حبة تجميع فحوصات لتوصيف المزعومين خلية التصاق جزيئات

الهدف العام من هذا الإجراء هو اختبار قدرة مجالات بروتين ecto على التوسط في الالتصاق المتماثل لتحقيق هذه البلازميدات التي تشفر اندماج جزء مجال ecto إلى منطقة FC من IgG البشري يتم نقلها إلى خلايا HEC 2 93. يتم التقاط بروتينات اندماج Odin FC المفرزة على حبات مغناطيسية مترافقة مع البروتين G ، وبعد الغسيل ، يسمح للحبات المطلية بالتفاعل في المحلول. ثم يتم تصوير الخرزات المطلية لتقييم مدى التجميع وأخيرا ، يتم قياسها كميا باستخدام تحليل بسيط للصور ، تكشف البيانات الناتجة عما إذا كان البروتين تحت الدراسة قادرا على التوسط في الالتصاق المثلي.

تتمثل المزايا الرئيسية لهذه التقنية على الطرق الحالية مثل فحوصات تجميع الخلايا في أنها سريعة وبسيطة وتختبر بشكل مباشر النشاط اللاصق للبروتين الذي اخترته. ستظهر هذه التقنية الدكتورة ميشيل إيمان ، عالمة بارزة في المختبر. ابدأ هذا الإجراء عن طريق تحضير الخلايا المستنبتة ل NCA هنا ECFC ، قبل يومين إلى ثلاثة أيام من التعدي.

استخدم 0.05٪ رحلات في EDTA لفصل خلايا HEC 2 93 عن أطباق الاستزراع. قم بإعداد طبقين 100 ملم لكل حالة. قسم الخلايا من واحد إلى خمسة ، ثم زرعها.

وسط نمو مكمل. احتضان الخلايا عند 37 درجة مئوية مع 5٪ ثاني أكسيد الكربون حتى تصل إلى 60 إلى 80٪. في يوم التعدي ، استخدم كاشفا مثل lipo لإدخال بلازميد يشفر اندماج FC.

بعد التعدي ، أعد الخلايا إلى الحاضنة لمدة 24 ساعة في اليوم التالي للتعدي Prewarm ، DMEM مع البكتيريا العقدية المكبوتة وبدون مصل بقري الجنين إلى 37 درجة مئوية. اشطف كل طبق مرتين ب 10 مل من الوسط الدافئ ، ثم أعد الأطباق إلى حاضنة 37 درجة مئوية لمدة ساعة واحدة بعد الحضانة ، واشطف أطباق المزرعة مرة أخرى ب 10 مل من DMEM بدون مصل بقري للجنين لمدة ثلاث غسلات ، ثم احتضان الخلايا المنقولة عند 37 درجة مئوية لمدة 48 ساعة أخرى قبل جمع الوسط. بعد أربعة أيام من التعداد، استخدم ماصة مصلية لجمع الوسط من كل زوج من أطباق الاستزراع ونقله إلى أنبوب مخروطي سعة 50 مل.

ثم قم بالطرد المركزي للوسط عند 500 جي ثانية كل خمس دقائق لتكوير الحطام الخلوي بعد الدوران ، وصب الوسط من كل أنبوب مخروطي سعة 50 مليلتر في حقنة سعة 30 مليلتر وقم بتصفيته من خلال حقنة 0.45 ميكرون. قم بالتصفية في مكثف الطرد المركزي. قم بتدوير مرشحات الطرد المركزي حتى يتم تقليل حجم وسط الاستزراع المركز إلى حوالي 500 ميكرولتر.

يستغرق هذا حوالي 15 دقيقة. كرر هذه العملية حتى تتم إضافة كل وسيط الثقافة وتركيزه. بعد ذلك ، في أنبوب طرد مركزي صغير سعة 1.5 مل لكل عينة عند 1.5 ميكرولتر من الخرز المغناطيسي للبروتين G إلى مليلتر واحد من مخزن مؤقت ملزم للبريد المثلج.

أصعب جانب في هذا الإجراء هو تجميع الخرز. لضمان النجاح ، تأكد من اتباع الإجراء بالضبط. شاهد الخرزات بسرعة ، ولكن ليس بقسوة شديدة.

لا ينبغي أبدا السماح لها بالجفاف على جانب الأنبوب أو البقاء على المغناطيس لفترة طويلة. ضع الأنبوب على مغناطيس وباستخدام ماصة ، قم بشفط المخزن المؤقت. ثم أضف على الفور وسط الثقافة المركز إلى الخرز المغناطيسي للبروتين G.

قم بتدوير الأنابيب عند أربع درجات مئوية لمدة ساعتين. ضع الأنابيب على مغناطيس وقم بإزالة الوسيط بسرعة. اغسل الخرزات مرتين باستخدام مليلتر واحد من المخزن المؤقت البارد المثلج ، ثم أعد تعليق الخرزات في 300 ميكرولتر من المخزن المؤقت الملزم.

قسم الخرزات المعلقة إلى أنبوبين مع 150 ميكرولتر في كل أنبوب. ثم أضف 1.5 ميكرولتر من كلوريد الكالسيوم أو EDTA لظروف الكالسيوم وعدم وجود الكالسيوم على التوالي. نقل 100 ميكرولتر من كل حالة إلى الاكتئاب.

حسنا ، انزلق باستخدام مجهر ضوئي مرسل. اجمع الصور من خمسة مجالات رؤية لكل تجربة في كل نقطة زمنية مطلوبة. استخدام الصورة J أو برنامج تحليل الصور المقارنة.

افتح إحدى مجموعات بيانات الصور الخمس في الصورة J في القائمة المنسدلة. في أعلى الشاشة، حدد ملف. ثم حدد استيراد ، ثم تسلسل الصور.

ابحث عن المجلد الذي يحتوي على ملفات الصور، ثم افتحها كحزمة صور. بعد ذلك في شريط القائمة المنسدلة ، انقر فوق الصورة ، ثم حدد خصائص. لفتح نافذة الخصائص هناك.

قم بتغيير وحدات الصورة إلى وحدات البكسل واضبط عرض البكسل وارتفاع البكسل على 1.0. انقر فوق الصورة مرة أخرى ، وحدد ضبط ثم عتبة لفتح نافذة العتبة واستخدم شريط التمرير لضبط عتبة الصورة. قم بتضمين وحدات البكسل التي تساهم في الخرز والاستبعاد والجسيمات الصغيرة.

قم بتطبيق الحد على جميع الصور في مكدس الصور. التالي في شريط القائمة المنسدلة أعلى الشاشة. انقر فوق تحليل.

ثم حدد تعيين القياسات لفتح مربع حوار القياس باستخدام خانات الاختيار تحديد المنطقة وموضع المكدس في الجزء العلوي من الشاشة. انقر فوق تحليل ، ثم حدد تحليل الجسيمات. سيؤدي ذلك إلى إنشاء قائمة بالجسيمات المحددة بما في ذلك حجمها والصورة التي تم تحديدها فيها.

كرر هذه العملية لكل تجربة وكل حالة تجريبية لتحديد القدرة اللاصقة المعتمدة على الكالسيوم لأسماك الزرد والكاديرين. تم نقل HEC 2 9 3 خلايا مع مجال NCAT herrin OD الذي تم دمجه في fc وبعد خلايا تجميع الخرزة المعتمدة على الكالسيوم تم تصويرها وتحليلها كما هو موضح في هذا الفيديو كما يتضح من هذه الصور. في حالة عدم وجود الكالسيوم ، تظهر الخرزات ميلا ضئيلا أو معدوما للتجميع ، ولا توجد زيادة في الحجم الكلي مع مرور الوقت في وجود الكالسيوم.

ومع ذلك ، تظهر الإيقاعات المطلية ب NCAT هنا و ECFC تجميعا قويا مع زيادة الحجم الكلي بمرور الوقت كمقياس شبه كمي للالتصاق. تم تحليل الصور الضوئية المرسلة من ثلاث تجارب لتحديد متوسط حجم الركام. كما يتضح من هذه المؤامرة ، تم تحديد تجميع الخرز المطلي ب ncoer ECFC في وجود الكالسيوم وفي غياب الكالسيوم على فترات 15 دقيقة.

على مدار ساعة ، تكشف هذه البيانات أن المجال الخارجي لأسماك الزرد ن كاديرين يتوسط الالتصاق المثلي المعتمد على الكالسيوم. بعد مشاهدة هذا الفيديو ، يجب أن يكون لديك فهم جيد لكيفية اختبار ما إذا كان الالتصاق خاصية كيميائية حيوية جوهرية للبروتين الذي يثير اهتمامك.