شقة التصوير من جبل ماوس الجلد وتطبيقه على تحليل الشعر جريب الزخرفة والحسية أكسون الصرف

الهدف العام من هذا الإجراء هو تصور هياكل الجلد مثل بصيلات الشعر والنهايات العصبية بالكامل دون تقسيم العينة فعليا. يتم تحقيق ذلك عن طريق جمع الجلد أولا من مناطق مختلفة من الجسم ، بما في ذلك الخلفي الخلفي والخلفي والذيل. الخطوة الثانية هي تسطيح عينات الجلد وتنظيفها.

تخضع عينات الجلد التالية للتثبيت المناسب. الخطوة الأخيرة هي إجراء تلطيخ المناعة أو الكيمياء النسيجية على عينات الجلد. في النهاية ، يتم استخدام التصوير باستخدام مجهر تشريح أو متحد البؤر لتصور هندسة هياكل الجلد المختلفة.

الميزة الرئيسية لهذه التقنية على الطرق الحالية مثل تحضير هرمون البشرة ، هي أنه يمكن تطبيقها على الجلد في أي مكان على الجسم ولا تتطلب فصل البشرة عن الأدمة. يمكن أن تساعد هذه الطريقة في الإجابة على الأسئلة الرئيسية في دراسة قطبية الخلايا الأخمصية. نظرا لأن الهندسة ثنائية الأبعاد للجلد والترتيب الغريب لبصيلات الشعر تجعل الجلد نظاما مثاليا لدراسة هذه العملية ، فلا يمكن لهذه الطريقة أن توفر نظرة ثاقبة لقطبية الخلايا النباتية فحسب ، بل يمكن أيضا تطبيقها لدراسة جوانب أخرى من نمو الجلد ، مثل تعريف أنواع الخلايا العصبية الحسية الجسدية بناء على التصور المباشر للأفعال الفردية على الأشكال العلوية.

العرض المرئي لهذه الطريقة أمرا بالغ الأهمية حيث يصعب تعلم تشريح الجلد من بعض المناطق مثل القدمين والذيل ، ومن المهم تسطيحها تماما وتجنب التجاعيد والتمدد الزائد. في هذا العرض التوضيحي ، سيتم جمع الجلد الظهري من P ثلاثة فئران قتلت رحيما بواسطة الفلور. يستخدم الاستنشاق شفرات لعمل قطع أفقي من قاعدة الذيل على طول كل جناح ، ويمر على الجانب الظهري من قاعدة كل طرف ينتقل إلى الأذنين وينتهي عند الأنف.

قشر الجلد برفق من الأنسجة الأساسية من الخلف إلى الأمام عن طريق إمساك الجلد بين أصابع القفازات حتى لا يتم ضغطه بالملقط. عند تقشير الجلد على مستوى الأذنين أولا ، قم بقطع الأذنين بمقص واستمر ببطء خاص حيث يمكن أن يتمزق الجلد في هذا الموقع. من هذه النقطة فصاعدا ، قم بتوجيه الجلد بحيث يكون الداخل متجها لأعلى.

قم بتثبيت الجلد على S Guard باستخدام حوالي 20 دبوسا للحشرات متباعدة بالتساوي حول المحيط. لا تفرط في شد الجلد. قم بتغطية الجلد ب 10 إلى 20 مل من PBS باستخدام ملقط بزاوية أو منحنية.

قم بتشريح الدهون المرتبطة بالجلد والأنسجة الضامة. واجه الطرف المدبب من الملقط أفقيا لتقليل خطر اختراق الملقط للجلد. قم ببثق أي فقاعات هواء محاصرة تحت الجلد عن طريق لف قضيب قطني مائل برفق على سطح الجلد.

الخطوة التالية هي إصلاح جلد الدبوس. إذا كان الجلد سيتم استخدامه لتصوير الميلانين أو الكيمياء النسيجية للفوسفاتيز القلوي ، أضف 20 مل لكل طبق سيجار 10 سم من 4٪ P-F-A-P-B-S المحضر حديثا أو 10٪ فورمين مخزن. إذا كان الجلد سيتم استخدامه للتلوين المناعي أو تصور الكيراتين المعدل وراثيا ، فإن KRT 17 GFP يضيف 20 مل لكل 10 سنتيمترات من طبق سوغار 2٪ P-F-A-P-B-S المحضر حديثا 2٪ P-F-A-P-B-S يدور برفق طوال الليل في غرفة باردة في اليوم التالي ، ويغسل في PBS لمدة تزيد عن 10 دقائق.

لن يتم توضيح إجراء الكيمياء النسيجية للفوسفاتيز القلوي في هذا الفيديو. لتصوير الميلانين ، قم بتجفيف الجلد من خلال سلسلة الإيثانول المتدرجة يوما واحدا لكل خطوة مع دوران أفقي لطيف في درجة حرارة الغرفة. بعد ثلاثة أيام ، قم بإزالة الأنسجة الضامة المتبقية من الجلد المجفف مع الجلد في 100٪ من الإيثانول.

قم بإزالة دبابيس الحشرات وانقل الجلد إلى طبق زجاجي قطره 10 سم. لنجاح هذا الإجراء ، يجب جمع عينة الجلد كقطعة سليمة وتسطيحها بشكل مثالي. ضع شريحتين مجهرين زجاجيتين على الجلد لتسطيحه ومنعه من التجعيد.

أضف 20 مل من البنزويل بنزوات وكحول البنزويل أو BBBA ، مما يؤدي إلى تصلب الأنسجة بسرعة خلال الساعات العديدة القادمة. ارفع الشرائح عن الجلد لبضع ثوان للسماح ل BBBA بالغسل على الجلد. عادة ما يتم تشريح جلد القدم لتحليل زخرفة بصيلات الشعر من P واحد إلى P ثمانية للحيوانات بعد القتل الرحيم ، قم بقطع القدمين فوق مفصل الكاحل وقم بعمل قطع مستقيم واحد على طول السطح البطني من خلال باطن القدمين.

قشر الجلد برفق من الأنسجة الأساسية ، متحركا في اتجاه قريب إلى بعيد. قم بقص الأصابع لتحرير الجلد وتثبيت الجلد ليتساقط بحيث يكون السطح الداخلي متجها لأعلى. يوجد الحد الأدنى من النسيج الضام على القدم.

المعدلة وراثيا. KRT 17 GFP الجلد جاهز الآن للتصوير لتصوير الميلانين. إصلاح الجلد ومعالجته كما هو موضح سابقا للبشرة الظهرية بعد القتل الرحيم للحيوان P 21 ، قم بإزالة الشعر عن طريق فرك مزيل الشعر.

ضعي الجل على سطح الجلد بإصبع وإبهام مرتديا قفازات وانتظري لمدة 10 دقائق. اغسل سطح الجلد بماء الصنبور. بعد ذلك ، قم بتشريح جلد القدم وتثبيته على واقي S كما هو موضح سابقا.

قم بتثبيته باستخدام 1٪ P-F-A-P-B-S لمدة 30 دقيقة في درجة حرارة الغرفة ثم اغسلها في PBS. لتحضير جلد الذيل ، قم بعمل قطع دائري حول قاعدة الذيل ثم شق طولي يمتد على طول الذيل على طول وجهه البطني. انزع جلد الذيل بدءا من الحافة عن طريق الإمساك بإحكام بطرف عظم الذنب و / أو النسيج الضام بزوج واحد من الملقط والجلد بزوج ثان من الملقط.

قم بتثبيت جلد الذيل على واقي SIL لتحليل توزيع الميلانين واتجاه بصيلات الشعر. إصلاح الجلد ومعالجته كما هو موضح للجلد الظهري لتحليل الغدد الدهنية قبل التثبيت. قم بقص جلد الذيل إلى سلسلة من الأجزاء التي يبلغ طولها حوالي 0.5 إلى سنتيمتر واحد ، واحتضان قطع الجلد في PBS خمسة مللي مولار EDTA بين عشية وضحاها عند 37 درجة مئوية.

لإضعاف التصاق بشرة الأدمة في اليوم التالي ، قم بتقشير البشرة برفق من الأدمة. قم بتثبيت واجهة البشرة حتى واقي S وقم بتثبيته في 4٪ P-F-A-P-B-S لمدة ساعة واحدة في درجة حرارة الغرفة. بعد ذلك ، اغسل البشرة باستخدام PBS وصمة عار بالزيت الأحمر O كما هو موضح في نص البروتوكول.

يستخدم مجهر تشريح لتصوير جلود القدم الظهرية أو الذيل المغمورة في BBBA ، مسطحة أسفل الشريحة الزجاجية ولا تزال في الطبق الزجاجي. يقلل هذا النهج من تلوث BBBA في المجهر. قم بإضاءة الطبق من الأسفل لتقليل التباين المكاني في شدة الضوء عبر مجال الرؤية.

ارفع الطبق الزجاجي إلى ارتفاع حوالي 10 سم فوق سطح العمل القياسي لمجهر التشريح وضع لوح بلاستيكي أو زجاجي منتشر فوق مصدر الضوء. عند الانتهاء من التصوير ، أعد الجلد إلى 100٪ من الإيثانول للتخزين طويل الأجل عند سالب 20 درجة مئوية. لتحضير الجلد الملطخ بالفوسفاتيز القلوي للتصوير ، ضعه بين لوحين زجاجيين من النوع المستخدم في المواد الهلامية البروتينية الصغيرة.

الحرص على تجنب إدخال فقاعات الهواء بين الصفائح والجلد. تخلص بعناية من أي BBBA زائدة بمنشفة ورقية. ضع هذه الشطيرة من صفيحة جلد اللوحة على مرحلة المجهر.

استخدم إضاءة المجال الساطع أو DIC مع هدف 10 × وخطوتين ميكرومترات أو خمسة ميكرومتر Z. استخدم مرحلة XY آلية لالتقاط مونتاج لصور XY التي تم دمجها معا لإنشاء مجموعة بيانات واحدة ثلاثية الأبعاد بمقياس رمادي. قم بإجراء تتبع شبه آلي لعرش المحاور العصبية مع أي من مجموعة متنوعة من حزم البرامج.

يمكن استخدام التصوير الساطع للحوامل المسطحة للجلد لتصوير شجرة حسية جلدية واحدة موضحة هنا مع صورتها المتتبعة. يتيح التصوير الساطع أيضا تصور أنماط بصيلات الشعر بناء على تصبغ الميلانين. تظهر هذه الصور جلد واحد من النوع البري وستة فئران بالضربة القاضية المجعد و P سبعة جلد من ستة فئران بالضربة القاضية المجعدة.

يمكن استخدام التصوير المجهري الضوئي للحوامل المسطحة للجلد لتحديد هندسة الغدد الدهنية والذيول. الجلد الذي يتصوره باللون الأحمر الزيتي O الغدد الدهنية غير منظمة في فأر مجعد بستة ضربة قاضية مقارنة بالقدم الظهرية من النوع البري. تم حصاد الجلد من النوع البري وستة فئران بالضربة القاضية تحمل علامة GFP الموسومة بالكيراتين KRT 17 GFP وملطخة بالزيت.

كشف Red O أن الجلد بالضربة القاضية له دوامة شعر في وسطه. يمكن للتصوير متحد البؤر للحوامل المسطحة للجلد أيضا تحديد هندسة بصيلات الشعر التي يتم تصورها باستخدام KRT 17 GFP والتلوين المناعي المضاد لحبوب منع الحمل ونصب الأسنان. تصورت عضلات العين مع تلطيخ الأكتين المناعي المضاد للعضلات smomo.

يتم تصور مجموعات خلايا ميركل مع مضاد للسيتوكيراتين ثمانية أو مع امتصاص صبغة am 1 43 وبصيلات الشعر المركزية التي يتم تصورها باستخدام KRT 17 GFP بدلا من أن تكون مفتوحة باتجاه الأمام ، تشكل مجموعة خلايا ميركل ذات الضربة القاضية الستة المجعدة دائرة مغلقة بمجرد إتقان التشريح يمكن إجراؤه في حوالي 30 دقيقة إذا تم إجراؤه بشكل صحيح ويمكن إجراء ترتيبات مختلفة في غضون أيام قليلة إلى أسبوع. بعد مشاهدة هذا الفيديو ، يجب أن يكون لديك فهم جيد لكيفية جمع الجلد من مناطق مختلفة من الجسم وكيفية الوقوف عليها لتصور هياكل الجلد المختلفة في شكل هرمون. يمكن جمع صور كاملة السماكة وعالية الدقة لهياكل الجلد عن طريق الفحص المجهري القياسي عالي الضوء والفحص المجهري متحد البؤر.

لا تنس أن العمل مع الألدهيد البارافورم و BBBA يمكن أن يكون خطيرا للغاية. يجب تقليل استنشاق الأبخرة عن طريق الاحتفاظ بهذه المحاليل في حاويات مغطاة ويجب تجنب ملامسة الجلد. لا تسمح ل BBBA بملامسة البلاستيك.