Nanogold وصفها نظام Endosomal خميرة التحليلات التركيبية

الهدف العام من التجربة التالية هو تصوير المقصورات الإندوسومية في خميرة Saccharomyces cei على المستوى البنيوي الدقيق. ويتم تحقيق ذلك عن طريق تحضير كرات من الخميرة (yeast Sphera plast)، والتي تقوم بعد ذلك بعملية امتصاص خلوية إندوسومية لجسيمات الذهب النانوية الموجبة الشحنة. وكخطوة ثانية، يتم تثبيت العينة وتقطيعها للحصول على مقاطع تجميدية فائقة الرقة من الخلايا.

بعد ذلك، تخضع المقاطع المجمّدة لتفاعل تعزيز الفضة. ومن أجل تكبير وتصور جسيمات الذهب النانوية موجبة الشحنة التي تم إدخالها خلوياً، يتم الحصول على نتائج توضح مورفولوجيا المقصورات الإندوسومية المختلفة في الخميرة بناءً على الوسم النوعي لهذا الإجراء. وتتمثل الميزة الرئيسية لهذه التقنية مقارنة بطرقنا الحالية، مثل وسم المقاطع بالذهب المناعي (ImmunoGold)، في أنها لا تعتمد على الأجسام المضادة التي غالباً ما لا تعمل في تحضيرات المجهر الإلكتروني.

على الرغم من أن هذه الطريقة يمكن أن تمنحنا رؤى حول النظام الليزوزومي في خميرة Saccharomyces cerevisiae، إلا أنه يمكن تطبيقها أيضاً على نماذج حقيقية النواة أخرى مثل أنواع أخرى من الخمائر والخلايا الثديية. يتم أولاً تحضين الخميرة التي سيتم تحضير البروتوبلاست منها طوال الليل عند درجة حرارة 30 درجة مئوية في 10 ملليلتر من الوسط المناسب، وفقاً لما يحدده تصميم التجربة في اليوم التالي. بعد قياس الكثافة الضوئية للمستنبت عند 600 نانومتر، تخفف الخلايا في وسط الاستنبات نفسه لتصل الكثافة الضوئية (OD 600) إلى ما بين 0.2 و0.4.

قم بتنمية الخلايا حتى تصل إلى مرحلة النمو الأسي بقيمة OD 600 تتراوح بين واحد إلى اثنين، ثم انقل ما يعادل 10 OD 600 من الخلايا إلى أنبوب سعة 50 milliliter وافصلها بجهاز الطرد المركزي عند 2100 Gs لمدة خمس دقائق. بعد عملية الطرد المركزي، تخلص من الراشح وأعد تعليق كتلة الخلايا في خمسة milliliters من 100 millimolar pipes و 10 millimolar dihi three at Hall، ثم حضنها عند 30 degrees Celsius لمدة 10 دقائق. اجمع الخلايا عن طريق الطرد المركزي.

بعد التخلص من الطافي، أعد تعليق الخلايا في خمسة ملليلترات من الوسط الذي يحتوي على سوربيتول بتركيز 1 M، وخمسة مليغرامات من الإنزيم المحلل. حضّن الخليط عند درجة حرارة 30 °C مع الرج اللطيف لمدة 30 دقيقة. قم بطرد مركزي لمعلق الخلايا عند 300 Gs لمدة خمس دقائق لجمع جزء الراسب الذي يمثل الـ Sphero plats.

تخلص من الطافي وأعد تعليق الخلايا المفرغة من الجدار (spheroplasts) في 960 µL من الوسط المبرد بالثلج الذي يحتوي على sorbitol بتركيز 1 M. انقل الخليط إلى أنبوب طرد مركزي دقيق سعة 2 mL مبرد بالثلج. لبدء إجراء امتصاص ذهب النانو، استخدم ماصة وامزج الخلايا المفرغة من الجدار برفق مع أربعة من جزيئات ذهب النانو ذات الشحنة الموجبة.

إعادة تعليق المادة في 40 µL من الماء. يجب أن يكون الحجم النهائي للمزيج 1 mL. توضع الخلايا المعلقة التي تم الحصول عليها على الثلج لمدة 15 دقيقة.

انقل المعلق إلى درجة حرارة الغرفة واتركه في الحضانة للمدة المطلوبة للسماح بدخول ذهب النانو إلى داخل الخلايا عن طريق الالتقام الخلوي. عند اكتمال امتصاص ذهب النانو المطلوب، أوقف التفاعل بإضافة ملليلتر واحد من المثبت مزدوج التركيز الذي يحتوي على سوربيتول بتركيز 1 molar إلى معلق الخلايا. اترك الأنبوب في درجة حرارة الغرفة لمدة 30 دقيقة.

اقلب أنبوب جهاز الطرد المركزي الدقيق يدويًا وببطء عدة مرات خلال 30 دقيقة للحفاظ على PHE plast والمعلق. بعد ذلك، قم بإجراء الطرد المركزي مرتين عند 1700 Gs لمدة 25 ثانية، ثم تخلص من السائل الطافي وأضف 1 mL من مثبت حديث القوة القياسية يحتوي على 1 M من السوربيتول، ثم حضن العينة لمدة ساعتين في درجة حرارة الغرفة على عجلة دوارة ببطء. لاحقًا، يتم معالجة الخلايا وتقطيعها بالتبريد (cryo sectioning) كما هو موضح في البروتوكول النصي قبل بدء هذا الإجراء؛ قم بإخراج طقم تعزيز الفضة من المجمد واتركه يذوب في حضانة عند 37 °C. ضع الطقم المذاب في حضانة مكتبية عند 24 °C، والتي تكون قد وضعت مسبقًا في الغرفة المظلمة حتى حين استخدامها.

ضع صفيحة تسخين في غرفة مظلمة وسخنها حتى تصل إلى درجة حرارة نهائية تبلغ 24 درجة مئوية. غطِّ الجزء العلوي من صفيحة التسخين بغطاء حماية لسطح المختبر، بحيث يكون الجانب اللامع للأعلى، وثبته باستخدام الشريط اللاصق. ضع شريط البارافيلم (para film) على واقي السطح وحدد الحواف بقلم تحديد أسود لتمكين الرؤية في الظلام.

ثبت ميزان حرارة بشريط لاصق على الجزء العلوي من واقي السطح. لمراقبة درجة حرارة لوح التسخين، قم بتعديل درجة الحرارة تدريجياً. إذا لم تصل إلى 24 °C، ضع أنبوباً سعة 50 mL يحتوي على ماء مقطر مرتين.

داخل الحاضنة، املأ طبق بتري صغير بماء مقطر مزدوج، تم تدفئته مسبقاً عند 37 درجة Celsius. ضع شبكتين من النيكل تحتويان على المقاطع المبردة في الماء بحيث يكون جانب العينة للأسفل لمدة 30 دقيقة. بعد مرور 30 دقيقة، املأ طبق بتري ثانٍ بماء مقطر مزدوج مدفأ مسبقاً وضع شبكتي النيكل ذاتهما في الماء لمدة 30 دقيقة أخرى.

اشطف الشبكات مرة أخرى عن طريق تمريرها بحيث يكون جانب العينة لأسفل فوق عدة قطرات من الماء المقطر المزدوج عند درجة حرارة 24 °C الموضوعة على ورق الترشيح المثبت على لوح التسخين. تأكد من تجهيز تسع قطرات إضافية من الماء المقطر المزدوج على ورق الترشيح لعملية الشطف التي تلي تفاعل تعزيز الفضة. في هذه المرحلة من الإجراء، يجب إطفاء جميع الأنوار في الغرفة المظلمة وتشغيل الضوء الأحمر.

ومع ذلك، ستظل الإضاءة تعمل لأغراض التصوير فقط. في هذا العرض التوضيحي، أخرج المحلولين a وB من مجموعة تعزيز الفضة من الحاضنة عند درجة حرارة 24 درجة Celsius في أنبوب طرد مركزي دقيق سعة 1.5 milliliter، بوضع ست قطرات من المحلول A، تليها ست قطرات من المحلول B، ثم اخلطهما جيداً باستخدام ماصة باستور زجاجية مع تجنب تكون الفقاعات. قم برج المحلول باستخدام جهاز Vortex.

أعد المحلولين a وB لفترة وجيزة إلى الحاضنة عند درجة حرارة 24 degree Celsius وأخرج المحلول C. أضف ست قطرات من المحلول C إلى خليط AB. اخلط المكونات مرة أخرى باستخدام ماصة باستور ثم باستخدام جهاز جهاز الخلط الدوامي (vortex)، مع تجنب تكوين فقاعات.

استخدم هذا الخليط النهائي على الفور. ضع قطرات على البارافورم باستخدام ملقط نظيف مضاد للمغناطيسية. ضع الشبكات على الخليط.

هذا هو تفاعل تعزيز الفضة. تُترك الشبكات لمدة تتراوح من ست إلى 15 دقيقة اعتماداً على درجة التعزيز المطلوبة للتجربة. تُزال الشبكات من الخليط وتُمرر بسرعة عبر سلسلة من ست قطرات من الماء المقطر مرتين موضوعة على Perfil عند 24 درجة Celsius في عمليات الغسل الثلاث الأخيرة.

اترك الشبكات لمدة سبع دقائق لكل قطرة ماء. وفي حال إجراء تجربة فعلية، أعد تشغيل الأضواء عند اكتمال عملية الغسيل. بعد ذلك، يتم تصور النتائج إما عن طريق الوسم بـ ImmunoGold أو صبغ الغشاء لإجراء فحص مجهري إلكتروني (EM).

يمكن وسم أنواع مختلفة من المقصورات الإندوسومية في الخميرة باستخدام الذهب النانوي المعزز بالفضة وتصويرها بواسطة المجهر الإلكتروني. يؤدي امتصاص الذهب النانوي لمدة خمس دقائق إلى وسم الغشاء البلازمي والمقصورات الإندوسومية المبكرة، مثل الحويصلات المفردة، والتي يحتمل أن تكون حويصلات اندخالية، والهياكل الأنبوبية، والتي من المرجح جداً أن تكون إندوسومات مبكرة. أما الحضن مع الذهب النانوي لمدة 30 دقيقة فيؤدي إلى وسم الإندوسومات المتأخرة أو الأجسام متعددة الحويصلات.

تتجلى القوة التحليلية لدمج إجراء المجهر الإلكتروني المناعي مع بروتوكول تعزيز الذهب والفضة النانوي هذا في الحفاظ على جودة ومورفولوجيا العضيات الموضحة، وبوجه خاص الحويصلات الداخلية للأجسام متعددة الحويصلات. وقبل استخدام طريقة التعزيز بالفضة، من الضروري إجراء تجربة استطلاعية لتحديد أوقات الحضن المثلى اللازمة لضمان حجم وتجانس جسيمات الفضة هذه. اتبع هذا الإجراء.

يمكن إجراء طرق أخرى مثل الوسم المناعي للإجابة على تساؤلات مثل تحديد موقع بروتين معين في مقصورة محددة تحت غشاء الـ mar.