Name: Nanogold وصفها نظام Endosomal خميرة التحليلات التركيبية (فيديو) | JoVE Journal
Uploaded: 2014-07-14T15:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 49 s
Description: اكتشف طريقة تصوير الحويصلات الغشائية في خميرة Saccharomyces cerevisiae باستخدام جسيمات الذهب النانوي الموجبة الشحنة. تتيح هذه التقنية دراسة التراكيب فوق الدقيقة للأغشية الخلوية بدقة عالية.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

المؤلفين أشكر رينيه Scriwanek للمساعدة في إعداد الشكل. ويدعم FR بواسطة ECHO (700.59.003)، برنامج ALW المفتوحة (821.02.017 و822.02.014)، والتعاون DFG-NWO (DN82-303) وZonMW VICI (016.130.606) المنح.

1. إعداد الكوراء <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> احتضان بين عشية وضحاها الخميرة في 30 درجة مئوية في 10 مل من المتوسط ​​مناسب يحدده تصميم التجربة. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> بعد اليوم، وقياس الكثافة البصرية للثقافة في 600 نانومتر (OD 600) باستخدام مضواء، تمييع الخلايا في نفس الثقافة المتوسطة إلى OD 600 من 0.2-0.4 وتنمو منها إلى مرحلة النمو المتسارع إلا إذا كان تصميم التجربة يتطلب حالة مختلفة. الخلايا في مرحلة الأسي عندما الثقافة لديه OD 600 من 1-2. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> جمع 10 OD 600 حكمه من الخلايا بواسطة الطرد المركزي في 3500 x ج لمدة 5 دقائق في أنبوب 50 مل. بعد الطرد المركزي، وتجاهل طاف. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> resuspend الكرية خلية في 5 مل من 100 ملي أنابيب (الرقم الهيدروجيني 9.6)، 10 ملي dithiothreitol والمحتضنة في 30 درجة مئوية لمدة 10 دقيقة. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> مرة أخرى جمع الخلايا بواسطة الطرد المركزي في 3500 x ج لمدة 5 دقائق. تجاهل طاف. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> resuspend الخلايا طن 5 مل من المتوسط ​​(التي يحددها تصميم التجربة) التي تحتوي على 1 M السوربيتول و 5 ملغ من انزيم التحللي، واحتضان الخليط عند 30 درجة مئوية مع الهز لطيف لمدة 30 دقيقة. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> الطرد المركزي تعليق خلية في 300 x ج لمدة 5 دقائق لجمع جزء بيليه، والتي تتطابق مع spheroplasts. تجاهل طاف. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> resuspend وspheroplasts في 960 ميكرولتر من وسائل الإعلام الجليد الباردة (تحديد المتوسط ​​عن طريق تصميم التجربة) التي تحتوي على 1 M السوربيتول ونقل الخليط في البرد الجليدي 2 مل أنبوب microcentrifuge. </li></ol> 2. Nanogold امتصاص <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> باستخدام ماصة، مزيج بلطف الكوراء مع 4 نانومول من جزيئات موجبة الشحنة nanogold معلق في 40 ميكرولتر من الماء. الحجم النهائي من الخليط يجب أن يكون من 1 مل. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ضع تعليق الخلية التي تم الحصول عليها على الجليد لمدة 15 دقيقة. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> نقل تعليق في درجة حرارة الغرفة واحتضان ذلك للفترة الزمنية المطلوبة للسماح nanogold الداخلي عن طريق البريدndocytosis. ملاحظة: سوف امتصاص 5 دقائق تؤدي أساسا إلى وضع العلامات من الحويصلات التقامي ومقصورات endosomal في وقت مبكر، في حين أن امتصاص 15 دقيقة سيسمح للاحتفال نظام endosomal كامل (أوائل وأواخر الإندوسومات). وسوف يعد مرات الحضانة (أكثر من 30 دقيقة) تسمح أيضا لتسمية فجوة. ملاحظة: لا يمكن إجراء نبض مطاردة التجارب وضع العلامات مع هذا الأسلوب. لذلك، عندما وصفها لتحليل جنيه، كما سيتم العثور nanogold في وINEE PM. </li></ol> 3. تثبيت وباجتزاء <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> وقف امتصاص nanogold بإضافة 1 مل من ضعف قوة تثبيتي [بارافورمالدهيد 4٪ (PFA)، 0.4٪ غلوتارالدهيد (GA) في 0.1 م العازلة PHEM (20 ملم أنابيب، و 50 ملي HEPES، ودرجة الحموضة 6.9، 20 ملي EGTA، 4 ملي MgCl 2)] تحتوي على 1 M السوربيتول إلى تعليق الخلية. أبقى الأنبوب في درجة حرارة الغرفة. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> عكس بلطف يدويا أنابيب micocentrifuge عدة مرات خلال 30 دقيقة (وهذا سوف يسمح للحفاظ على spheroplasts فيالتعليق) ثم الطرد المركزي مرتين في 1،700 x ج لمدة 25 ثانية. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> استبدال تثبيتي عن طريق التخلص من طاف وذلك بإضافة 1 مل من الطازجة قوة تثبيتي القياسية (2٪ PFA، 0.2٪ GA في 0.1 م العازلة PHEM) تحتوي على 1 M السوربيتول واحتضان لمدة 2 ساعة في درجة حرارة الغرفة على عجلة دوارة ببطء. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> معالجة الخلايا للالبرد باجتزاء كما هو موضح سابقا 6. ملاحظة: للحصول على إجراءات تعزيز امتصاص nanogold والفضة، والعلاج حامض الدوري موضح في البروتوكول المشار إليه لم المراد تنفيذها. علاج حمض الدوري هو أفضل permeabilize جدار الخلية 26 ولكن تم القضاء على هذا الهيكل خلال جيل من spheroplasts. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> خفض 50 نانومتر في cryosections رقيقة -120 درجة مئوية مع جفاف سكين الماس باستخدام مشراح مستدق UCT كما هو موضح سابقا 8 ووضعها على الكربون المغلفة Formvar 50 تنسجم شبكات النيكل. </li></ol> 4. تعزيز الفضية لNanogold الجسيمات Visualization ملاحظة: الإجراء لإعداد الخلائط رد فعل هو في الأساس واحدة أشارت من قبل الشركة المصنعة. التعديلات العملية باستخدام هذا البروتوكول، ويجعل الإجراء تعزيز الفضة فعالة وموثوق بها على cryosections. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> إزالة عدة تعزيز الفضة من الفريزر وذوبان الجليد هو في الحاضنة 37 درجة مئوية أو حمام الماء. عند إذابة، ضع عدة في حاضنة 24 درجة مئوية وضعها في غرفة مظلمة حتى استخدام (انظر 4.7). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> وضع لوحة التدفئة في غرفة مظلمة ودافئة لدرجة الحرارة النهائية من 24 درجة مئوية. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> تغطية الجزء العلوي من لوحة التدفئة مع حامي السطح، الجانب اللامع فوق، وضمان الحصول عليها مع الشريط. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> وضع Parafilm على Benchkote وبمناسبة حواف مع علامة سوداء ليكون قادرا على رؤية الحواف Parafilm في الظلام. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ميزان حرارة الشريط على الجزء العلوي من Benchkote لرصد درجات الحرارة من لوحة التدفئة. ضبط درجة الحرارة تدريجيا إذا لم 24 درجة مئوية. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> جيش التحرير الشعبى الصينىCE أنبوب 50 مل بالماء المقطر المزدوج وطقم تعزيز الفضة في الداخل. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ملء أطباق بتري صغيرة مع الماء المقطر المزدوج، استعد مسبقا عند 37 درجة مئوية. وضع شبكات في الماء، عينة الجانب السلبي، لمدة 30 دقيقة. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> كرر هذه الخطوة 4.7 مرة أخرى. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> نقل الشبكات في صندوق تخزين وتقديمهم إلى غرفة مظلمة. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> شطف شبكات مرة أخرى عن طريق تمرير لهم (مع الجانب عينة لأسفل) على عدة قطرات من الماء المقطر مزدوجة في 24 ° C وضعت على Parafilm التي تم إصلاح على لوحة التدفئة. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> تأكد من أن 9 مزدوجة قطرات الماء المقطر إضافية مستعدون على Parafilm، لالشطف بعد رد الفعل تعزيز الفضة. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> تحويل ضوء قبالة والتأكد من أن جميع الأنوار مطفأة. بدوره الضوء الأحمر على. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> إخراج ألف وباء حلول من عدة تعزيز الفضة من الحاضنة 24 درجة مئوية. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ووضع قطرات 6 الأولى من الحل A ثم 6 قطرات من محلول B في 1.5 مل أنبوب microcentrifuge، وتخلط جيدا مع ماصة باستير الزجاج تجنب جعل فقاعات. الحل هو سميكة جدا ولها إلى أن تكون مختلطة يدويا مع ماصة قبل vortexing لفترة وجيزة في نهاية الأمر. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> وضع حلول A و B مرة أخرى في الحاضنة 24 درجة مئوية، واخراج الحل C. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> إضافة 6 قطرات من الحل C إلى المزيج A / B. ثم تخلط مرة أخرى الأول مع ماصة باستور ومن ثم من قبل vortexing، وتجنب الوقوع في فقاعات. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> استخدامها على الفور الخليط النهائي عن طريق وضع قطرات (~ 20 ميكرولتر / قطرة) على Parafilm. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> مع ملاقط نظيفة، ومكافحة المغناطيسي، ووضع شبكات على الخليط (على سبيل المثال، الفضة تعزيز رد فعل) لمدة 6 to15 دقيقة تبعا للتعزيز (أي. حجم جزيئات الذهب) يرغب في الحصول عليها. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> إزالة شبكات من الخليط وتمريرها على سطح الماء المقطر المزدوج قطرات في 24 درجة مئوية لمدة يغسل. أولا، استخدم في خلافة بسرعة 6 قطرات ثم 3 قطرات مع 7 دقيقة فترة حضانة من كل قطرة ماء، قبل ان يتحول الأضواء على. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> انتقل إلى الخطوة التالية، إما وضع العلامات المناعية الذهب أو غشاء تلطيخ 27 من أجل تصور نتيجة لإجراء تحقيق EM. </li></ol>

<ol><li>Gruenberg, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+endocytic+pathway%3A+a+mosaic+of+domains%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Rev+Mol+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">The endocytic pathway: a mosaic of domains.</a> Nat Rev Mol Cell Biol. 2, 721-730 (2001).</li>
<li>Sachse, M., Ramm, G., Strous, G., Klumperman, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Endosomes%3A+multipurpose+designs+for+integrating+housekeeping+and+specialized+tasks%5BTitle%5D)+AND+%22Histochem+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Endosomes: multipurpose designs for integrating housekeeping and specialized tasks.</a> Histochem Cell Biol. 117, 91-104 (2002).</li>
<li>Luzio, J. P., Pryor, P. R., Bright, N. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Lysosomes%3A+fusion+and+function%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Rev+Mol+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Lysosomes: fusion and function.</a> Nature Rev Mol Cell Biol. 8, 622-632 (2007).</li>
<li>Meel, E., Klumperman, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Imaging+and+imagination%3A+understanding+the+endo-lysosomal+system%5BTitle%5D)+AND+%22Histochem+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Imaging and imagination: understanding the endo-lysosomal system.</a> Histochem Cell Biol. 129, 253-266 (2008).</li>
<li>Bonangelino, C. J., Chavez, E. M., Bonifacino, J. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Genomic+screen+for+vacuolar+protein+sorting+genes+in+Saccharomyces+cerevisiae%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Biol+Cell%22%5BJournal%5D)">Genomic screen for vacuolar protein sorting genes in Saccharomyces cerevisiae.</a> Mol Biol Cell. 13, 2486-2501 (2002).</li>
<li>Griffith, J., Reggiori, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Ultrastructural+analysis+of+nanogold-labeled+endocytic+compartments+of+yeast+Saccharomyces+cerevisiae+using+a+cryosectioning+procedure%5BTitle%5D)+AND+%22J+Histochem+Cytochem%22%5BJournal%5D)">Ultrastructural analysis of nanogold-labeled endocytic compartments of yeast Saccharomyces cerevisiae using a cryosectioning procedure.</a> J Histochem Cytochem. 57, 801-809 (2009).</li>
<li>Babst, M., Katzmann, D. J., Estepa-Sabal, E. J., Meerloo, T., Emr, S. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((ESCRT-III%3A+an+endosome-associated+heterooligomeric+protein+complex+required+for+MVB+sorting%5BTitle%5D)+AND+%22Dev+Cell%22%5BJournal%5D)">ESCRT-III: an endosome-associated heterooligomeric protein complex required for MVB sorting.</a> Dev Cell. 3, 271-282 (2002).</li>
<li>Griffith, J., Mari, M., De Maziere, A., Reggiori, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+cryosectioning+procedure+for+the+ultrastructural+analysis+and+the+immunogold+labelling+of+yeast+Saccharomyces+cerevisiae%5BTitle%5D)+AND+%22Traffic%22%5BJournal%5D)">A cryosectioning procedure for the ultrastructural analysis and the immunogold labelling of yeast Saccharomyces cerevisiae.</a> Traffic. 9, 1060-1072 (2008).</li>
<li>Lewis, M. J., Nichols, B. J., Prescianotto-Baschong, C., Riezman, H., Pelham, H. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Specific+retrieval+of+the+exocytic+SNARE+Snc1p+from+early+yeast+endosomes%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Biol+Cell%22%5BJournal%5D)">Specific retrieval of the exocytic SNARE Snc1p from early yeast endosomes.</a> Mol Biol Cell. 11, 23-38 (2000).</li>
<li>Prescianotto-Baschong, C., Riezman, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Ordering+of+compartments+in+the+yeast+endocytic+pathway%5BTitle%5D)+AND+%22Traffic%22%5BJournal%5D)">Ordering of compartments in the yeast endocytic pathway.</a> Traffic. 3, 37-49 (2002).</li>
<li>Odorizzi, G., Babst, M., Emr, S. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fab1p+PtdIns%283%29P+5-kinase+function+essential+for+protein+sorting+in+the+multivesicular+body%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Fab1p PtdIns(3)P 5-kinase function essential for protein sorting in the multivesicular body.</a> Cell. 95 (3), 847-858 (1998).</li>
<li>Donselaar, E., Posthuma, G., Zeuschner, D., Humbel, B. M., Slot, J. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Immunogold+labeling+of+cryosections+from+high-pressure+frozen+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Traffic%22%5BJournal%5D)">Immunogold labeling of cryosections from high-pressure frozen cells.</a> Traffic. 8, 471-485 (2007).</li>
<li>Lah, J. J., Hayes, D. M., Burry, R. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+neutral+pH+silver+development+method+for+the+visualization+of+1-nanometer+gold+particles+in+pre-embedding+electron+microscopic+immunocytochemistry%5BTitle%5D)+AND+%22J+Histochem+Cytochem%22%5BJournal%5D)">A neutral pH silver development method for the visualization of 1-nanometer gold particles in pre-embedding electron microscopic immunocytochemistry.</a> J Histochem Cytochem. 38, 503-508 (1990).</li>
<li>Shah, N., Zhang, S., Harada, S., Smith, R. M., Jarett, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Electron+microscopic+visualization+of+insulin+translocation+into+the+cytoplasm+and+nuclei+of+intact+H35+hepatoma+cells+using+covalently+linked+Nanogold-insulin%5BTitle%5D)+AND+%22Endocrinol%22%5BJournal%5D)">Electron microscopic visualization of insulin translocation into the cytoplasm and nuclei of intact H35 hepatoma cells using covalently linked Nanogold-insulin.</a> Endocrinol. 136, 2825-2835 (1995).</li>
<li>Weipoltshammer, K., Schofer, C., Almeder, M., Wachtler, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Signal+enhancement+at+the+electron+microscopic+level+using+Nanogold+and+gold-based+autometallography%5BTitle%5D)+AND+%22Histochem+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Signal enhancement at the electron microscopic level using Nanogold and gold-based autometallography.</a> Histochem Cell Biol. 114, 489-495 (2000).</li>
<li>Tokuyasu, K. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+technique+for+ultracryotomy+of+cell+suspensions+and+tissues%5BTitle%5D)+AND+%22J+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">A technique for ultracryotomy of cell suspensions and tissues.</a> J Cell Biol. 57, 551-565 (1973).</li>
<li>Cabrera, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Phosphorylation+of+a+membrane+curvature-sensing+motif+switches+function+of+the+HOPS+subunit+Vps41+in+membrane+tethering%5BTitle%5D)+AND+%22J+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Phosphorylation of a membrane curvature-sensing motif switches function of the HOPS subunit Vps41 in membrane tethering.</a> J Cell Biol. 191, 845-859 (2010).</li>
<li>Harner, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+mitochondrial+contact+site+complex%2C+a+determinant+of+mitochondrial+architecture%5BTitle%5D)+AND+%22EMBO+J%22%5BJournal%5D)">The mitochondrial contact site complex, a determinant of mitochondrial architecture.</a> EMBO J. 30, 4356-4370 (2011).</li>
<li>Nair, U., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((SNARE+proteins+are+required+for+macroautophagy%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">SNARE proteins are required for macroautophagy.</a> Cell. 146, 290-302 (2011).</li>
<li>Jacquier, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Lipid+droplets+are+functionally+connected+to+the+endoplasmic+reticulum+in+Saccharomyces+cerevisiae%5BTitle%5D)+AND+%22J+Cell+Sci%22%5BJournal%5D)">Lipid droplets are functionally connected to the endoplasmic reticulum in Saccharomyces cerevisiae.</a> J Cell Sci. 124, 2424-2437 (2011).</li>
<li>Karanasios, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Regulation+of+lipid+droplet+and+membrane+biogenesis+by+the+acidic+tail+of+the+phosphatidate+phosphatase+Pah1p%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Biol+Cell%22%5BJournal%5D)">Regulation of lipid droplet and membrane biogenesis by the acidic tail of the phosphatidate phosphatase Pah1p.</a> Mol Biol Cell. 24, 2124-2133 (2013).</li>
<li>Mari, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((An+Atg9-containing+compartment+that+functions+in+the+early+steps+of+autophagosome+biogenesis%5BTitle%5D)+AND+%22J+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">An Atg9-containing compartment that functions in the early steps of autophagosome biogenesis.</a> J Cell Biol. 190, 1005-1022 (2010).</li>
<li>Nair, U., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+role+for+Atg8-PE+deconjugation+in+autophagosome+biogenesis%5BTitle%5D)+AND+%22Autophagy%22%5BJournal%5D)">A role for Atg8-PE deconjugation in autophagosome biogenesis.</a> Autophagy. 8, 780-793 (2012).</li>
<li>Vaart, A., Griffith, J., Reggiori, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Exit+from+the+Golgi+is+required+for+the+expansion+of+the+autophagosomal+phagophore+in+yeast+Saccharomyces+cerevisiae%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Biol+Cell%22%5BJournal%5D)">Exit from the Golgi is required for the expansion of the autophagosomal phagophore in yeast Saccharomyces cerevisiae.</a> Mol Biol Cell. 21, 2270-2284 (2010).</li>
<li>Erpapazoglou, Z., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+dual+role+for+K63-linked+ubiquitin+chains+in+multivesicular+body+biogenesis+and+cargo+sorting%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Biol+Cell%22%5BJournal%5D)">A dual role for K63-linked ubiquitin chains in multivesicular body biogenesis and cargo sorting.</a> Mol Biol Cell. 23, 2170-2183 (2012).</li>
<li>Tuinen, E., Riezman, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Immunolocalization+of+glyceraldehyde-3-phosphate+dehydrogenase%2C+hexokinase%2C+and+carboxypeptidase+Y+in+yeast+cells+at+the+ultrastructural+level%5BTitle%5D)+AND+%22J+Histochem+Cytochem%22%5BJournal%5D)">Immunolocalization of glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase, hexokinase, and carboxypeptidase Y in yeast cells at the ultrastructural level.</a> J Histochem Cytochem. 35, 327-333 (1987).</li>
<li>Slot, J. W., Geuze, H. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cryosectioning+and+immunolabeling%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Protoc%22%5BJournal%5D)">Cryosectioning and immunolabeling.</a> Nat Protoc. 2, 2480-2491 (2007).</li>
<li>Prescianotto-Baschong, C., Riezman, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Morphology+of+the+yeast+endocytic+pathway%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Biol+Cell%22%5BJournal%5D)">Morphology of the yeast endocytic pathway.</a> Mol Biol Cell. 9, 173-189 (1998).</li>
<li>Vida, T. A., Emr, S. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+new+vital+stain+for+visualizing+vacuolar+membrane+dynamics+and+endocytosis+in+yeast%5BTitle%5D)+AND+%22J+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">A new vital stain for visualizing vacuolar membrane dynamics and endocytosis in yeast.</a> J Cell Biol. 128, 779-792 (1995).</li>
<li>Hainfeld, J. F., Powell, R. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((New+frontiers+in+gold+labeling%5BTitle%5D)+AND+%22J+Histochem+Cytochem%22%5BJournal%5D)">New frontiers in gold labeling.</a> J Histochem Cytochem. 48, 471-480 (2000).</li>
</ol>

ليس لدى المؤلفين ما يكشفون عنه.

المناعية الإلكترون المجهري هو الاسلوب الذي يسمح الجمع بين توطين البروتينات مع قرار التركيبية من الناقلين والعضيات حيث تتواجد هذه البروتينات. هذا أمر بالغ الأهمية ولا سيما عند دراسة نظام الخميرة endosomal لأن حجرات لها تظهر هياكل نقط كما في مضان المجهري. وبالتالي فإنه من الصعب تمييزها. لهذا السبب، فإن استخدام مسبار كشفها بواسطة EM ودخول الطريق التقامي بطريقة تعتمد الوقت أمر بالغ الأهمية للاحتفال تحديدا الإندوسومات مختلفة. هذا النوع من التحقيق هو قيمة لتقييم وظائف الإلتقام 6</s...

نظام endosomal هو جهاز الفرز غشاء الرئيسية التي تلعب أدوارا متعددة الخلوية حاسمة بما في ذلك الاتجار انزيم الليزوزومية مستقبلات الفرز وإعادة التدوير من غشاء البلازما (بعد الظهر) مستقبلات 1،2. وتنقسم الإندوسومات في ثلاث مقصورات مختلفة، مثال. والإندوسومات في وقت مبكر (EE)، والإندوسومات الراحل (LE) والإندوسومات إعادة التدوير. ويستند هذا التصنيف على الوقت الذي يستغرقه للمواد endocytosed للوصول إليهم، على بروتينات محددة وعلامة على التشكل. يمكن أن تكون إما تسليمها الأغشية، أي البروتين والدهون طبقات ثنائية، المنضوية من PM إلى الجسيمات الحالة عبر الإندوسومات للتدهور أو إعادة تدويرها مرة أخرى. ويتم نقل الأغشية أيضا الإندوسومات من جولجي وبالمثل، إما الاستمرار في الجسيمات الحالة أو يتم استردادها مرة أخرى إلى جولجي. وعلاوة على ذلك، والبروتينات يمكن أن تخزن في الحويصلات اللمعية في مهدها الداخل من endosomal الحد الغشاء، وهي العملية التي تؤدي إلى تشكيلفئة فرعية من جنيه، والهيئات عديد الحويصلات. نظام endosomal الخميرة هو نسبيا أقل تعقيدا من واحدة من الخلايا حقيقية النواة عالية. وتنقسم الإندوسومات الخميرة في وEE جنيه. وعلى النقيض من خلايا الثدييات أنها لا تحتوي على الإندوسومات إعادة التدوير ولكن أيضا العضيات ذات الصلة يحلول الأنسجة محددة. وبالتالي لديهم شبكة أقل تعقيدا من طرق الاتجار endosomal 3،4. ولذلك فقد الخميرة مثلت ولا تزال تمثل النظام التجريبي مفيد لدراسة بعض المبادئ الأساسية في حركة غشاء نظام endosomal. وأكد هذه الميزة من حقيقة أن العديد من الجينات المعنية في مسارات endosomal تم عزلها في البداية مع شاشات الوراثية في الخميرة 5. في حين أن النظام endosomal الخميرة في النوع البري وخلايا متحولة وقد درس على نطاق واسع باستخدام نهج المجهري البيوكيميائية ومضان، تحقيقاتها على مستوى التركيبية كان فقطالحد الأدنى. التحليلات المورفولوجية هي ذات أهمية خاصة في الخميرة لأن يتم الكشف عن معظم العضيات endosomal عن الهياكل نقط بواسطة المجهر مضان، والتي تجعل من الصعب تحديد لا لبس فيه 6. للأسف سوى عدد محدود من أمصال مضادة الاعتراف علامات البروتين الخميرة endosomal تعمل في المناعية الإلكترون المجهري (IEM) الاستعدادات 7-10. بالنسبة لبعض البروتينات، وقد تم التحايل على هذه المشكلة عن طريق وضع علامات الذاتية من الجينات في المصالح واستخدام الأجسام المضادة الاعتراف علامة على الكشف عن 7،11،12. في كثير من الأحيان، ومع ذلك، لا يمكن الكشف عنها بواسطة البروتينات هي IEM بسبب انخفاض مستويات التعبير الخاصة بهم. من overexpression ليست حلا لأن هذا النهج يمكن أن تحدث سوء تعريب و / أو تغييرات في التشكل عضية / وظائف. وبالتالي فإن وضع العلامات من مقصورات التقامي مع لجنة التحقيق كشفها بواسطة المجهر الإلكتروني EM هو خيار فعالة. هذا هو الحل الأمثل وخاصة إذا كان العلاقات العامةوسام الإمبراطورية البريطانية تدخل الطريق التقامي بطريقة تعتمد على الوقت، والذي يسمح لمعرفة متى سيكون علامة على عضية محددة 6. وقد تم بنجاح استخدام امتصاص nanogold موجبة الشحنة من قبل spheroplasts الخميرة (أي. الخميرة حيث تمت إزالة جدار الخلية إنزيمي) لتحديد endosomal الخميرة المقصورات 10. هذه الجسيمات يرتبط بقوة إلى الدهون سالبة الشحنة تتكون الأغشية البيولوجية. وبالتالي الزميلة nanogold موجبة مع رئيس الوزراء، تخترق الخلية عن طريق الإلتقام ويمر عبر EE جنيه وقبل أن يصل إلى فجوة. هذه الجسيمات صغيرة من الذهب، ومع ذلك، لم يكن لديك الحجم المناسب أن ينظر إليها من قبل EM. لجعلها مرئية، حجمها يمكن توسيعها عن طريق التفاعلات الكيميائية التي تؤدي إلى ترسب الفضة أو الذهب حول التحقيق الذهب 13-15. قمنا بتطوير وتطبيق هذا النهج بنجاح IEM على أساس أسلوب Tokuyasu لأداء التحت خلويةيدرس توطين 8،16. يسمح هذا الأسلوب أداء immunogold وضع العلامات على الاستعدادات الخميرة مع قرار ممتاز من التشكل 8،17-24. أنشأنا أيضا إجراء الجمع بين هذا البروتوكول IEM مع وضع العلامات nanogold النظام الخميرة endosomal المقصورات 6. باستخدام هذا النهج الذي اتسمت شكليا فرعية مختلفة من الإندوسومات وultrastructurally فحص المسوخ مع الاتجار endosomal عيب 6،25. علاوة على ذلك، لقد أثبتنا أن هذا الوسم nanogold يمكن دمجها مع labelings immunogold توفير إمكانية لاستكشاف توزيع بروتين من الفائدة على مجموعات سكانية فرعية مختلفة جسيم داخلي. هنا نقدم كيف يتم تنفيذ وسم النظام الخميرة endosomal مع nanogold موجبة عمليا.

<table><tbody><tr><td>الأنابيب (piperazin-1،4-bis (2-ethansulfensaure)Merck</td> <td>، دارمشتات ، ألمانيا</td><td>1،102،200،250</td><td></td></tr><tr><td>HEPES</td><td>Merck ، دارمشتات ، ألمانيا</td><td>391،340</td><td></td></tr><tr><td>EGTA</td><td>Sigma ، سانت لويس ، MO</td><td>E4378</td><td></td></tr><tr><td>MgCl2&middot ؛ 6H2O</td><td>Merck ، دارمشتات ، ألمانيا</td><td>1،058،330،250</td><td></td></tr><tr><td>DL-Dithiothreitol</td><td>Sigma ، سانت لويس ، MO</td><td>D0632</td><td></td></tr><tr><td>Sorbitol</td><td>Sigma ، سانت لويس ، MO</td><td>S1876</td><td></td></tr> متجر <tr><td>Nanogold NanoProbes مشحونة إيجابيا</td><td>، Yaphank ، NY</td><td>2022</td><td>عند -20 درجة ؛ C</td></tr><tr><td>HQ-silver & trade; تعزيز عدة</td><td>Nanoprobes, Yaphank, NY</td><td>2012</td><td>متجر في -20 & درجة; C</td></tr><tr><td>بارافورمالدهيد (PFA)</td> <td>سيجما ، سانت لويس ، ميزوري</td><td>441244</td><td></td></tr><tr><td>جلوتارالديهايد 8٪ EM الصف</td><td>Polyscience، Inc. ، Warrington ، PA</td><td>216</td><td>متجر في -20 درجة ؛ C</td></tr><tr><td>إنزيم لايتيك</td><td>MP Biomedicals ، سانتا آنا ، كاليفورنيا</td><td>153526</td><td>مخزن عند -20 درجة ؛ C</td></tr><tr><td>Parafilm M</td><td>Sigma, St louis, MO</td><td>P7793</td><td></td></tr><tr><td>50 شبكات شبكات النيكل &nbsp;</td><td>Agar Scientific ، ستانستيد ، المملكة المتحدة</td><td>G209N</td><td></td></tr><tr><td>سكين الماس المناعي بالتبريد 35 درجة ؛</td><td>Diatome AG ، بيل ، سويسرا</td><td>NA.</td><td></td></tr><tr><td>UCT ultramicrotome&nbsp;</td><td>لايكا ، سولمز ، ألمانيا</td><td>NA</td><td></td></tr><tr><td>Formvar 15/95</td> علوم <td>المجهر الإلكتروني الراتنج ، هاتفيلد ، بنسلفانيا</td><td>15800</td><td></td></tr><tr><td>50 شبكات شبكات النيكل &nbsp ؛</td><td>Agar Scientific ، ستانستيد ، المملكة المتحدة</td><td>AGG2050N</td><td></td></tr><tr><td>Parafilm</td><td>Sigma ، سانت لويس ، MO</td><td>P7793</td><td></td></tr><tr><td>صندوق تخزين الشبكات</td><td>Leica ، Solms ، ألمانيا</td><td>162-50</td><td></td></tr><tr><td>Falcon 100 مم × 15 مم طبق بتري</td><td>Corning ، Corning ، NY</td><td>351029</td><td></td></tr><tr><td>ماصات شعرية باستور 150 مم</td><td>Van Bruggen Glas ، روتردام ، هولندا</td><td>10216234</td><td></td></tr><tr><td>1.5 مل من أجهزة الطرد المركزي الدقيقة&nbsp;</td><td>Sarstedt, N&uuml; mbrecht ، ألمانيا</td><td>72690001</td><td></td></tr><tr><td>أنبوب 50 مل</td><td>Bio-one ، Alphen aan den Rijn ، هولندا</td><td>210296</td><td></td></tr><tr><td>Benchkote واقي السطح</td><td>Whatman ، Maidstone ، المملكة المتحدة &nbsp ؛</td><td>1159201</td><td></td></tr></tbody></table>

nanogold وصفها نظام endosomal خميرة التحليلات التركيبية

Nanogold Labeling of the Yeast Endosomal System for Ultrastructural Analyses

الإندوسومات هي واحدة من كبرى غشاء الفرز نقاط التفتيش في الخلايا حقيقية النواة والتي تنظم إعادة تدوير أو تدمير معظمها من البروتينات الغشاء البلازمي وجولجي. ونتيجة لذلك النظام endosomal يلعب دورا محوريا في الحفاظ على التوازن الخلية، والطفرات في جينات المنتمين إلى هذه الشبكة من العضيات مترابطة بواسطة وسائل النقل الحويصلي، يسبب أمراض خطيرة بما في ذلك السرطان والاضطرابات العصبية. لذا من الأهمية رئيس هو لفهم الآليات الكامنة وراء نشوء حيوي وتنظيم نظام endosomal. كان الخباز الخباز الخميرة محوريا في هذه المهمة. لتسمية تحديدا وتحليل على مستوى التركيبية النظام endosomal هذا النموذج الحي، فإننا نقدم هنا بروتوكول مفصلة لامتصاص nanogold موجبة الشحنة من قبل spheroplasts تليها التصور من هذه الجسيمات من خلال تعزيز التفاعل الفضة. هذا الأسلوب هو أيضا قيمة للغايةل لفحص الصرفي من المسوخ مع عيوب في الاتجار endosomal. وعلاوة على ذلك، فإنه ليس فقط ينطبق على الامتحانات التركيبية لكنها يمكن أيضا أن تكون جنبا إلى جنب مع labelings immunogold للتحقيقات البروتين التعريب.

ويبين وفقا لبروتوكول المقدمة، مورفولوجية النظام الخميرة جسيم داخلي يمكن أن يكون وصول EM الإرسال. الشكل 1 أنواع مختلفة من المقصورات endosomal التي تم التوصل إليها، وبالتالي المسمى مع nanogold. وnanogold محسنة الفضة يمكن رؤيتها بوضوح كما الإلكترون جسيمات كثيفة. الإعدادات المثلى التي أنشئت لتعزيز تفاعل الفضة يسمح وجود جزيئات الذهب في مجموعة متجانسة الحجم ما بين 5 و 15 نانومتر، والتي لا تتداخل مع التركيب الدقيق للخلية الخميرة. غشاء البلازما وكذلك المقصورات endosomal ف...

الخميرة، خميرة الخباز كان، كائن نموذج المفتاح لتحديد ودراسة الجينات التي تنظم نشوء حيوي وظائف الجهاز endosomal. هنا نقدم بروتوكول مفصلة لوضع العلامات المحددة للمقصورات endosomal للدراسات التركيبية.

Nanogold وصفها نظام Endosomal خميرة التحليلات التركيبية

Endosomes are one of the major membrane sorting checkpoints in eukaryotic cells and they regulate recycling or destruction of proteins mostly from the ...

الهدف العام من التجربة التالية هو تصوير المقصورات الإندوسومية في خميرة Saccharomyces cei على المستوى البنيوي الدقيق. ويتم تحقيق ذلك عن طريق تحضير كرات من الخميرة (yeast Sphera plast)، والتي تقوم بعد ذلك بعملية امتصاص خلوية إندوسومية لجسيمات الذهب النانوية الموجبة الشحنة. وكخطوة ثانية، يتم تثبيت العينة وتقطيعها للحصول على مقاطع تجميدية فائقة الرقة من الخلايا.بعد ذلك، تخضع المقاطع المجمّدة لتفاعل تعزيز الفضة. ومن أجل تكبير وتصور جسيمات الذهب النانوية موجبة الشحنة التي تم إدخالها خلوياً، يتم الحصول على نتائج توضح مورفولوجيا المقصورات الإندوسومية المختلفة في الخميرة بناءً على الوسم النوعي لهذا الإجراء. وتتمثل الميزة الرئيسية لهذه التقنية مقارنة بطرقنا الحالية، مثل وسم المقاطع بالذهب المناعي (ImmunoGold)، في أنها لا تعتمد على الأجسام المضادة التي غالباً ما لا تعمل في تحضيرات المجهر الإلكتروني.على الرغم من أن هذه الطريقة يمكن أن تمنحنا رؤى حول النظام الليزوزومي في خميرة Saccharomyces cerevisiae، إلا أنه يمكن تطبيقها أيضاً على نماذج حقيقية النواة أخرى مثل أنواع أخرى من الخمائر والخلايا الثديية. يتم أولاً تحضين الخميرة التي سيتم تحضير البروتوبلاست منها طوال الليل عند درجة حرارة 30 درجة مئوية في 10 ملليلتر من الوسط المناسب، وفقاً لما يحدده تصميم التجربة في اليوم التالي. بعد قياس الكثافة الضوئية للمستنبت عند 600 نانومتر، تخفف الخلايا في وسط الاستنبات نفسه لتصل الكثافة الضوئية (OD 600) إلى ما بين 0.2 و0.4.قم بتنمية الخلايا حتى تصل إلى مرحلة النمو الأسي بقيمة OD 600 تتراوح بين واحد إلى اثنين، ثم انقل ما يعادل 10 OD 600 من الخلايا إلى أنبوب سعة 50 milliliter وافصلها بجهاز الطرد المركزي عند 2100 Gs لمدة خمس دقائق. بعد عملية الطرد المركزي، تخلص من الراشح وأعد تعليق كتلة الخلايا في خمسة milliliters من 100 millimolar pipes و 10 millimolar dihi three at Hall، ثم حضنها عند 30 degrees Celsius لمدة 10 دقائق. اجمع الخلايا عن طريق الطرد المركزي.بعد التخلص من الطافي، أعد تعليق الخلايا في خمسة ملليلترات من الوسط الذي يحتوي على سوربيتول بتركيز 1 M، وخمسة مليغرامات من الإنزيم المحلل. حضّن الخليط عند درجة حرارة 30 °C مع الرج اللطيف لمدة 30 دقيقة. قم بطرد مركزي لمعلق الخلايا عند 300 Gs لمدة خمس دقائق لجمع جزء الراسب الذي يمثل الـ Sphero plats.تخلص من الطافي وأعد تعليق الخلايا المفرغة من الجدار (spheroplasts) في 960 µL من الوسط المبرد بالثلج الذي يحتوي على sorbitol بتركيز 1 M. انقل الخليط إلى أنبوب طرد مركزي دقيق سعة 2 mL مبرد بالثلج. لبدء إجراء امتصاص ذهب النانو، استخدم ماصة وامزج الخلايا المفرغة من الجدار برفق مع أربعة من جزيئات ذهب النانو ذات الشحنة الموجبة.إعادة تعليق المادة في 40 µL من الماء. يجب أن يكون الحجم النهائي للمزيج 1 mL. توضع الخلايا المعلقة التي تم الحصول عليها على الثلج لمدة 15 دقيقة.انقل المعلق إلى درجة حرارة الغرفة واتركه في الحضانة للمدة المطلوبة للسماح بدخول ذهب النانو إلى داخل الخلايا عن طريق الالتقام الخلوي. عند اكتمال امتصاص ذهب النانو المطلوب، أوقف التفاعل بإضافة ملليلتر واحد من المثبت مزدوج التركيز الذي يحتوي على سوربيتول بتركيز 1 molar إلى معلق الخلايا. اترك الأنبوب في درجة حرارة الغرفة لمدة 30 دقيقة.اقلب أنبوب جهاز الطرد المركزي الدقيق يدويًا وببطء عدة مرات خلال 30 دقيقة للحفاظ على PHE plast والمعلق. بعد ذلك، قم بإجراء الطرد المركزي مرتين عند 1700 Gs لمدة 25 ثانية، ثم تخلص من السائل الطافي وأضف 1 mL من مثبت حديث القوة القياسية يحتوي على 1 M من السوربيتول، ثم حضن العينة لمدة ساعتين في درجة حرارة الغرفة على عجلة دوارة ببطء. لاحقًا، يتم معالجة الخلايا وتقطيعها بالتبريد (cryo sectioning) كما هو موضح في البروتوكول النصي قبل بدء هذا الإجراء؛ قم بإخراج طقم تعزيز الفضة من المجمد واتركه يذوب في حضانة عند 37 °C. ضع الطقم المذاب في حضانة مكتبية عند 24 °C، والتي تكون قد وضعت مسبقًا في الغرفة المظلمة حتى حين استخدامها.ضع صفيحة تسخين في غرفة مظلمة وسخنها حتى تصل إلى درجة حرارة نهائية تبلغ 24 درجة مئوية. غطِّ الجزء العلوي من صفيحة التسخين بغطاء حماية لسطح المختبر، بحيث يكون الجانب اللامع للأعلى، وثبته باستخدام الشريط اللاصق. ضع شريط البارافيلم (para film) على واقي السطح وحدد الحواف بقلم تحديد أسود لتمكين الرؤية في الظلام.ثبت ميزان حرارة بشريط لاصق على الجزء العلوي من واقي السطح. لمراقبة درجة حرارة لوح التسخين، قم بتعديل درجة الحرارة تدريجياً. إذا لم تصل إلى 24 °C، ضع أنبوباً سعة 50 mL يحتوي على ماء مقطر مرتين.داخل الحاضنة، املأ طبق بتري صغير بماء مقطر مزدوج، تم تدفئته مسبقاً عند 37 درجة Celsius. ضع شبكتين من النيكل تحتويان على المقاطع المبردة في الماء بحيث يكون جانب العينة للأسفل لمدة 30 دقيقة. بعد مرور 30 دقيقة، املأ طبق بتري ثانٍ بماء مقطر مزدوج مدفأ مسبقاً وضع شبكتي النيكل ذاتهما في الماء لمدة 30 دقيقة أخرى.اشطف الشبكات مرة أخرى عن طريق تمريرها بحيث يكون جانب العينة لأسفل فوق عدة قطرات من الماء المقطر المزدوج عند درجة حرارة 24 °C الموضوعة على ورق الترشيح المثبت على لوح التسخين. تأكد من تجهيز تسع قطرات إضافية من الماء المقطر المزدوج على ورق الترشيح لعملية الشطف التي تلي تفاعل تعزيز الفضة. في هذه المرحلة من الإجراء، يجب إطفاء جميع الأنوار في الغرفة المظلمة وتشغيل الضوء الأحمر.ومع ذلك، ستظل الإضاءة تعمل لأغراض التصوير فقط. في هذا العرض التوضيحي، أخرج المحلولين a وB من مجموعة تعزيز الفضة من الحاضنة عند درجة حرارة 24 درجة Celsius في أنبوب طرد مركزي دقيق سعة 1.5 milliliter، بوضع ست قطرات من المحلول A، تليها ست قطرات من المحلول B، ثم اخلطهما جيداً باستخدام ماصة باستور زجاجية مع تجنب تكون الفقاعات. قم برج المحلول باستخدام جهاز Vortex.أعد المحلولين a وB لفترة وجيزة إلى الحاضنة عند درجة حرارة 24 degree Celsius وأخرج المحلول C. أضف ست قطرات من المحلول C إلى خليط AB. اخلط المكونات مرة أخرى باستخدام ماصة باستور ثم باستخدام جهاز جهاز الخلط الدوامي (vortex)، مع تجنب تكوين فقاعات.استخدم هذا الخليط النهائي على الفور. ضع قطرات على البارافورم باستخدام ملقط نظيف مضاد للمغناطيسية. ضع الشبكات على الخليط.هذا هو تفاعل تعزيز الفضة. تُترك الشبكات لمدة تتراوح من ست إلى 15 دقيقة اعتماداً على درجة التعزيز المطلوبة للتجربة. تُزال الشبكات من الخليط وتُمرر بسرعة عبر سلسلة من ست قطرات من الماء المقطر مرتين موضوعة على Perfil عند 24 درجة Celsius في عمليات الغسل الثلاث الأخيرة.اترك الشبكات لمدة سبع دقائق لكل قطرة ماء. وفي حال إجراء تجربة فعلية، أعد تشغيل الأضواء عند اكتمال عملية الغسيل. بعد ذلك، يتم تصور النتائج إما عن طريق الوسم بـ ImmunoGold أو صبغ الغشاء لإجراء فحص مجهري إلكتروني (EM).يمكن وسم أنواع مختلفة من المقصورات الإندوسومية في الخميرة باستخدام الذهب النانوي المعزز بالفضة وتصويرها بواسطة المجهر الإلكتروني. يؤدي امتصاص الذهب النانوي لمدة خمس دقائق إلى وسم الغشاء البلازمي والمقصورات الإندوسومية المبكرة، مثل الحويصلات المفردة، والتي يحتمل أن تكون حويصلات اندخالية، والهياكل الأنبوبية، والتي من المرجح جداً أن تكون إندوسومات مبكرة. أما الحضن مع الذهب النانوي لمدة 30 دقيقة فيؤدي إلى وسم الإندوسومات المتأخرة أو الأجسام متعددة الحويصلات.تتجلى القوة التحليلية لدمج إجراء المجهر الإلكتروني المناعي مع بروتوكول تعزيز الذهب والفضة النانوي هذا في الحفاظ على جودة ومورفولوجيا العضيات الموضحة، وبوجه خاص الحويصلات الداخلية للأجسام متعددة الحويصلات. وقبل استخدام طريقة التعزيز بالفضة، من الضروري إجراء تجربة استطلاعية لتحديد أوقات الحضن المثلى اللازمة لضمان حجم وتجانس جسيمات الفضة هذه. اتبع هذا الإجراء.يمكن إجراء طرق أخرى مثل الوسم المناعي للإجابة على تساؤلات مثل تحديد موقع بروتين معين في مقصورة محددة تحت غشاء الـ mar.

nanogold-labeling-yeast-endosomal-system-for-ultrastructural

Research

JoVE Journal

Biology

علم الأحياء

وتستخدم على نطاق واسع GFP الانصهار البروتينات لتصور العضيات بواسطة الفحص المجهري متحد البؤر. ومع ذلك ، الكشف عن الطفرات التي تؤثر في التشكل من العضيات يتطلب عموما الطفرات الفردية وقتا طويلا. هنا ، علينا أن نظهر وسيلة لدمج عضية في وقت واحد ، في GFP علامات الجينات غير الضرورية في 5000 ما يقرب من الخميرة.

أسلوب الإنتاجية العالية عالميا لدراسة مورفولوجية عضية في البيرة س.

ووصف نهج قوي لمراقبة تسليم العضيات لمعة الحامضية للفجوة الخميرة للتحلل وإعادة التدوير. الأسلوب يعتمد على وضع العلامات المحددة الهدف العضيات مع مضان المزدوجة الانبعاثات المرمزة وراثيا الحموضة ، جهاز الاستشعار البيولوجي ، والتصور من الخلايا الفردية باستخدام المجهر مضان.

والفحص المجهري لالإسفار Mitophagy الرصد في الخميرة السكيراء الجعوية

توضح هذه المقالة الطرق لتركيب ووضع العلامات الفلورية النانوية (NPS). تم تطبيق مصادر القدرة النووية في التجارب نبض مطاردة لتسمية نظام إندو-الليزوزومية من الخلايا حقيقية النواة. وتلت التلاعب في نظام إندو الليزوزومية من الأنشطة من مسببات المرض داخل الخلايا السالمونيلا الملهبة التي كتبها التصوير الخلية الحية وكميا.

تطبيق نيون النانوية لدراسة إعادة عرض لنظام إندو-الليزوزومية من البكتيريا داخل الخلايا

غالبا ما يوفر &gt;jove_content&lt;القياس الكمي الدقيق لأحداث الاتجار الحويصلي بنتائج تحليلات رئيسية حول أدوار بروتينات معينة وتأثيرات الطفرات. تقدم هذه الورقة طرقا لاستخدام pHluorin الفائق ، وهو متغير GFP حساس للأس الهيدروجيني ، كأداة للقياس الكمي للأحداث الداخلية في الخلايا الحية باستخدام المجهر الفلوري الكمي وقياس التدفق الخلوي.

تطبيقات pHluorin لالكمي، الحركية وعالية الإنتاجية تحليل الإلتقام في مهدها الخميرة

تصف هذه المخطوطة وسيلة سهلة الاستخدام ومنخفضة التكلفة كريوفيكساتيون لتصور خلايا تعليق عن طريق انتقال المجهر الإلكتروني.

يغرق التجميد: أداة لدراسات التركيبية وImmunolocalization من خلايا تعليق في نقل المجهر

يصف هذا البروتوكول تحليل المقصورات داخل الخلايا التي تحمل علامة الفلورسنت في الخميرة الناشئة باستخدام مجهرية متعددة الألوان 4D (الفاصل الزمني 3D). يتم اختيار معلمات التصوير لالتقاط إشارات كافية مع الحد من الأضرار الضوئية. تسمح الإضافات المخصصة لـ ImageJ بتتبع الهياكل المسماة وتحليلها كمياً.

4D مجهرية الخميرة

هنا، نقدم التصوير بالخلايا الحية وهو طريقة مجهرية غير سامة تسمح للباحثين بدراسة سلوك البروتين والديناميات النووية في خلايا الخميرة الانشطارية الحية أثناء الداء الميتوميوميس.

فحص الديناميات النووية الخميرة الانشطارية الميتومية وMeiotic عن طريق الفلورة الخلية الحية المجهرية

جينوم الخباز للخميرة الميتوكوندريا يرمز ثمانية من البوليبتيدات. الهدف من البروتوكول الحالي هو تسمية كل منهم وتصورها بعد ذلك كشرائط منفصلة.

وضع العلامات والتصور لمنتجات التعبير الجينوم الميتوكوندريا في خميرة بيكر Saccharomyces cerevisiae

يقدم هذا البروتوكول تقنية لرسم خرائط عالية الدقة لمواقع النسخ المتماثل في الكروماتين المحفوظ هيكليا في الموقع والذي يستخدم مزيجا من التضمين المسبق لوضع العلامات على EdU-streptavidin-Nanogold و ChromEMT.

تصوير المجالات التكرارية في الكروماتين المحفوظ بالبنية الفائقة بواسطة التصوير المقطعي الإلكتروني

يصف هذا البروتوكول تقنية لصق المجهر الإلكتروني القابل للاستنساخ للكشف عن البروتينات الموسومة بالميتالوثيونين في الخلايا باستخدام تقنية جديدة لتخليق الجسيمات النانوية الذهبية القائمة على آلية قمع النوى الذاتية.

التوليف المباشر لجسيمات الذهب النانوية المرئية EM في الخلايا لتحليل توطين البروتين مع البنية التحتية المحفوظة جيدا

اكتشف طريقة تصوير الحويصلات الغشائية في خميرة Saccharomyces cerevisiae باستخدام جسيمات الذهب النانوي الموجبة الشحنة. تتيح هذه التقنية دراسة التراكيب فوق الدقيقة للأغشية الخلوية بدقة عالية.

Nanogold وصفها نظام Endosomal خميرة التحليلات التركيبية

استكشف المزيد من الفيديوهات