شقة التصوير من جبل ماوس الجلد وتطبيقه على تحليل الشعر جريب الزخرفة والحسية أكسون الصرف

الهدف العام من هذا الإجراء هو تصور بنيات الجلد، مثل بصيلات الشعر والنهايات العصبية، بكامل كيانها دون الحاجة إلى تقطيع العينة فيزيائياً. ويتم تحقيق ذلك أولاً عن طريق جمع عينات من الجلد من مناطق مختلفة من الجسم، بما في ذلك الظهر والقدم الخلفية والذيل. وتتمثل الخطوة الثانية في بسط عينات الجلد وتنظيفها.

تخضع عينات الجلد التالية لتثبيت مناسب. وتتمثل الخطوة النهائية في إجراء الصبغ المناعي أو الكيمياء النسيجية على عينات الجلد. وفي النهاية، يُستخدم التصوير باستخدام مجهر تشريحي أو مجهر بؤري (confocal microscope) لتصور هندسة تراكيب الجلد المختلفة.

تتمثل الميزة الرئيسية لهذه التقنية مقارنة بالطرق الحالية مثل تحضير تثبيت الهرمونات البشرية في إمكانية تطبيقها على الجلد في أي موقع من الجسم، وعدم حاجتها لفصل البشرة عن الأدمة. يمكن لهذه الطريقة أن تساعد في الإجابة على أسئلة جوهرية في دراسة قطبية الخلايا النباتية. وبما أن الهندسة ثنائية الأبعاد للجلد والترتيب الغريب لبصيلات الشعر يجعلان من الجلد نظاماً مثالياً لدراسة هذه العملية، فإن هذه الطريقة لا توفر رؤى حول قطبية الخلايا النباتية فحسب، بل يمكن تطبيقها أيضاً لدراسة جوانب أخرى من تطور الجلد، مثل تحديد أنواع العصبونات الحسية الجسدية بناءً على التصوير المباشر لأفعال فردية على المورفولوجيات العلوية.

يُعد العرض المرئي لهذه الطريقة أمراً بالغ الأهمية نظراً لصعوبة تعلم عملية تشريح الجلد من بعض المناطق مثل القدمين والذيل، حيث من المهم بسطهما بشكل مثالي وتجنب التجاعيد أو التمدد المفرط. في هذا العرض، سيتم جمع الجلد الظهري من ثلاثة فئران من سلالة P تم قتلها رحيماً بواسطة isof fluorine عن طريق الاستنشاق؛ استخدم الشفرات لإجراء قطع أفقي من قاعدة الذيل على طول كل جانب، مروراً بالجانب الظهري لقاعدة كل طرف، وبالاتجاه نحو جانبي الأذنين وصولاً إلى الأنف.

قُم بتقشير الجلد برفق عن الأنسجة الكامنة أسفله، بالانتقال من الجهة الخلفية إلى الأمامية، وذلك عن طريق إمساك الجلد بين الأصابع المكسوة بالقفازات لتجنب قرصه بالملاقط. عند تقشير الجلد عند مستوى الأذنين أولاً، قُم بقص الأذنين باستخدام مقص، ثم تابع العملية ببطء شديد نظراً لقابلية الجلد للتمزق في هذا الموقع. ومن هذه النقطة فصاعداً، وجّه الجلد بحيث يكون الجانب الداخلي موجهاً للأعلى.

قم بتثبيت الجلد على واقي S باستخدام حوالي 20 دبوس حشرات موزعة بالتساوي حول المحيط. تجنب شد الجلد بشكل مفرط. غطِّ الجلد بـ 10 إلى 20 milliliters من PBS باستخدام ملقط مائل أو منحني.

قم بتشريح وإزالة الدهون والأنسجة الضامة المرتبطة بالجلد. وجه الطرف المدبب للملقط بشكل أفقي لتقليل خطر اختراق الملقط للجلد. قم بتفريغ أي فقاعات هواء محتبسة تحت الجلد عن طريق تمرير مسحة قطنية بلطف فوق سطح الجلد.

الخطوة التالية هي تثبيت جلد دبوس التثبيت. إذا كان الجلد سيُستخدم لتصوير الميلانين أو الكيمياء النسيجية للفوسفاتاز القلوي، أضف 20 milliliters لكل طبق زراعة بقطر 10 centimeter من محلول 4%P-F-A-P-B-S المُحضّر حديثاً أو محلول 10%buffered formin. أما إذا كان الجلد سيُستخدم للتصبيغ المناعي أو لمعاينة كيراتين معدل وراثياً، KRT 17 GFP، فأضف 20 milliliters لكل طبق زراعة بقطر 10 centimeter من محلول 2%P-F-A-P-B-S المُحضّر حديثاً، ثم قم بتدوير الطبق بلطف طوال الليل في غرفة باردة، وفي اليوم التالي، اغسله في PBS لمدة تزيد عن 10 minutes.

لن يتم عرض إجراء الكيمياء النسيجية للفوسفاتيز القلوي في هذا الفيديو. ولتصوير الميلانين، يتم تجفيف الجلد من الماء من خلال سلسلة متدرجة من الإيثانول لمدة يوم واحد لكل خطوة مع تدوير أفقي لطيف في درجة حرارة الغرفة. وبعد ثلاثة أيام، تُزال الأنسجة الضامة المتبقية من الجلد المجفف بينما يكون الجلد في إيثانول 100%.

قم بإزالة دبابيس الحشرات ونقل الجلد إلى طبق زجاجي بقطر 10 سنتيمتر. ولضمان نجاح هذا الإجراء، يجب جمع عينة الجلد كقطعة واحدة سليمة وبسطها تماماً. ضع شريحتين زجاجيتين للمجهر فوق الجلد لبسطه ومنعه من الالتفاف.

أضف 20 milliliters من بنزويل بنزوات وبنزويل كحول أو BBBA، والذي سيعمل على تصلب الأنسجة بسرعة خلال الساعات القليلة القادمة. ارفع الشرائح عن الجلد لبضع ثوانٍ للسماح لـ BBBA بالتدفق فوق الجلد. عادةً ما يتم تشريح جلد القدم لتحليل نمط بصيلات الشعر من الحيوانات في المرحلة P one إلى P eight؛ وبعد القتل الرحيم، اقطع القدمين فوق مفصل الكاحل وقم بإجراء قطع مستقيم واحد على طول السطح البطني عبر أخمص القدمين.

قم بتقشير الجلد برفق عن الأنسجة الكامنة تحتها بالتحرك في اتجاه من الداني إلى القاصي. اقطع الأصابع لتحرير الجلد، ثم ثبّت الجلد بدبابيس على لوح الشمع بحيث يكون السطح الداخلي متجهاً للأعلى. يوجد حد أدنى من النسيج الضام في القدم.

الجلد المعدل وراثياً. أصبح جلد KRT 17 GFP الآن جاهزاً للتصوير الخاص بالميلانين. قم بتثبيت ومعالجة الجلد كما تم توضيحه سابقاً للجلد الظهري. بعد القتل الرحيم للحيوان في عمر P 21، قم بإزالة الشعر عن طريق فرك مزيل الشعر.

قم بوضع الجل على سطح الجلد باستخدام إصبع الإبهام والسبابة مع ارتداء القفازات، وانتظر لمدة 10 دقائق. اغسل سطح الجلد بماء الصنبور. بعد ذلك، قم بتشريح جلد القدم وتثبيته بدبابيس على واقي S كما هو موضح سابقاً.

ثبّت العينات باستخدام 1%P-F-A-P-B-S لمدة 30 دقيقة في درجة حرارة الغرفة، ثم اغسلها في PBS. لتحضير جلد الذيل، قم بإجراء قطع دائري حول قاعدة الذيل، ثم شق طولي يمتد على طول الذيل على طول الوجه البطني. قم بإزالة جلد الذيل بدءًا من الطرف عن طريق الإمساك بإحكام بطرف عظمة الذيل أو النسيج الضام باستخدام ملقط واحد، والجلد باستخدام ملقط ثانٍ.

قم بتثبيت جلد الذيل على واقي SIL لتحليل توزيع الميلانين واتجاه بصيلات الشعر. قم بتثبيت ومعالجة الجلد كما هو موضح لجلد الظهر لتحليل الغدد الدهنية قبل عملية التثبيت. قطع جلد الذيل إلى سلسلة من القطع بطول يتراوح بين 0.5 إلى 1 سم تقريبًا، ثم قم بحضن قطع الجلد في محلول PBS يحتوي على EDTA بتركيز 5 mM طوال الليل عند درجة حرارة 37 °C.

لإضعاف الالتصاق بين الأدمة والبشرة في اليوم التالي، قم بتقشير البشرة برفق من الأدمة. ثبت واجهة البشرة باستخدام دبابيس حتى واقي S، ثم ثبتها في 4%P-F-A-P-B-S لمدة ساعة واحدة في درجة حرارة الغرفة. بعد ذلك، اغسل البشرة باستخدام PBS وقم بصبغها بـ oil red O كما هو موضح في نص البروتوكول.

يُستخدم المجهر التشريحي لتصوير جلود ظهر القدم أو جلود الذيول المغمورة في BBBA والمسطحة تحت الشريحة الزجاجية بينما لا تزال داخل الطبق الزجاجي. يقلل هذا النهج من تلوث المجهر بـ BBBA. قم بإضاءة الطبق من الأسفل لتقليل التباين المكاني في شدة الضوء عبر مجال الرؤية.

ارفع الطبق الزجاجي إلى ارتفاع يبلغ حوالي 10 سنتيمترات فوق سطح العمل القياسي للمجهر التشريحي وضع لوحاً بلاستيكياً أو زجاجياً ناشراً فوق مصدر الضوء. عند الانتهاء من التصوير، أعد الجلد إلى 100% ethanol للتخزين طويل الأمد عند درجة حرارة -20 °C. لتحضير الجلد المصبوغ بإنزيم alkaline phosphatase للتصوير، ضعه بين لوحين زجاجيين من النوع المستخدم في هلامات البروتين الصغيرة.

مع الحرص على تجنب إدخال فقاعات هوائية بين الشرائح والجلد. قم بامتصاص أي فائض من BBBA بعناية باستخدام منشفة ورقية. ضع هذه الشريحة المكونة من (شريحة-جلد-شريحة) على منصة المجهر.

استخدم إضاءة المجال المضيء (brightfield) أو تباين التداخل التفاضلي (DIC) مع عدسة شيئية بقوة 10x وخطوات Z بمقدار 2 ميكرومتر أو 5 ميكرومتر. استخدم منصة XY ميكانيكية لالتقاط مجموعة من صور XY التي يتم دمجها معاً لإنشاء مجموعة بيانات ثلاثية الأبعاد ذات تدرج رمادي. قم بإجراء تتبع شبه آلي لتفرعات المحاور العصبية باستخدام أي من مجموعة متنوعة من الحزم البرمجية.

يمكن استخدام التصوير بالمجال المضيء للعينات المسطحة من الجلد لتصوير شجرة حسية جلدية واحدة كما هو موضح هنا مع صورتها المتبعة. كما يتيح التصوير بالمجال المضيء تصور أنماط بصيلات الشعر بناءً على تصبغ الميلانين. تظهر هذه الصور جلد P one من الفئران من النوع البري والفئران التي تعاني من تعطيل جين frizzled six، وجلد P seven من الفئران التي تعاني من تعطيل جين Frizzled six.

يمكن استخدام تصوير المجهر الضوئي للعينات المسطحة من الجلد لتحديد هندسة الغدد الدهنية وذيولها. تظهر الغدد الدهنية في الجلد الذي تمت معاينته بصبغة Oil Red O غير منظمة في فأر مستأصل الجين frizzled six مقارنةً بظهر قدم فأر من النوع البري. تم جمع عينات الجلد من فئران من النوع البري وفئران مستأصلة الجين frizzled six تحمل بروتين كيراتين KRT 17 GFP المسمى بـ GFP، وتم صبغها بالزيت.

كشف صبغ Red O أن الجلد الذي تم تعطيل الجينات فيه (knockout skin) يحتوي على دوامة شعر في مركزه. كما يمكن للتصوير البؤري لعينات الجلد المسطحة تحديد هندسة بصيلات الشعر التي تم تصورها باستخدام KRT 17 GFP والتلوين المناعي anti GFP والعضلات الناصبة للشعر. وتم تصور عضلات العين باستخدام التلوين المناعي anti smoo muscle actin.

يتم تصوير تجمعات خلايا ميركل باستخدام مضاد السيتوكيراتين ثمانية أو عبر امتصاص صبغة am 1 43، بينما يتم تصوير بصيلة الشعر المركزية باستخدام KRT 17 GFP. وبدلاً من أن تكون مفتوحة نحو الجهة الأمامية، تشكل تجمعات خلايا ميركل في حالة تعطيل جين Frizzled six دائرة مغلقة. وبمجرد إتقان العملية، يمكن إجراء التشريح في غضون 30 دقيقة تقريباً إذا تم تنفيذه بشكل صحيح، ويمكن إجراء صباغات مختلفة خلال بضعة أيام إلى أسبوع. بعد مشاهدة هذا الفيديو، يجب أن تكتسب فهماً جيداً لكيفية جمع الجلد من مناطق مختلفة من الجسم وكيفية صباغتها لتصوير هياكل جلدية مختلفة في تنسيق هرموني. يمكن جمع صور عالية الدقة وبكامل السماكة للهياكل الجلدية باستخدام المجهر الضوئي القياسي والمجهر البؤري.

لا تنسَ أن العمل باستخدام البارافورمالدهيد وBBBA قد يكون خطيراً للغاية. يجب تقليل استنشاق الأبخرة عن طريق الاحتفاظ بهذه المحاليل في حاويات مغطاة، كما يجب تجنب ملامستها للجلد. لا تسمح بملامسة BBBA للبلاستيك.