب تلف الأوراق بسهولة بسبب ملابس المحقنة وسأقوم بإجراء التجارب في ظل ظروف معقمة.

انقل مستعمرات مفردة من agrobacterium toan إلى قارورة إرلينماير تحتوي على 10 ملليلتر. مرق مستخلص الخميرة مع المضادات الحيوية. ثم احتضان المرق الملقح لمدة 36 إلى 40 ساعة عند 26 درجة مئوية مع اهتزاز 180 دورة في الدقيقة بعد ذلك ، قم بتلقيح 200 ميكرولتر من كل مزرعة في 20 مل من مرق مستخلص الخميرة بنفس المضادات الحيوية كما كان من قبل واحتضانه في نفس الظروف بعد 36 إلى 40 ساعة.

قم بتحفيز الثقافات باستخدام ميكرولترين من الأسيتوفينون ، و 100 ميكرولتر من محلول الجلوكوز بنسبة 40٪ و 200 ميكرولتر من محلول MES مولي واحد عند درجة الحموضة 5.6 واستمر في الحضانة بين عشية وضحاها. الآن خذ النباتات من الدفيئة واستخدم طرف ماصة لقطع الجانب المحوري AB من الورقة الثالثة إلى الخامسة من أعلى النبات لتسهيل التسلل. ثم املأ حقنة بوسيط تسلل وضعها على أحد النكات التي تم تصنيعها مسبقا.

ادعم المحقنة بإصبع على جانب ورقة axio وحقن الوسط بعناية في منطقة الأوراق الوريدية. لتصور التألق في أقسام الأوراق التي تعبر عن خلية TR 5:00 صباحا ، قم بتلميع النباتات بمصدر ضوء محمول ينبعث منه ضوء أخضر. عند النظر إليها من خلال مرشح أحمر ، سيكون التألق من خلية TR 5:00 صباحا مرئيا بوضوح.

لاستخراج البروتينات المعبر عنها ، حدد أوراق التبغ التي تم اختراقها باستخدام AUM التي تحتوي على P تتبع خلية ERTR خمسة A وقم بتقطيعها إلى قطع جرام واحد. بعد ذلك ، ضعها في ملاط مبرد مسبقا وأضف كمية مناسبة من النيتروجين السائل إلى العينات. طحن الأوراق إلى مسحوق باستخدام مدقة.

كرر العملية مع أوراق التبغ غير المخللة للحصول على عينات تحكم. ثم أضف ملليلترين من PBS الذي يحتوي على فلوريد مليل مولر فينيل ميثيل سوين إلى مادة الأوراق الأرضية واخلطه حتى تصبح غالبية الأوراق معلقة. الطرد المركزي المستخلص عند 15 ، 000 GS لمدة 20 دقيقة عند أربع درجات مئوية.

ثم تخلص من الحبيبات ، خلية TR المنقاة جزئيا خمسة أ عن طريق احتضان البروتين الذي يحتوي على S natin عند 55 درجة مئوية لمدة 10 دقائق واتركه يرتاح في درجة حرارة الغرفة لمدة 10 دقائق أخرى. ثم جهاز الطرد المركزي SNAT عند 15 ، 000 GS لمدة 10 دقائق في درجة حرارة الغرفة. تخلص من الحبيبات واستخدم البروتين المحتوي على snat للجميع.

مزيد من المقايسات. قم أيضا بإجراء عملية التنقية الجزئية للنباتات غير المتسللة للحصول على عينات التحكم. في هذا الإجراء ، اخلطي السليلوز الإيثيلي والماء للحصول على محلول 1.5٪ واحتضانها مع التحريك حتى تذوب.

لصنع هلام صفحة A-C-M-C-S-D-S استبدل ملليلتر واحد من 1.5٪ CMC بمليلتر واحد من الماء في محلول مزيج هلام صفحة SDS سعة 10 ملليلتر وصب الجل بشكل طبيعي بعد ذلك ، قم بتغيير طبيعة العينات عن طريق غليها في وجود SDS. قم بإجراء الرحلان الكهربائي عند 200 فولت لمدة 50 دقيقة حتى تصل مقدمة الصبغة إلى قاع الجل. قم بإجراء الآن في إعادة طي البروتين الجل على هلام صفحة النقطة 15٪ C-M-C-S-D-S.

استخدام 1.5٪ بيتا سيكلودكسترين في مخزن 20 مللي مولار لسترات الفوسفات عند درجة الحموضة 6.5. احتضن الجل في هذا المحلول في درجة حرارة الغرفة مع رج لطيف لمدة 15 دقيقة. تخلص من محلول بيتا سيكلودكسترين واغسل الجل لفترة وجيزة بالماء المحتضن في درجة حرارة الغرفة في 50 مللي مولار أسيتات الصوديوم عند درجة الحموضة 4.8 لمدة 15 دقيقة أخرى.

ثم قم بإجراء CMC zy باستخدام هلام الصفحة النقطة المعاد طيها 15٪ C-M-C-S-D-S عن طريق احتضان الجل في 30 مللي مولار من أسيتات الصوديوم لمدة 20 دقيقة عند 50 درجة مئوية. لتصور مكان تحلل CMC ، قم بتلطيخ الجل لمدة 10 دقائق باستخدام محلول أحمر 0.1٪ كونغو واحتجزه باستخدام كلوريد الصوديوم المولي لمدة 30 دقيقة أو حتى يتم ملاحظة شرائط واضحة في النهاية ، اغسل الجل بحمض الخليك 0.3٪. للحصول على تصوير أكثر وضوحا مباشرة قبل إجراء الفحص ، قم بإعداد ماصة محلول عمل بأربعة MUC اثنين X سعة 100 ميكرولتر من أربعة حلول عمل MUC في آبار منفصلة من لوحة 96 بئر.

ثم أضف 100 ميكرولتر من كل عينة إلى الآبار المناسبة التي تدير كل عينة بثلاث نسخ باستخدام طول موجة إثارة يبلغ 360 نانومتر وطول موجة انبعاث يبلغ 465 نانومتر. تحديد نقطة زمنية دقيقة الصفر لأربعة مضان mu من خلال التحليل الطيفي الفلوري. بعد ذلك ، احتضان الألواح المغطاة بأغطية لاصقة عند 50 درجة مئوية لمدة 20 دقيقة.

بعد ذلك ، أوقف التفاعل عن طريق التجميد. بعد ذلك ، قم بقياس مضان نقطة النهاية باستخدام نفس المعلمات المستخدمة في نقطة زمنية الدقيقة الصفر. اطرح قيمة التألق عند دقيقة الصفر من قيمة التألق في 20 دقيقة لتحديد التغير في التألق الناجم عن النشاط الأنزيمي مباشرة قبل إجراء الفحص.

قم بإعداد حل العمل A-O-C-M-C اثنين من X. ثم امزج 50 ميكرولترا من العينة و 50 ميكرولترا من محلول العمل في أنبوب سعة 1.5 ملليلتر. بعد ذلك ، احتضان العينات لمدة 20 دقيقة عند 50 درجة مئوية.

أوقف التفاعل بإضافة 250 ميكرولتر من محلول الترسيب. بعد ذلك ، قم بدوامة كل عينة بقوة لمدة 10 ثوان لضمان الخلط الكامل للعينة مع محلول هطول الأمطار. ثم احتضان العينات في درجة حرارة الغرفة لمدة 10 دقائق وقم بتدويرها مرة أخرى قبل طردها عند 1000 جي لمدة 10 دقائق.

بعد ذلك ، انقل 200 ميكرولتر من SNAT من كل عينة إلى لوحة بئر 96 دون إزعاج. يظهر النشاط الأنزيمي للحبيبات من خلال مستويات أعلى من الصبغة القابلة للذوبان. قم بقياس ذلك باستخدام التحليل الطيفي الماص بطول موجي 590 نانومتر.

في هذه الخطوة. ضع دوائر من ورق الترشيح في 1.5 أو اثنين من أنابيب المليلتر. أضف 100 ميكرولتر من أسيتات الصوديوم 60 مللي مولار و 100 ميكرولتر من العينات إلى دوائر ورق الترشيح واحتضانها لمدة 20 ساعة عند 50 درجة مئوية مع اهتزاز 300 دورة في الدقيقة.

بالإضافة إلى ذلك ، احتضان العينات الفردية بدون ورق ترشيح كعناصر تحكم مباشرة قبل تشغيل الفحص. قم بإعداد محلول عمل 1.5 × PABA يحتوي على مليلتر واحد من محلول PBA A وتسعة ملليلتر من محلول PABA B.Store على الثلج حتى الاستخدام. بعد ذلك ، قم بإعداد العينات في أنابيب مستقرة حراريا سعة 0.5 ملليلتر.

تتكون العينات من 45 ميكرولتر من الماء ، وخمسة ميكرولتر من كل محلول محتضن بورق ترشيح و 100 ميكرولتر من محلول عمل PABA. بعد ذلك ، قم بتشغيل عناصر التحكم في العينة وخمسة معايير معدة بنفس الطريقة. ثم احتضان العينات والضوابط والمعايير لمدة 10 دقائق بالضبط عند 100 درجة مئوية وتبرد في درجة حرارة الغرفة لمدة 10 دقائق أخرى.

ماصة 100 ميكرولتر من المحلول في لوحة بئر 96 ، وهي اختبار بمقياس الطيف الضوئي بطول موجي يبلغ 410 نانومتر. اطرح قيم التحكم في العينة الفردية من قيم عينة ورق الترشيح لتحديد كمية السكريات المختزلة المنبعثة. فيما يلي صورة توضح أشرطة التعبير بالإضافة إلى تعبير البروتين في نباتات التبغ.

هذه هي الطريقة التي تظهر بها ورقة التبغ المخللة تحت الضوء العادي وتحت الضوء الأخضر مع مرشح أحمر حيث يمكن رؤية التعبير عن خلية TR 5:00 صباحا الكرز المشار إليه باللون الأحمر بوضوح هنا. صفحة SDS هلام القطعة الغربية و CMC zy التي توضح حجم ونشاط الخلية التائية خمسة أ.تم فصل إجمالي البروتينات القابلة للذوبان ويمكننا تصورها مع تلطيخ كوماسي الأزرق النشاف الغربي مقابل منطقة علامة hist للخلية التائية الخامسة A يؤكد حجم البروتين بالإضافة إلى ذلك يظهر نشاط السليلوز ضد CMC من خلال طعم غريب ملطخ باللون الأحمر الكونغوي. ما يمكن رؤيته هنا هو إجمالي البروتينات القابلة للذوبان من أوراق نبات التبغ حيث تم التعبير عن خلية TR الخامسة A بشكل عابر قبل وبعد تنقية الترسيب الحراري حيث خلية TR الخامسة A هي أكبر نطاق مرئي ويمكن رؤيتها أيضا في القطعة الغربية و CMCs igraph.

نرى أيضا إجمالي البروتينات القابلة للذوبان من نباتات التبغ حيث لم يكن Tcell five A أيضا بعد هطول الأمطار الحرارية والبروتينات من خليط متاح تجاريا من tresa cellulase. يوضح هذا الشكل القياس الكمي لنشاط الإنزيم لخلية TR الخامسة تم تحضين خلية TR الخامسة A بأربعة MUC Azo CMC أو ورق ترشيح ، وتم قياس تدهور الركيزة عن طريق إطلاق الفلورو أربعة مو من صبغة الآزو ، أو عن طريق تحديد السكريات المختزلة من تغير لون PBA باتباع هذا الإجراء. يمكن استخدام طرق أخرى مثل استهداف البروتين لتوفير معلومات إضافية حول كيفية تأثير توطين البروتين على استقرار الإنزيم ونشاطه.

بعد مشاهدة هذا الفيديو ، يجب أن يكون لديك الآن فهم واضح لكيفية التعبير عن البروتينات بشكل عابر في التبغ بالإضافة إلى بعض المعرفة الجيدة حول كيفية تقييم النشاط الأنزيمي. فورو تحويل الكتلة الحيوية السليلوز.