التركيز تشكيل: A الفحص القائم على خلية لتحديد إمكانية أنكجنيك لجين

الهدف العام من هذا الإجراء هو إجراء مقايسة تكوين التركيز في خطوط خلايا الخلايا الليفية للفأر ، باستخدام فيروس قهقري لتحديد إمكانات الأورام للجين. يتم تحقيق ذلك عن طريق استنساخ تسلسل الجين محل الاهتمام أولا في ناقل فيروسي رجعي. الخطوة الثانية هي إنتاج جزيئات الفيروسية القهقرية باستخدام خلايا التعبئة والتغليف الفيروسية و PLA e.

بعد ذلك ، يتم استخدام الفيروس القهقري لإصابة المعاهد الوطنية للصحة ثلاث خلايا ليفية من الفئران من أجل تقييم إمكانات التحويل للجين المعني. تتمثل الخطوة الأخيرة في السماح للمعاهد الوطنية للصحة بثلاث خلايا T بالانقسام لمدة أسبوعين إلى ثلاثة أسابيع ، متبوعا بتلطيخ بنفسجي بلوري لتحديد عدد البؤر المتكونة. في النهاية ، يتم استخدام مقايسة تكوين التركيز لإظهار ما إذا كان التعبير المفرط عن الجين ذي الأهمية كافيا للحث على نمو مستقل الكثافة في خلايا الخلايا الليفية للفأر.

يمكن أن تساعد هذه الطريقة في الإجابة على الأسئلة الرئيسية في مجال بيولوجيا السرطان ، مثل فحص إمكانات الأورام للجين. للبدء ، اجعل المتجه الفيروسي كما هو موضح في بروتوكول النص. ثم قم بإنشاء مزارع plat E من الخلايا المجمدة عن طريق إذابة خلايا Plat E بسرعة في حمام مائي 37 درجة مئوية ، ثم نقلها إلى أنبوب مخروطي سعة 15 ملليلترا.

أضف ببطء تسعة ملليلتر من وسط PLA E إلى الأنبوب المخروطي سعة 15 مل. قم بالطرد المركزي للأنبوب عند 180 مرة G لمدة خمس دقائق ، وتخلص من المادة الطافية. أعد تعليق الخلايا ب 10 ملليلتر من وسط plat E ، وانقلها إلى طبق ثقافة 10 سم.

ثم احتضان الخلايا في حاضنة 37 درجة مئوية 5٪ CO2 حتى تتراوح بين 80 و 90٪ Confluent. قم بإجراء انقسام الخلايا عن طريق شفط الوسط أولا ، ثم اغسل الخلايا مرة واحدة باستخدام PBS قبل إضافة ملليلترين من 0.05٪ تريبسن في EDTA واحتضانها لمدة دقيقة واحدة في درجة حرارة الغرفة ، افصل الخلايا عن طريق النقر بالإصبع. ثم أضف 10 مل من وسط plat E وانقل تعليق الخلية إلى أنبوب 15 ملليلتر.

الطرد المركزي الأنبوب كما كان من قبل وأعد تعليق الخلايا ب 10 ملليلتر من وسط plat E. البذرة التالية ، 2 مليون خلية لكل طبق استزراع 10 سم باستخدام وسط plat E بدون أي مضادات حيوية وترك الخلايا لتحتضن بين عشية وضحاها. في اليوم التالي ، انقل 300 ميكرولتر من الأمثل إلى أنبوب صغير سعة 1.5 مل.

أضف 27 ميكرولتر من أمين البولي إيثيلين إلى الأنبوب المحضر باستخدام Optum. تخلط برفق عن طريق النقر بالإصبع وتحتضن لمدة خمس دقائق في درجة حرارة الغرفة. بعد ذلك ، أضف تسعة ميكروغرامات من الحمض النووي البلازميد من درجة التعدي إلى الأنبوب الممزوج برفق عن طريق الدوامة واحتضانه لمدة 15 دقيقة في درجة حرارة الغرفة.

ثم يضاف المزيج بالتنقيط إلى طبق E قبل حضانه طوال الليل. في اليوم التالي ، قم بشفط الوسط الذي يحتوي على كاشف التعدي وأضف 10 مل من وسط plat E الطازج قبل إعادة الخلايا إلى الحاضنة لإنشاء المعاهد الوطنية للصحة ثلاث ثقافات T ثلاثة. أولا ، قم بإذابة الخلايا بسرعة في حمام مائي 37 درجة مئوية ونقلها إلى أنبوب سعة 15 ملليلترا.

أضف ببطء تسعة ملليلتر من المعاهد الوطنية للصحة ثلاثة ، T ثلاثة متوسطة إلى الخلايا ، وقم بالطرد المركزي للأنبوب عند 180 مرة G لمدة خمس دقائق وتخلص من snat. ثم أعد تعليق الخلايا ب 10 ملليلتر من المعاهد الوطنية للصحة ثلاثة ، T ثلاثة وسط ، وانقلها إلى طبق استزراع 10 سم. احتضان الخلايا في حاضنة 37 درجة مئوية 5٪ CO2 ، مع إبقائها تحت التقاء مع زيادة تواتر التحول التلقائي.

بمجرد أن تصل الثقافة إلى الطلاقة المشتركة ، بمجرد زراعة البذور ثلاث مرات في 10 إلى النيهيه الخامس ، ثلاث خلايا T لكل طبق 10 سم وتحتضن بين عشية وضحاها للعدوى في اليوم التالي. في اليوم التالي ، قم بحصاد المادة الطافية الفيروسية القهقرية من طبق اللوحة E باستخدام حقنة يمكن التخلص منها سعة 10 مليلتر ، وقم بتصفيتها من خلال مرشح غشاء نايلون بحجم مسام 0.45 ميكرون ، ونقله إلى أنبوب سعة 15 مل. أضف 10 مل من وسط plat E الطازج إلى الخلايا قبل إعادتها إلى الحاضنة.

ثم استنشق الوسط من المعاهد الوطنية للصحة ثلاثة T ثلاث خلايا لتصاب وإضافة خمسة ملليلتر من NI H العادية ثلاثة ، T ثلاثة متوسطة ، وخمسة ملليلتر من الفيروس الذي يحتوي على طافي مفلتر. بعد ذلك ، أضف بولي برين إلى الطبق. أضف تركيزا ستة ميكروغرام لكل ملليلتر.

احتضان الخلايا طوال الليل قبل تكرار خطوات العدوى لجولة ثانية من العدوى. بعد الإصابة ، استبدل الفيروس ، ويحتوي على وسيط مع IH العادية ثلاثة T ثلاثة. اسمح لثلاث خلايا T بالنمو لمدة اثنين إلى ثلاثة ، لتحل محل الوسط حسب الضرورة لتلوين البنفسج البلوري.

استنشق المعاهد الوطنية للصحة ثلاثة T ثلاثة متوسطة وضع الأطباق على الثلج. اغسل الأطباق مرتين باستخدام PBS المثلج. ثبت الخلايا بالميثانول المثلج لمدة 10 دقائق.

ثم قم بإزالة الأطباق من الجليد وشفط الميثانول. أضف ثلاثة ملليلتر من محلول بنفسجي بلوري 0.5٪ مصنوع من 25٪ من الميثانول واحتضان الأطباق لمدة خمس دقائق في درجة حرارة الغرفة. بعد الحضانة ، قم بشفط محلول البنفسج البلوري واشطف الطبق بعناية بماء Milli Q حتى لا يخرج اللون في الشطف.

اترك الأطباق تجف مكشوفة طوال الليل على سطح المقعد. بمجرد أن تجف الأطباق ، استخدم المسطرة لقياس البؤر وعد تلك التي يزيد قطرها عن خمسة ملليمترات. الرقم MXD ثلاثة هو عامل نسخ سحاب حلزوني حلزوني أساسي وهو عضو غير نمطي في عائلة MAD ، وقد تم الإبلاغ عن تورطه في التسرطن عند مقارنته بالتحكم السلبي والتحكم الإيجابي.

كانت أطباق المعاهد الوطنية للصحة الثلاثة T حيث تم الإفراط في التعبير عن MXD ثلاثة بؤر أقل بكثير. تم جمع البيانات من تجارب متعددة لتحديد الأهمية ولوحظت نفس الاتجاهات من هذا الفحص. تشير النتائج إلى أن MXD ثلاثة لا يعمل كجين ورمي باتباع هذا الإجراء.

يمكن إجراء طرق أخرى مثل مقايسة تكوين التركيز مع التركيبات الجينية والنمو في تكاثر المثقاب الناعم وتحليل دورة الخلية من أجل الإجابة على أسئلة إضافية لتقييم دور الجين ذي الأهمية في التسبب في تكوين الأورام.