التعبير عن المؤتلف سلولاز Cel5A من

الهدف العام من التجربة التالية هو التعبير المؤقت عن البروتينات المستهدفة في نبات التبغ لتكوين فكرة عن جدوى التعبير عن الإنزيمات المعتمد على النباتات في إطار زمني قصير. ويتم تحقيق هذا التعبير المؤقت عن طريق ترشيح أوراق التبغ بسلالة من بكتيريا Agrobacterium tumefaciens، والتي تحتوي على ناقل يشتمل على الجين المراد دراسته كخطوة ثانية. بعد فترة الحضانة، يتم حصاد أوراق النبات المُرشحة وتنقية مستخلصات البروتين جزئياً للحصول على محلول إنزيمي فعال. بعد ذلك، يتم إجراء تحليل للبروتين من أجل تقييم آثار التعبير المعتمد على النباتات على الإنزيم والتحقق من نشاطه الإنزيمي.

يتم الحصول على نتائج تظهر حجم البروتين وتأثيرات الارتباط السكري المحتملة والنشاط الإنزيمي استناداً إلى تحليل لطخة وسترن، ومقايسات الـ zy وتفكيك الركيزة. يمكن أن تساعد هذه الطريقة في الإجابة على أسئلة رئيسية حول تحويل الكتلة الحيوية النباتية، كما يمكن أن توفر رؤية حول نشاط الإنزيمات بعد التعبير عنها عابراً في التبغ. يعد العرض المرئي لهذه الطريقة أمراً بالغ الأهمية لأن خطوات التسلل صعبة التعلم نظراً لسهولة تضرر الأوراق بفعل سرنجة هرجر، وسأقوم بإجراء التجارب تحت ظروف معقمة.

انقل مستعمرات مفردة من agrobacterium إلى دورق إرلنماير يحتوي على 10 milliliters من مرق مستخلص الخميرة مع المضادات الحيوية. ثم قم بتحضين المرق الملقح لمدة تتراوح من 36 إلى 40 ساعة عند درجة حرارة 26 degrees Celsius مع الرج بسرعة 180 RPM، بعد ذلك قم بتلقيح 200 microliters من كل مزرعة في 20 milliliters من مرق مستخلص الخميرة مع نفس المضادات الحيوية السابقة، وحضنها تحت نفس الظروف لمدة تتراوح من 36 إلى 40 ساعة.

حفز المستنبتات بإضافة 2 µL من الأسيتوفينون، و100 µL من محلول جلوكوز بتركيز 40%، و200 µL من منظم MES buffer بتركيز 1 M عند pH 5.6، وواصل التحضين طوال الليل. الآن، انقل النباتات من الدفيئة واستخدم طرف ماصة لإحداث شق في الجانب المحوري AB للورقة الثالثة إلى الخامسة من أعلى النبات لتسهيل عملية الرشح. بعد ذلك، املأ محقنة بوسط الرشح وضعها على أحد الشقوق التي تم إحداثها مسبقاً.

ثبّت المحقنة بإصبعك على الجانب المحوري للورقة، ثم احقن الوسط بعناية في المنطقة الوريدية للورقة. ولتصوير الفلورة في مقاطع الورقة التي تعبر عن TR cell 5:00 AM cherry، قم بتسليط مصدر ضوء محمول يبعث ضوءاً أخضر على النباتات. وعند النظر من خلال مرشح أحمر، ستكون الفلورة الناتجة عن TR cell 5:00 AM cherry مرئية بوضوح.

لاستخلاص البروتينات المُعبَّرة، اختر أوراق تبغ تم ترشيحها باستخدام AUM يحتوي على P track ERTR cell five A وقطِّعها إلى قطع تزن 1 g. بعد ذلك، ضعها في هاون مبرَّد مسبقاً وأضف كمية مناسبة من النيتروجين السائل إلى العينات. اطحن الأوراق حتى تصبح مسحوقاً باستخدام مدقة.

كرر العملية باستخدام أوراق تبغ غير ملقحة للحصول على عينات ضابطة. ثم أضف 2 mL من PBS يحتوي على 1 mM من phenyl methyl suen fluoride إلى مادة الأوراق المطحونة واخلط حتى يتم تعليق معظم مادة الأوراق. قم بطرد المستخلص مركزياً عند 15,000 ×g لمدة 20 دقيقة عند درجة حرارة 4 °C.

ثم تخلص من الراسب، وقم بتنقية خلايا TR جزئيًا عبر تحضين البروتين الذي يحتوي على S natin عند 55 °C لمدة 10 دقائق، ثم اتركه ليبرد في درجة حرارة الغرفة لمدة 10 دقائق أخرى. بعد ذلك، قم بطرد مركزي لـ SNAT عند 15,000 ×g لمدة 10 دقائق في درجة حرارة الغرفة. تخلص من الراسب واستخدم الـ snat المحتوي على البروتين لجميع الخطوات التالية.

مقاييس إضافية. قم أيضاً بإجراء عملية التنقية الجزئية للنباتات غير الملقحة للحصول على عينات ضابطة. في هذا الإجراء، اخلط إيثيل السليلوز مع الماء للحصول على محلول بتركيز 1.5% وحضّنه مع التحريك حتى الذوبان.

لتحضير هلام الفصل الكهربائي A-C-M-C-S-D-S، استبدل 1 mL من CMC بتركيز 1.5% مقابل 1 mL من الماء في محلول خلط هلام SDS page بحجم 10 mL، ثم صب الهلام بالطريقة المعتادة. بعد ذلك، قم بمسخ العينات عن طريق غليها في وجود SDS. أجرِ عملية الفصل الكهربائي بجهد 200 فولت لمدة 50 دقيقة حتى تصل جبهة الصبغة إلى أسفل الهلام. الآن، قم بإجراء عملية إعادة طي البروتين داخل الهلام (in gel protein refolding) على هلام 15%C-M-C-S-D-S page gel.

استخدام 1.5% beta cyclodextrin في محلول منظم من الفوسفات والسترات بتركيز 20 millimolar عند pH 6.5. يتم تحضين الهلام في هذا المحلول في درجة حرارة الغرفة مع الرج الخفيف لمدة 15 دقيقة. يتم التخلص من محلول beta cyclodextrin وغسل الهلام سريعاً بالماء، ثم تحضينه في درجة حرارة الغرفة في محلول منظم من خلات الصوديوم بتركيز 50 millimolar عند pH 4.8 لمدة 15 دقيقة أخرى.

بعد ذلك، قم بإجراء تحليل CMC zy باستخدام هلام الصفحة 15%C-M-C-S-D-S المعاد طيّه، وذلك عن طريق تحضين الهلام في محلول منظم من أسيتات الصوديوم بتركيز 30 millimolar لمدة 20 دقيقة عند 50 درجة مئوية. ولتحديد أماكن تحلل CMC، قم بصبغ الهلام لمدة 10 دقائق باستخدام محلول Congo red بتركيز 0.1%، ثم قم بإزالة الصبغة باستخدام كلوريد الصوديوم بتركيز واحد molar لمدة 30 دقيقة أو حتى تظهر حزم واضحة، وفي النهاية، اغسل الهلام باستخدام حمض الأسيتيك بتركيز 0.3%. وللحصول على تصوير أكثر وضوحاً مباشرة قبل إجراء المقايسة، قم بتحضير محلول عمل MUC رباعي بتركيز two X، ثم انقل 100 microliters من محلول العمل MUC الرباعي إلى آبار منفصلة في لوحة ذات 96 بئراً.

ثم أضف 100 µL من كل عينة في الآبار المناسبة مع تشغيل كل عينة في ثلاث مكررات، باستخدام طول موجي للإثارة يبلغ 360 nm وطول موجي للانبعاث يبلغ 465 nm. حدد نقطة زمن الصفر لفلورة mu من خلال مطيافية الفلورة. بعد ذلك، قم بتحضين الأطباق المغطاة بأغطية لاصقة عند 50 °C لمدة 20 دقيقة.

بعد ذلك، أوقف التفاعل عن طريق التجميد. ثم قم بقياس الفلورة النهائية باستخدام نفس المعايير المستخدمة في النقطة الزمنية صفر دقيقة. اطرح قيمة الفلورة عند الدقيقة صفر من قيمة الفلورة عند الدقيقة 20 لتحديد التغير في الفلورة الناتج عن النشاط الإنزيمي مباشرة قبل إجراء المقايسة.

قم بتحضير محلول العمل A-O-C-M-C بتركيز 2X. بعد ذلك، اخلط 50 µL من العينة مع 50 µL من محلول العمل في أنبوب سعة 1.5 mL. ثم، قم بحضن العينات لمدة 20 دقيقة عند درجة حرارة 50 °C.

أوقف التفاعل بإضافة 250 µL من محلول الترسيب. بعد ذلك، قم برج كل عينة بقوة باستخدام جهاز المرج (vortex) لمدة 10 ثوانٍ لضمان الخلط الكامل للعينة مع محلول الترسيب. ثم حضن العينات في درجة حرارة الغرفة لمدة 10 دقائق وقم برجها مرة أخرى قبل طردها مركزياً عند 1000 Gs لمدة 10 دقائق.

بعد ذلك، انقل 200 µL من الـ SNAT من كل عينة إلى لوحة ذات 96 بئر دون إحداث أي اضطراب. يظهر النشاط الإنزيمي للراسب من خلال مستويات أعلى من الصبغة المذابة. قم بقياس ذلك باستخدام مطيافية الامتصاص عند طول موجي قدره 590 nm.

في هذه الخطوة، ضع دوائر من ورق الترشيح في أنابيب سعة 1.5 أو 2 ملليلتر. أضف 100 µL من خلات الصوديوم بتركيز 60 millimolar و 100 µL من العينات إلى دوائر ورق الترشيح، ثم قم بالتحضين لمدة 20 ساعة عند درجة حرارة 50 °C مع الرج بسرعة 300 RPM.

بالإضافة إلى ذلك، يتم تحضين العينات الفردية بدون ورق ترشيح كعناصر ضابطة مباشرة قبل إجراء المقايسة. قم بتحضير محلول عمل بتركيز 1.5 x PABA يحتوي على واحد مللي لتر من محلول PBA A وتسعة مللي لتر من محلول PABA B. يُحفظ المحلول على الثلج حتى وقت الاستخدام. بعد ذلك، قم بتحضير العينات في أنابيب مقاومة للحرارة سعة 0.5 مللي لتر.

تتكون العينات من 45 µL من الماء، و5 µL من كل محلول تم تحضينه مع ورق ترشيح، و100 µL من محلول PABA التشغيلي. بعد ذلك، قم بتشغيل ضوابط العينات وخمسة معايير جُهزت بنفس الطريقة. ثم حضّن العينات والضوابط والمعايير لمدة 10 دقائق بالضبط عند 100 °C، ثم اتركها تبرد في درجة حرارة الغرفة لمدة 10 دقائق أخرى.

انقل 100 µL من المحلول إلى طبق معايرة يحتوي على 96 بئراً، ثم قم بإجراء المقايسة باستخدام جهاز مطياف الامتصاص الضوئي عند طول موجي يبلغ 410 nm. اطرح قيم التحكم الخاصة بكل عينة من قيم عينات ورق الترشيح لتحديد كمية السكريات المختزلة المنطلقة. تظهر الصورة المرفقة كاسيتات التعبير بالإضافة إلى التعبير البروتيني في نباتات التبغ.

يظهر هنا شكل ورقة تبغ تم ترشيحها تحت الضوء العادي وتحت الضوء الأخضر مع مرشح أحمر، حيث يظهر بوضوح اللون الأحمر الذي يشير إلى تعبير TR cell 5:00 AM cherry. كما يظهر جل SDS page واللطخة الغربية (Western blot) ومخطط CMC zy التي توضح حجم ونشاط T cell five A. لقد تم فصل البروتينات الذائبة الكلية ويمكننا رؤيتها باستخدام صبغة kumasi blue، وتؤكد اللطخة الغربية ضد منطقة وسم hist لبروتين T cell five A حجم البروتين، بالإضافة إلى ذلك، يظهر نشاط السليوليز ضد CMC من خلال zymograph مصبوغ بـ Congo red. ما يمكن رؤيته هنا هو البروتينات الذائبة الكلية من أوراق نبات التبغ حيث تم التعبير عن TR cell five A بشكل عابر قبل وبعد التنقية بالترسيب الحراري، حيث يمثل TR cell five A الحزمة المرئية الأكبر، كما يظهر أيضاً في اللطخة الغربية ومخطط CMC zymograph.

نرى أيضاً إجمالي البروتينات القابلة للذوبان من نباتات التبغ التي لم يتم التعبير فيها عن Tcell five A بعد الترسيب الحراري، والبروتينات من خليط تجاري متاح من tresa cellulase. يوضح هذا الشكل كمية نشاط الإنزيم لـ TR cell five A، حيث تم تحضين TR cell five A مع 4 MUC Azo CMC أو ورق ترشيح، وتم قياس تحلل الركيزة عن طريق تحرر صبغة fluoro four four mu azo، أو من خلال تحديد كمية السكريات المختزلة من خلال تغير لون PBA بعد اتباع هذا الإجراء. ويمكن استخدام طرق أخرى مثل استهداف البروتين لتوفير معلومات إضافية حول كيفية تأثير تموضع البروتين على استقرار الإنزيم ونشاطه.

بعد مشاهدة هذا الفيديو، ينبغي أن يكون لديك الآن فهم واضح لكيفية التعبير العابر عن البروتينات في التبغ، بالإضافة إلى معرفة جيدة بكيفية تقييم النشاط الإنزيمي لتحويل الكتلة الحيوية للسليلوز.