Name: حبة تجميع فحوصات لتوصيف المزعومين خلية التصاق جزيئات (فيديو) | JoVE Journal
Uploaded: 2014-10-17T13:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 15 s
Description: اكتشف طريقة سريعة لتوصيف خصائص التصاق جزيئات التصاق الخلايا باستخدام شظايا النطاق الخارجي. تُستخدم هذه التقنية الخرز المغناطيسي المُحمل بالبروتين لاختبار التصاق البروتينات المختارة مباشرةً.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

تم دعم هذا العمل من خلال جائزة NSF / ARRA (IOS 0920357) وجائزة من المعاهد الوطنية للصحة (5R21MH098463).

1. خلية إعداد (اليوم -2 إلى 0) <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> انقسام خلايا HEK293 1: 5 باستخدام 0.05٪ التربسين-EDTA الحل واحتضان وسائل الإعلام في النمو عند 37 درجة مئوية مع 5٪ CO 2 حتى 60-80٪ متموجة (2 - 3 أيام). لكل حالة، وخلايا الثقافة في 2 × 100 ملم الأطباق. </li></ol> 2. ترنسفكأيشن الخلية (يوم 1) <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> بالنقل خلايا HEK293 مع ترميز البلازميد FC-الانصهار باستخدام كاشف ترنسفكأيشن مثل Lipofectamine. كما يمكن استخدام طرق بديلة تؤدي إلى الكفاءة ترنسفكأيشن مماثلة. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> العودة الخلايا المصابة بالعدوى بالنقل إلى الحاضنة لمدة 24 ساعة. </li></ol> 3. خلية الانتشار (اليوم 2) <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> وسائط النمو سخن دون مصل بقري جنيني (-FBS) إلى 37 درجة مئوية. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> شطف الأطباق 2X مع 10 مل نمو وسائل الإعلام -FBS، والعودة الأطباق إلى الحاضنة 37 درجة مئوية لمدة 1 ساعة. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> شطف الأطباق الثقافات واحد المزيد من الوقت مع 10 مل نمو وسائل الإعلام -FBS، أي ما مجموعه 3 يغسل. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> Incuباتي الخلايا HEK293 transfected عند 37 درجة مئوية لمدة 48 ساعة أخرى دون FBS قبل جمع سائل الإعلام. </li></ol> 4. الخرزة تجميع (اليوم 4) <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> لجمع وسائل الاعلام من الأطباق الثقافة، ونقل وسائل الاعلام من كل زوج من الأطباق إلى 50 مل أنابيب مخروطية وتدور في 500 x ج لمدة 5 دقائق لتكوير الحطام الخلوي. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> فلتر وسائل الاعلام من 50 مل أنبوب مخروطي إلى تصفية الطرد المركزي باستخدام حقنة 30 مل و 0.45 ميكرون فلتر حقنة. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> تدور مرشحات الطرد المركزي في 4000 x ج و 4 درجات مئوية حتى حجم سائل الإعلام والثقافة المركزة حوالي 500 ميكرولتر (حوالي 15 دقيقة). كرر حتى تمت إضافة كافة وسائل الإعلام والثقافة، وتتركز. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> إضافة 1.5 ميكرولتر من بروتين G حبات مغناطيسية إلى 1 مل من الجليد الباردة الاحتياطي ملزم في أنبوب microcentrifuge 1.5 مل لكل عينة، ومكان على المغناطيس وإزالة العازلة. على الفور إضافة وسائل الإعلام الثقافة المركزة للبروتين G حبات المغناطيسي. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> تدوير أنابيب في 4 درجة مئوية لمدة 2 ساعة. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ررأنابيب الآس على المغناطيس وإزالة وسائل الإعلام. تغسل حبات بسرعة مرتين مع الجليد الباردة 1 مل الاحتياطي ملزم، وresuspend ثم الخرز في 300 ميكرولتر الاحتياطي ملزم. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> سبليت معلق حبات في 2 أنابيب، 150 ميكرولتر إلى كل أنبوب، ثم قم بإضافة 1.5 ميكرولتر من 200 مم CaCl 2 أو 200 ملي EDTA ل &quot;الكالسيوم&quot; والشروط &quot;لا الكالسيوم&quot;، على التوالي. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> نقل 100 ميكرولتر من كل حالة إلى الاكتئاب الشريحة بشكل جيد وجمع الميكروسكوب باستخدام مجهر الضوء المرسل (الشكل 2). جمع الصور من 5 حقول نظر لكل تجربة في كل نقطة زمنية المطلوب. </li></ol> تحليل البيانات 5. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> باستخدام يماغيج، أو يعادل برنامج تحليل الصور، وفتح واحدة من مجموعات البيانات باستخدام صورة خمس استيراد / صورة تسلسل ... من القائمة المنسدلة ملف. سيتم فتح هذه باعتبارها كومة الصورة. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> في الصور / ... خصائص مربع الحوار، تغيير طوحدات بركه إلى بكسل ووضع العرض بكسل والارتفاع إلى 1.0 بكسل. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> تحويل الصور إلى ثنائي باستخدام ضبط / عتبة ... الأمر في القائمة المنسدلة صورة. تعيين عتبة لتشمل بكسل التي تساهم في حبة الخرز أو المجاميع، ولكن تستبعد الخلفية والجسيمات الصغيرة. تنطبق على جميع الصور في المكدس. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> في مربع الحوار القياسات مجموعة، حدد المربعات منطقة والمكدس الموقع. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> تشغيل تحليل الجسيمات ... في تحليل القائمة المنسدلة. هذا سوف إنشاء قائمة من الجسيمات التي تم تحديدها، بما في ذلك حجمها (منطقة) والصورة التي تم تحديدها. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> كرر هذه العملية التي تجربة وحالة تجريبية. </li></ol>

<ol><li>Chen, X., Gumbiner, B. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Paraxial+protocadherin+mediates+cell+sorting+and+tissue+morphogenesis+by+regulating+C-cadherin+adhesion+activity%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Paraxial protocadherin mediates cell sorting and tissue morphogenesis by regulating C-cadherin adhesion activity.</a> J. Cell Biol. 174 (2), 301-313 (2006).</li>
<li>Grumet, M., Friedlander, D. R., Edelman, G. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Evidence+for+the+binding+of+Ng-CAM+to+laminin%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Adhes.+Commun%22%5BJournal%5D)">Evidence for the binding of Ng-CAM to laminin.</a> Cell Adhes. Commun. 1 (2), 177-190 (1993).</li>
<li>Hatta, K., Nose, A., Nagafuchi, A., Takeichi, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cloning+and+expression+of+cDNA+encoding+a+neural+calcium-dependent+cell+adhesion+molecule%3A+its+identity+in+the+cadherin+gene+family%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Cloning and expression of cDNA encoding a neural calcium-dependent cell adhesion molecule: its identity in the cadherin gene family.</a> J. Cell Biol. 106 (3), 873-881 (1988).</li>
<li>Hirano, S., Nose, A., Hatta, K., Kawakami, A., Takeichi, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Calcium-dependent+cell-cell+adhesion+molecules+%28cadherins%29%3A+subclass+specificities+and+possible+involvement+of+actin+bundles%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Calcium-dependent cell-cell adhesion molecules (cadherins): subclass specificities and possible involvement of actin bundles.</a> J. Cell Biol. 105 (6 Pt 1), 2501-2510 (1987).</li>
<li>Nose, A., Nagafuchi, A., Takeichi, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Expressed+recombinant+cadherins+mediate+cell+sorting+in+model+systems%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Expressed recombinant cadherins mediate cell sorting in model systems.</a> Cell. 54 (7), 993-1001 (1988).</li>
<li>Nose, A., Takeichi, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+novel+cadherin+cell+adhesion+molecule%3A+its+expression+patterns+associated+with+implantation+and+organogenesis+of+mouse+embryos%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">A novel cadherin cell adhesion molecule: its expression patterns associated with implantation and organogenesis of mouse embryos.</a> J. Cell Biol. 103 (6 Pt 2), 2649-2658 (1986).</li>
<li>Schreiner, D., Weiner, J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Combinatorial+homophilic+interaction+between+gamma-protocadherin+multimers+greatly+expands+the+molecular+diversity+of+cell+adhesion%5BTitle%5D)+AND+%22Proc.+Natl.+Acad.+Sci.+U.+S.+A%22%5BJournal%5D)">Combinatorial homophilic interaction between gamma-protocadherin multimers greatly expands the molecular diversity of cell adhesion.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 107 (33), 14893-14898 (2010).</li>
<li>Takeichi, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Functional+correlation+between+cell+adhesive+properties+and+some+cell+surface+proteins%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Functional correlation between cell adhesive properties and some cell surface proteins.</a> J. Cell Biol. 75, 464-474 (1977).</li>
<li>Sivasankar, S., Brieher, W., Lavrik, N., Gumbiner, B., Leckband, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Direct+molecular+force+measurements+of+multiple+adhesive+interactions+between+cadherin+ectodomains%5BTitle%5D)+AND+%22Proc.+Natl.+Acad.+Sci.+U.+S.+A%22%5BJournal%5D)">Direct molecular force measurements of multiple adhesive interactions between cadherin ectodomains.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 96 (21), 11820-11824 (1999).</li>
<li>Sivasankar, S., Gumbiner, B., Leckband, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Direct+measurements+of+multiple+adhesive+alignments+and+unbinding+trajectories+between+cadherin+extracellular+domains%5BTitle%5D)+AND+%22Biophys.+J%22%5BJournal%5D)">Direct measurements of multiple adhesive alignments and unbinding trajectories between cadherin extracellular domains.</a> Biophys. J. 80, 1758-1768 (2001).</li>
<li>Sivasankar, S., Zhang, Y., Nelson, W. J., Chu, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Characterizing+the+initial+encounter+complex+in+cadherin+adhesion%5BTitle%5D)+AND+%22Structure%22%5BJournal%5D)">Characterizing the initial encounter complex in cadherin adhesion.</a> Structure. 17 (8), 1075-1081 (2009).</li>
<li>Zhang, Y., Sivasankar, S., Nelson, W. J., Chu, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Resolving+cadherin+interactions+and+binding+cooperativity+at+the+single-molecule+level%5BTitle%5D)+AND+%22Proc.+Natl.+Acad.+Sci.+U.+S.+A%22%5BJournal%5D)">Resolving cadherin interactions and binding cooperativity at the single-molecule level.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 106 (1), 109-114 (2009).</li>
<li>Yasuda, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Activity-induced+protocadherin+arcadlin+regulates+dendritic+spine+number+by+triggering+N-cadherin+endocytosis+via+TAO2beta+and+p38+MAP+kinases%5BTitle%5D)+AND+%22Neuron%22%5BJournal%5D)">Activity-induced protocadherin arcadlin regulates dendritic spine number by triggering N-cadherin endocytosis via TAO2beta and p38 MAP kinases.</a> Neuron. 56 (3), 456-471 (2007).</li>
<li>Chappuis-Flament, S., Wong, E., Hicks, L. D., Kay, C. M., Gumbiner, B. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Multiple+cadherin+extracellular+repeats+mediate+homophilic+binding+and+adhesion%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Multiple cadherin extracellular repeats mediate homophilic binding and adhesion.</a> J. Cell Biol. 154 (1), 231-243 (2001).</li>
<li>Emond, M. R., Biswas, S., Blevins, C. J., Jontes, J. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+complex+of+Protocadherin-19+and+N-cadherin+mediates+a+novel+mechanism+of+cell+adhesion%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">A complex of Protocadherin-19 and N-cadherin mediates a novel mechanism of cell adhesion.</a> J. Cell Biol. 195 (7), 1115-1121 (2011).</li>
<li>Biswas, S., Emond, M. R., Jontes, J. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+clustered+protocadherins+Pcdhalpha+and+Pcdhgamma+form+a+heteromeric+complex+in+zebrafish%5BTitle%5D)+AND+%22Neuroscience%22%5BJournal%5D)">The clustered protocadherins Pcdhalpha and Pcdhgamma form a heteromeric complex in zebrafish.</a> Neuroscience. 219, 280-289 (2012).</li>
<li>Blevins, C. J., Emond, M. R., Biswas, S., Jontes, J. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Differential+expression%2C+alternative+splicing%2C+and+adhesive+properties+of+the+zebrafish+delta1-protocadherins%5BTitle%5D)+AND+%22Neuroscience%22%5BJournal%5D)">Differential expression, alternative splicing, and adhesive properties of the zebrafish delta1-protocadherins.</a> Neuroscience. 199, 523-534 (2011).</li>
<li>Morishita, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Structure+of+the+cadherin-related+neuronal+receptor%2Fprotocadherin-alpha+first+extracellular+cadherin+domain+reveals+diversity+across+cadherin+families%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Biol.+Chem%22%5BJournal%5D)">Structure of the cadherin-related neuronal receptor/protocadherin-alpha first extracellular cadherin domain reveals diversity across cadherin families.</a> J. Biol. Chem. 281, 33650-33663 (1074).</li>
<li>Wojtowicz, W. M., Flanagan, J. J., Millard, S. S., Zipursky, S. L., Clemens, J. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Alternative+splicing+of+Drosophila+Dscam+generates+axon+guidance+receptors+that+exhibit+isoform-specific+homophilic+binding%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Alternative splicing of Drosophila Dscam generates axon guidance receptors that exhibit isoform-specific homophilic binding.</a> Cell. 118 (5), 619-633 (2004).</li>
<li>Drees, F., Reilein, A., Nelson, W. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cell-adhesion+assays%3A+fabrication+of+an+E-cadherin+substratum+and+isolation+of+lateral+and+Basal+membrane+patches%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+Mol.+Biol%22%5BJournal%5D)">Cell-adhesion assays: fabrication of an E-cadherin substratum and isolation of lateral and Basal membrane patches.</a> Methods Mol. Biol. 294, 303-320 (2005).</li>
</ol>

يعلن المؤلفون أنه ليس لديهم مصالح مالية متنافسة.

التصاق الخلية هو سمة أساسية من سمات الحياة متعددة الخلايا وبوساطة مجموعة واسعة من بروتينات سطح الخلية. من هذه، وفهم الخصائص التفصيلية لاصقة سوى نسبة صغيرة نسبيا. هنا، التي وصفناها بروتوكول بسيطة وسريعة للتحقيق في قدرة لاصقة مقتصر على المطابق من ectodomains يفرز تنصهر علامة حاتمة مريحة. هذا النهج لديه عدد من المزايا الهامة. أولا، وخطوط الخلايا مستقرة غير مطلوب 14،20، كما يمكن توليد كميات كافية من البروتين عن طريق ترنسفكأيشن عابرة من 100 ملم الأطباق. وهذا يسمح للفحص أعداد...

التصاق خلية خلية ضروري لتطوير وسلامة الكائنات متعددة الخلايا وبوساطة مجموعة متنوعة من جزيئات سطح الخلية. وقد تم تحديد العديد من هذه جزيئات الالتصاق ويتميز، رغم أن الكثيرين لا يزال يتعين اكتشافها. وتستخدم عدة طرق لتحقيق خصائص خلية التصاق جزيئات (الحدب)، بما في ذلك الخلايا فرز فحوصات، فحوصات تجميع خلية 1-8 والأساليب الفيزيائية الحيوية، مثل مجهر القوة الذرية والسطحية قوة التحليل الطيفي 9-12. تعقيد حتى مبسطة في أنظمة المختبر باستخدام خطوط الخلايا يجعل من الصعب تحديد خصائص لاصقة من المفترض CAM. عادة، يعتبر جزيء وCAM إذا كان يدفع تجميع الخلايا عندما transfected في خط خلية غير لاصقة. ومع ذلك، فمن الواضح أن هذا ليس دليل مباشر على النشاط اصقة. على سبيل المثال، وتسهيل إيصال سطح الخلية أو استقرارسوف CAM يؤدي أيضا إلى زيادة تجميع خلية 1،13. وعلاوة على ذلك، قد تفشل CAM صحيح للتوسط تجميع خلية إذا كان خط الخلية تفتقر العوامل المشتركة الأخرى المطلوبة للتسليم سطح الخلية أو الاستقرار. لتجنب هذه العوامل المعقدة، والمزيد من المقايسات المباشرة يمكن استخدامها التي تستند على فكرة أن التفاعلات لاصقة يجب أن تكون خاصية البيوكيميائية الجوهرية المجال خارج الخلية. بينما الخرز المستخدمة في البداية لوصف NG-CAM 2، وقد تم تمديد هذه المقايسات من أجل التحقيق بوساطة كادهيرين التصاق 12،14،15. باستخدام الانصهار من C-كادهيرين اندماج ectodomain-FC، أظهر مختبر Gumbiner أن يكرر كادهيرين متعددة تساهم في التفاعلات مقتصر على المطابق 14. عن طريق مقارنة المقايسات حبة التجميع، E-كادهيرين وN-كادهيرين التصاق كما تم يتميز 12،15، وكذلك عدد من protocadherins 1،15-18 والإسوية Dscam من ذبابة الفاكهة <em&gt; 19. نحن هنا وصف مقايسة بسيطة نسبيا وسريع لوصف النشاط لاصقة من يفرز، ectodomains الموسومة حاتمة من الحدب مقتصر على المطابق المفترضة (الشكل 1). وقد استخدمنا هذا الاختبار في المقام الأول إلى تميز أعضاء الفصيلة كادهيرين.

<table><tbody><tr><td>pFc-N1 البلازميد</td><td>Addgene</td> <td><قوي>سيتم تقديمه</td>HEK293 <td></td></tr><tr><td>خلايا</td><td>مجموعة الثقافة من النوع الأمريكي</td><td>CRL-1573</td><td></td></tr><tr><td>DMEM</td><td>Mediatech - Corning</td><td>10-013-CV</td><td></td></tr><tr><td>مصل الأبقار الجنينية (FBS)</td><td>Sigma</td><td>F2442</td><td></td></tr><tr><td>100x Pen-Strep (10,000 U / ml)</td>Life <td>Technologies</td><td>15140-122</td><td></td></tr><tr><td>0.05٪ Trypsin-EDTA</td><td>Life Technologies</td><td>25300054</td><td></td></tr><tr><td>Lipofectamine 2000</td><td>Life Technologies</td><td>11668030</td><td></td></tr><tr><td>Dynabeads & ndash ؛ بروتين G</td><td>Life Technologies</td><td>10003D</td><td></td></tr><tr><td>مصل الأبقار الألبومين</td><td>Sigma</td><td>A3294</td><td></td></tr><tr><td>شرائح الاكتئاب</td><td>علوم المجهر الإلكتروني</td><td>71878-06</td><td></td></tr><tr><td>Amicon Ultra-15 وحدة تصفية الطرد المركزي مع غشاء Ultracel-10</td><td>Millipore</td><td>UFC901024</td><td></td></tr><tr><td>0.45 مم مرشح حقنة</td><td>Sarstedt</td><td>83.1826</td><td></td></tr><tr><td>برنامج تحليل الصور Dynamag-2 Magnet</td><td>Life Technologies</td><td>12321D</td><td></td></tr><tr><td>Fiji (ImageJ</td><td>) <a href = "http://fiji.sc/Fiji" >http://fiji.sc/Fiji< / a ></td><td></td><td></td></tr><tr> < td colspan = "4" > جدول المخازن المؤقتة / الحلول</td></tr><tr><td>وسائط</td><td>النمو DMEM + 10٪ FBS + مرشح Pen-Strep</td><td>تعقيم وتخزينه عند 4 درجات مئوية.</td><td></td></tr><tr><td>وسائل الإعلام النمو &ndash; FBS</td><td>DMEM + Pen-Strep</td><td>Filter يعقيم ويخزن في درجة حرارة 4 درجات مئوية.</td><td></td></tr><tr><td>مخزن مؤقت ملزم</td><td>50 ملي مولار تريس ، درجة الحموضة 7.4 ، 100 ملي كلوريد الصوديوم ، 10 ملي كلوريد الصوديوم ، 0.2٪ BSA</td><td>دوامة حتى يذوب ، استمر في الثلج.</td><td></td></tr></tbody></table>

حبة تجميع فحوصات لتوصيف المزعومين خلية التصاق جزيئات

Bead Aggregation Assays for the Characterization of Putative Cell Adhesion Molecules

التصاق خلية خلية هو الأساسي في الحياة متعددة الخلايا وبوساطة مجموعة متنوعة من بروتينات سطح الخلية. ومع ذلك، يتم مفهومة التفاعلات لاصقة لكثير من هذه البروتينات. هنا نقدم طريقة بسيطة وسريعة لوصف خصائص لاصقة من المفترضة مقتصر على المطابق جزيئات التصاق الخلية. و transfected خلايا HEK293 مثقف مع بلازميد الحمض النووي ترميز يفرز،، حاتمة الموسومة ectodomain من بروتين سطح الخلية. باستخدام الخرز بين functionalized محددة للعلامة حاتمة، يتم التقاط القابلة للذوبان، انصهار بروتين يفرز من مستنبت. ويمكن بعد ذلك حبات المغلفة استخدامها مباشرة في حبة المقايسات التجميع أو في حبة الفلورسنت فرز فحوصات لاختبار التصاق مقتصر على المطابق. إذا رغبت، الطفرات يمكن بعد ذلك أن تستخدم لتوضيح الأحماض الأمينية المحددة أو المجالات المطلوبة للالتصاق. هذا الاختبار يتطلب سوى كميات صغيرة من البروتين المعبر عنها، لا يتطلب إنتاج خطوط الخلايا مستقرة، ويمكن عكاmplished في 4 أيام.

وتقدم تجربة سبيل المثال في الشكل 2، مما يدل تعتمد على الكالسيوم حبة تجميع من قبل ectodomain من N-كادهيرين تنصهر لجنة التيسير (NcadEC-FC). في غياب الكالسيوم، والخرز تظهر نزعة ضئيلة أو معدومة لتجميع وليس هناك زيادة في الحجم الكلي مع الزمن (الشكل 1A، C). في وجود الكالسيوم، وحبات مغلفة مع عرض NcadEC-FC تجميع قوية، مع الحجم الكلي يتزايد مع مرور الوقت (الشكل 1B، C). وتكررت هذه التجربة ثلاث مرات، مع كل حالة تتكون من الصور من خمسة حقول غي...

نقدم هنا طريقة بسيطة وسريعة لتوصيف الخصائص اللاصقة الجوهرية لجزيئات التصاق الخلية المفترضة. يتم التقاط المجال الخارجي المفرز الذي يحمل علامة حاتمة لجزيء التصاق الخلية من وسط الاستزراع على حبات وظيفية صغيرة موحدة. يمكن بعد ذلك استخدام هذه الخرزات على الفور في فحوصات تجميع الخرزات البسيطة.

Cell-cell adhesion is fundamental to multicellular life and is mediated by a diverse array of cell surface proteins. However, the adhesive interactions ...

الهدف العام من هذا الإجراء هو اختبار قدرة مجالات بروتين ecto على التوسط في الالتصاق المتماثل لتحقيق هذه البلازميدات التي تشفر اندماج جزء مجال ecto إلى منطقة FC من IgG البشري يتم نقلها إلى خلايا HEC 2 93. يتم التقاط بروتينات اندماج Odin FC المفرزة على حبات مغناطيسية مترافقة مع البروتين G ، وبعد الغسيل ، يسمح للحبات المطلية بالتفاعل في المحلول. ثم يتم تصوير الخرزات المطلية لتقييم مدى التجميع وأخيرا ، يتم قياسها كميا باستخدام تحليل بسيط للصور ، تكشف البيانات الناتجة عما إذا كان البروتين تحت الدراسة قادرا على التوسط في الالتصاق المثلي.تتمثل المزايا الرئيسية لهذه التقنية على الطرق الحالية مثل فحوصات تجميع الخلايا في أنها سريعة وبسيطة وتختبر بشكل مباشر النشاط اللاصق للبروتين الذي اخترته. ستظهر هذه التقنية الدكتورة ميشيل إيمان ، عالمة بارزة في المختبر. ابدأ هذا الإجراء عن طريق تحضير الخلايا المستنبتة ل NCA هنا ECFC ، قبل يومين إلى ثلاثة أيام من التعدي.استخدم 0.05٪ رحلات في EDTA لفصل خلايا HEC 2 93 عن أطباق الاستزراع. قم بإعداد طبقين 100 ملم لكل حالة. قسم الخلايا من واحد إلى خمسة ، ثم زرعها.وسط نمو مكمل. احتضان الخلايا عند 37 درجة مئوية مع 5٪ ثاني أكسيد الكربون حتى تصل إلى 60 إلى 80٪. في يوم التعدي ، استخدم كاشفا مثل lipo لإدخال بلازميد يشفر اندماج FC.بعد التعدي ، أعد الخلايا إلى الحاضنة لمدة 24 ساعة في اليوم التالي للتعدي Prewarm ، DMEM مع البكتيريا العقدية المكبوتة وبدون مصل بقري الجنين إلى 37 درجة مئوية. اشطف كل طبق مرتين ب 10 مل من الوسط الدافئ ، ثم أعد الأطباق إلى حاضنة 37 درجة مئوية لمدة ساعة واحدة بعد الحضانة ، واشطف أطباق المزرعة مرة أخرى ب 10 مل من DMEM بدون مصل بقري للجنين لمدة ثلاث غسلات ، ثم احتضان الخلايا المنقولة عند 37 درجة مئوية لمدة 48 ساعة أخرى قبل جمع الوسط. بعد أربعة أيام من التعداد، استخدم ماصة مصلية لجمع الوسط من كل زوج من أطباق الاستزراع ونقله إلى أنبوب مخروطي سعة 50 مل.ثم قم بالطرد المركزي للوسط عند 500 جي ثانية كل خمس دقائق لتكوير الحطام الخلوي بعد الدوران ، وصب الوسط من كل أنبوب مخروطي سعة 50 مليلتر في حقنة سعة 30 مليلتر وقم بتصفيته من خلال حقنة 0.45 ميكرون. قم بالتصفية في مكثف الطرد المركزي. قم بتدوير مرشحات الطرد المركزي حتى يتم تقليل حجم وسط الاستزراع المركز إلى حوالي 500 ميكرولتر.يستغرق هذا حوالي 15 دقيقة. كرر هذه العملية حتى تتم إضافة كل وسيط الثقافة وتركيزه. بعد ذلك ، في أنبوب طرد مركزي صغير سعة 1.5 مل لكل عينة عند 1.5 ميكرولتر من الخرز المغناطيسي للبروتين G إلى مليلتر واحد من مخزن مؤقت ملزم للبريد المثلج.أصعب جانب في هذا الإجراء هو تجميع الخرز. لضمان النجاح ، تأكد من اتباع الإجراء بالضبط. شاهد الخرزات بسرعة ، ولكن ليس بقسوة شديدة.لا ينبغي أبدا السماح لها بالجفاف على جانب الأنبوب أو البقاء على المغناطيس لفترة طويلة. ضع الأنبوب على مغناطيس وباستخدام ماصة ، قم بشفط المخزن المؤقت. ثم أضف على الفور وسط الثقافة المركز إلى الخرز المغناطيسي للبروتين G.قم بتدوير الأنابيب عند أربع درجات مئوية لمدة ساعتين. ضع الأنابيب على مغناطيس وقم بإزالة الوسيط بسرعة. اغسل الخرزات مرتين باستخدام مليلتر واحد من المخزن المؤقت البارد المثلج ، ثم أعد تعليق الخرزات في 300 ميكرولتر من المخزن المؤقت الملزم.قسم الخرزات المعلقة إلى أنبوبين مع 150 ميكرولتر في كل أنبوب. ثم أضف 1.5 ميكرولتر من كلوريد الكالسيوم أو EDTA لظروف الكالسيوم وعدم وجود الكالسيوم على التوالي. نقل 100 ميكرولتر من كل حالة إلى الاكتئاب.حسنا ، انزلق باستخدام مجهر ضوئي مرسل. اجمع الصور من خمسة مجالات رؤية لكل تجربة في كل نقطة زمنية مطلوبة. استخدام الصورة J أو برنامج تحليل الصور المقارنة.افتح إحدى مجموعات بيانات الصور الخمس في الصورة J في القائمة المنسدلة. في أعلى الشاشة، حدد ملف. ثم حدد استيراد ، ثم تسلسل الصور.ابحث عن المجلد الذي يحتوي على ملفات الصور، ثم افتحها كحزمة صور. بعد ذلك في شريط القائمة المنسدلة ، انقر فوق الصورة ، ثم حدد خصائص. لفتح نافذة الخصائص هناك.قم بتغيير وحدات الصورة إلى وحدات البكسل واضبط عرض البكسل وارتفاع البكسل على 1.0. انقر فوق الصورة مرة أخرى ، وحدد ضبط ثم عتبة لفتح نافذة العتبة واستخدم شريط التمرير لضبط عتبة الصورة. قم بتضمين وحدات البكسل التي تساهم في الخرز والاستبعاد والجسيمات الصغيرة.قم بتطبيق الحد على جميع الصور في مكدس الصور. التالي في شريط القائمة المنسدلة أعلى الشاشة. انقر فوق تحليل.ثم حدد تعيين القياسات لفتح مربع حوار القياس باستخدام خانات الاختيار تحديد المنطقة وموضع المكدس في الجزء العلوي من الشاشة. انقر فوق تحليل ، ثم حدد تحليل الجسيمات. سيؤدي ذلك إلى إنشاء قائمة بالجسيمات المحددة بما في ذلك حجمها والصورة التي تم تحديدها فيها.كرر هذه العملية لكل تجربة وكل حالة تجريبية لتحديد القدرة اللاصقة المعتمدة على الكالسيوم لأسماك الزرد والكاديرين. تم نقل HEC 2 9 3 خلايا مع مجال NCAT herrin OD الذي تم دمجه في fc وبعد خلايا تجميع الخرزة المعتمدة على الكالسيوم تم تصويرها وتحليلها كما هو موضح في هذا الفيديو كما يتضح من هذه الصور. في حالة عدم وجود الكالسيوم ، تظهر الخرزات ميلا ضئيلا أو معدوما للتجميع ، ولا توجد زيادة في الحجم الكلي مع مرور الوقت في وجود الكالسيوم.ومع ذلك ، تظهر الإيقاعات المطلية ب NCAT هنا و ECFC تجميعا قويا مع زيادة الحجم الكلي بمرور الوقت كمقياس شبه كمي للالتصاق. تم تحليل الصور الضوئية المرسلة من ثلاث تجارب لتحديد متوسط حجم الركام. كما يتضح من هذه المؤامرة ، تم تحديد تجميع الخرز المطلي ب ncoer ECFC في وجود الكالسيوم وفي غياب الكالسيوم على فترات 15 دقيقة.على مدار ساعة ، تكشف هذه البيانات أن المجال الخارجي لأسماك الزرد ن كاديرين يتوسط الالتصاق المثلي المعتمد على الكالسيوم. بعد مشاهدة هذا الفيديو ، يجب أن يكون لديك فهم جيد لكيفية اختبار ما إذا كان الالتصاق خاصية كيميائية حيوية جوهرية للبروتين الذي يثير اهتمامك.

bead-aggregation-assays-for-characterization-putative-cell-adhesion

Research

JoVE Journal

Bioengineering

الهندسة الحيوية

يوصف لفحص لقياس التردد التصاق حركية التفاعل مستقبلات يجند عندما ترسو على حد سواء الجزيئات على أسطح الخلايا المتفاعلة. ويتمثل هذا الاختبار القائم على ميكانيكيا باستخدام micropipette مضغوطة الإنسان خلايا الدم الحمراء وأجهزة الاستشعار والتصاق αLβ2 إنتغرين وبين الخلايا جزيء التصاق - 1 والتفاعل ومستقبلات يغاندس.

التصاق الفحص عن التردد في الموقع تحليل حركية عبر صلي التفاعلات الجزيئية في خلية واجهة سيل

في هذا الفيديو ، نوضح تقنية قياس التفاعلات عبر الخلايا بين جزيئات التصاق الخلايا المشبكية من خلال مقايسة تجميع خلايا HEK. في هذا الفحص ، يتم خلط عدد متساو من خلايا HEK التي تعبر عن جزيء التصاق الخلية قبل المشبكي المطلوب وبروتين الفلورسنت مع خلايا HEK التي تعبر عن جزيء التصاق الخلية بعد التشابك وبروتين فلوري آخر. يجبر التفاعل بين جزيئات التصاق الخلية الخلايا على التجمع ، والتي يمكن قياسها عن طريق المجهر الفلوري.

مقايسة تجميع الخلايا للكشف عن التفاعلات العابرة بين جزيئات التصاق الخلايا

نبلغ عن طريقة في المختبر تسمح بتحديد العدد الفعلي للخلايا اللاصقة داخل طبقة أحادية للخلية البطانية.

الكميات من البطانية الإلتصاق الخليوي<em&gt; في المختبر</em

يعد الارتباط البكتيري بالخلايا المضيفة خطوة أساسية أثناء استعمار المضيف والعدوى. يصف هذا البروتوكول توليد اللاصقات المؤتلفة المقترنة بالبوليمر كمواد محاكاة حيوية تسمح بتحليل مساهمة اللاصقات الفردية في هذه العمليات ، بغض النظر عن العوامل البكتيرية الأخرى.

المواد الجزيئية الحيوية لوصف التفاعلات البكتيريا في استضافة

يوفر هذا الاختبار تدفق التصاق بسيط، نموذج تأثير ارتفاع تي التفاعلات خلية الخلايا الظهارية. ويستخدم ضخ حقنة لتوليد إجهاد القص، ومتحد البؤر المجهر يلتقط الصور لتقدير. والهدف من هذه الدراسات هو تحديد فعالية الخلايا التائية التصاق باستخدام ظروف التدفق.

فحص من التصاق تحت إجهاد القص لدراسة تي اللمفاويات-التصاق جزيء التفاعلات

التصاقات سطح الخلية هي المركزية في mechanotransduction، كما نقل التوتر الميكانيكية والشروع في مسارات الإشارات المشاركة في توازن الأنسجة والتنمية. هنا، نقدم بروتوكول لتشريح المسارات البيوكيميائية التي يتم تفعيلها في فعل للتوتر، وذلك باستخدام ميكروبيدات المغناطيسي المغلفة يجند وتطبيق قوة لمستقبلات الالتصاق.

تحليل الخلايا السطحية التصاق إعادة عرض في الاستجابة للتوتر الميكانيكية باستخدام الخرز المغناطيسي

وتوضح هذه الدراسة فائدة وسهولة قياس تمديد الكمية غشاء الخلية وارتباطها بقدرة التصاق الخلايا. وكمثال ممثل، نعرض هنا أن البروتين المتصلة ديككوبف 3 (DKK3) ويشجع تشكيل لوبوبوديا زيادة وخلية أدهيسيفينيس في سرطان البطاني الخلايا في المختبر.

وصف ملحقات غشاء الخلية ودراسة أدوارهم في ديناميات التصاق خلايا السرطان

التصاق دينامية للخلايا المناعية لجدار الوعاء شرطا لصاروخ موجه القناة الهضمية. نقدم هنا، بروتوكولا مقايسة وظيفية في المختبر لتحليل تأثير الأجسام المضادة-إنتغرين أو المستقطبات أو غيرها من العوامل على التصاق الخلية الحيوية للخلايا البشرية باستخدام الشعيرات الدموية المغلفة أدريسين.

والرزن التصاق الديناميكي للتحليل الوظيفي من العلاجات المضادة الالتصاق في مرض التهاب الأمعاء

هنا، نقدم بروتوكول الأمثل لقياس بسرعة وشبه متزامنة التفاعلات مستقبلات رابطة في trans في نظام خلية غير متغايرة باستخدام المجهر الفلورية.

قياس التفاعلات عبر الخلية من خلال تجميع البروتين في نظام الخلايا heterologous

ويصف المقال كم من 1) حجم وعدد من الالتصاقات البؤري و 2) مؤشر شكل الخلية وتوزيعها من الصور confocal من monolayers التقاء من الخلايا MCF7.

القياس الكمي لمنطقة التصاق الخلايا الركازة وتوزيعات شكل الخلية في الطبقات الأحادية الخلية MCF7

يقدم هذا البروتوكول الإجراءات التجريبية لإجراء فحص بصمة الالتصاق لتصوير أحداث التصاق أثناء التصاق سريع بالخلايا.

التصوير الالتصاق الجزيئي في الخلية المتداول بواسطة Adhesion بصمة المقايسة

اكتشف طريقة سريعة لتوصيف خصائص التصاق جزيئات التصاق الخلايا باستخدام شظايا النطاق الخارجي. تُستخدم هذه التقنية الخرز المغناطيسي المُحمل بالبروتين لاختبار التصاق البروتينات المختارة مباشرةً.

حبة تجميع فحوصات لتوصيف المزعومين خلية التصاق جزيئات

استكشف المزيد من الفيديوهات