الجمع بين الفرز المغناطيسي للخلايا الأم والاختبارات تذبذب لتحليل الجينوم عدم الاستقرار خلال الإنقسامية شيخوخة الخلايا في خميرة الخباز

الهدف العام للتجربة التالية هو تحديد ما إذا كانت التغييرات في ترددات الطفرات مع زيادة التكرار. يرجع عمر خلايا الخميرة ببساطة إلى جولات إضافية من انقسام الخلايا أو إلى التغيرات الخاصة بالعمر في معدلات تراكم الطفرات. يتم تحقيق ذلك عن طريق قياس ترددات الطفرات ومعدلاتها أولا في الخلايا الشابة عن طريق نشر الخلايا على وسائط انتقائية وغير انتقائية لحساب تكرار الطفرات المتوقع للخلايا ذات الأعمار المتزايدة بسبب تراكم الطفرات مع كل جولة من انقسام الخلايا.

بعد ذلك ، يتم تصنيف مجموعة خلايا الخميرة بالبيوتين المزروع في المزرعة السائلة ويتم استرداد الخلايا الأصلية المسماة عن طريق الفرز المغناطيسي للحصول على الخلايا الأم القديمة التي خضعت لعدة انقسامات خلايا. ثم يتم إعادة نمو الخلايا الأم المسنة لزيادة عمرها ثم فرزها مرة أخرى أو تلطيخها بحثا عن ندبات المؤخرة ، ثم تنتشر على وسائط انتقائية وغير انتقائية من أجل تحديد متوسط عمرها التكاثري ويتم الحصول على نتائج تكرار الطفرات التي توضح ما إذا كانت هناك أي زيادات أو انخفاضات خاصة بالعمر في تراكم الطفرات بناء على مقارنة تواتر الطفرات المرصودة تجريبيا بتردد الطفرة المتوقع لخلايا متوسط العمر المرصود. يمكن أن تساعد هذه الطريقة في الإجابة على الأسئلة الرئيسية في مجال الشيخوخة ، مثل هل تساهم التغييرات في معدلات تراكم الضرر الجيني في الشيخوخة الطبيعية ، أو هل تغير العمر التأثيرات لعوامل وراثية وبيئية مختلفة ، ويرجع ذلك جزئيا إلى التغيرات في معدلات الطفرات.

سيتم توضيح الإجراء ميليسا باترسون ، طالبة الدراسات العليا في مختبري ، لتحديد معدل طفرة أساسي لكل جيل خلية باستخدام اختبارات التذبذب للخلايا المزروعة في ظل ظروف الثقافة القياسية. لكل مزرعة مكررة ، قم بتخفيف الخلايا من واحد إلى 2000 ونشر من واحد إلى أربعة ميكرولتر على وسط غير انتقائي لتحديد وحدات تشكيل المستعمرة لكل مليلتر. قم بتكسير الخلايا المتبقية عند 2 ، 400 Gs لمدة دقيقة واحدة في جهاز طرد مركزي صغير واستخدم 100 ميكرولتر من الماء لإعادة تعليقها قبل الانتشار على وسط انتقائي لتحديد الطفر.

بعد احتضان الصفائح عند 30 درجة مئوية لمدة ثلاثة أيام ، عد المستعمرات وحدد معدل الطفرات الأولية والتردد وفقا لبروتوكول النص المصاحب لتسمية Charmy CCI بالبيوتين ابدأ بخطوط المزرعة من مخزون الجلسرين إلى وسط YPD واحتضانها عند 30 درجة مئوية لمدة يوم إلى ثلاثة أيام. باستخدام طرف ماصة معقمة ، انقل الخلايا من اللوحة إلى مليلتر واحد على الأقل من الماء. مع الأخذ في الاعتبار أن سنتيمترا إلى سنتيمترا ونصف من جزء كثيف النمو من الخط سيعطي ما يقرب من 10 للخلايا الثمانية.

استخدم مقياس الخلوي الدموي لتحديد كثافة الخلايا الدقيقة لكل سلالة أو حالة علاجية. استخدم مخزونا من كاشف البيوتين بخمسة مللي مولار لتسمية 10 إلى ثماني خلايا لكل نقطة تجميع وفقا للإجراء القياسي للشركة المصنعة. قم بتنفيذ جميع خطوات الطرد المركزي لمدة خمس دقائق عند أربع درجات مئوية بعد الغسيل النهائي.

استخدم الماء لتعليق الخلايا المسماة إلى تركيز نهائي من 10 إلى ثماني خلايا لكل مليلتر للتحقق من صلاحية الخلية لتخفيف 10 ميكرولتر من الخلايا مع 23 ميكرولتر من الماء و 67 ميكرولترا من 0.4٪ Triam blue في واحد XPBS يحتضن الخلايا لمدة 40 دقيقة في درجة حرارة الغرفة قبل استخدام مقياس الخلوي الدموي لتسجيل الخلايا الحية أو غير الملوثة والميتة أو الملطخة. بعد قياس قيم خط الأساس لعمر الخلية وتكرار الطفرة ، وفقا لبروتوكول النص ، قم بنقل الخلايا المسماة بالبيوتين إلى 20 مل من وسط YPD. تظاهر بالخلايا الثمانية.

قم بزراعة الثقافات لمدة 16 إلى 18 ساعة عند 20 درجة مئوية إلى حوالي 10 إلى ثماني خلايا لكل مليلتر. لا تسمح للخلايا بالوصول إلى المرحلة الثابتة وإذا لزم الأمر ، احتفظ بالخلايا عند أربع درجات مئوية لعدة ساعات لتحسين توقيت فترة النمو والتجميع. بعد تحديد كثافة الخلية وتكوير الخلايا عند أربع درجات مئوية ، اغسل الخلايا بإضافة 30 مل من ملصقات الخرز ، والمخزن المؤقت والدوامة ، ثم قم بتدوير التعليق وسكب المادة الطافية.

بعد الغسيل الثاني ، نعلق الخلايا في 50 ميكرولترا من المخزن المؤقت لوضع العلامات على الخرز. تظاهر بالخلايا الثمانية الإجمالية عن طريق الدوامة. أضف ميكرولترين من الخرز المغناطيسي ، وتظاهر بالخلايا الثمانية الإجمالية وبعد الدوامة ، احتضن لفترة وجيزة على الجليد لمدة 10 دقائق مع قلبها بشكل دوري.

بعد ذلك ، استخدم 30 مل من مخزن ملصقات الخرز لغسل الخلايا ثلاث مرات. ثم أضف 0.5 مل من المخزن المؤقت لوضع العلامات على الخرز. تظاهر بالخلايا الثمانية الإجمالية وقم بتدوير الحبيبات لفترة وجيزة على إعداد متوسط حتى يتم إعادة تعليق الخلايا.

صب المعلق من خلال مصفاة خلية 40 ميكرون في أنبوب سعة 50 مليلتر لإزالة أي كتل خلوية متبقية. إذا لزم الأمر ، اترك الخلايا على الجليد لمدة ساعة إلى ساعتين قبل التحميل على العمود. اتبع البروتوكول الموصى به من قبل الشركة المصنعة للأعمدة المغناطيسية باستخدام ما يصل إلى اثنين في 10 إلى إجمالي الخلايا التسع لكل منهما.

احرص على إزالة أي شيء قابل للبث عند تحميل الأعمدة وإزالة واستبدال العمود الموجود على الفاصل بين الغسالات لمنع الخلايا من الوقوع بين الخرز. عند استخدام فواصل متعددة الأعمدة لمعالجة أعمدة متعددة من نفس العينة ، قم بإزالتها جميعا في نفس أنبوب التجميع لتقليل وقت المناولة وتقليل فقدان الخلايا إذا رغبت في ذلك. احفظ التدفق من خطوات الربط والغسيل لتحليل الخلايا الصغيرة التي تنتجها الخلايا الأم بعد تركيز الخلايا عن طريق الطرد المركزي عند 3000 جي ثانية لمدة خمس دقائق عند أربع درجات مئوية ، واستنشق كل ما عدا مليلتر واحد من المخزن المؤقت.

تظاهر بالخلايا الثمانية الأصلية المسماة بالبيوتين. ثم الدوامة لفترة وجيزة لتعليق الخلايا في المخزن المؤقت المتبقي. استخدم اللون الأزرق لتلطيخ جزء من الخلايا المخففة واستخدم مقياس الخلوي الدموي لتحديد كثافة الخلايا وقابليتها للحياة.

ثم احسب العدد الإجمالي للخلايا المستردة. إذا كان عدد الخلايا أعلى بكثير من المتوقع ، فقم بتمرير عينة الشطف عبر عمود آخر لمحاولة إزالة الخلايا الصغيرة الملوثة. إذا كان عدد الخلايا أقل بكثير من المتوقع، فقم بتمرير التدفق المحفوظ.

عينة من خلال عمود آخر لمحاولة تحسين إنتاجية الخلايا الأم إذا رغبت في ذلك. أعد نمو الخلايا لزيادة عمر التكاثر واتباع وضع العلامات على الخرزة وفرزها دون وضع العلامات على البيوتين. لتحديد العمر التكاثري ، انقل 25 ميكرولترا من الخلايا المستردة إلى أنبوب طرد مركزي سعة 1.5 مليلتر واستخدم مليلتر واحد من XPBS لغسل الخلايا مرتين لتسمية ندبات البراعم على سطح الخلايا.

استخدم 180 ميكرولترا من XPBS واحد و 20 ميكرولترا من WGA المترافق بالفلورسنت لإعادة تعليق الخلايا ، وتغطية أنبوب الطرد المركزي سعة 1.5 مليلتر بورق الألمنيوم واحتضانها بهزاز لطيف عند 30 درجة مئوية لمدة 30 دقيقة بعد الحضانة. استخدم XPBS لغسل الخلايا ثلاث مرات. ثم بالنسبة للفحص المجهري الفلوري ، استخدم كاشف أنتيفا لتركيب الخلايا على الشرائح لتجنب حركة الخلية أثناء التصوير.

عالج الشرائح بالكامل في الظلام لمدة تصل إلى بضعة أيام. عد ندبات البراعم على ما لا يقل عن 50 خلية لكل عينة للحصول على مقياس تمثيلي لعمر الخلية. بدلا من ذلك ، بعد تعليق الخلايا في XPBS ، قم بإجراء قياس التدفق الخلوي باستخدام الإعدادات الموضحة في الرسم البياني للرسم البياني للبروتوكول النصي ندوب برعم على الخلايا الشابة والخلايا العمرية التي يتم احتسابها بواسطة الفحص المجهري على المحور Y مقابل المتوسط الهندسي الطبيعي للتألق المترافق WGA من نفس مجموعات الخلايا على المحور x.

أخيرا ، احصل على معادلة خط الاتجاه الخطي لهذه العلاقة للبديل اللاحق ، فإن المتوسط الهندسي الطبيعي ل WGA يترافق شدة التألق لمجموعة الخلايا ل X في المعادلة ويحل ل Y لتحديد متوسط عمر الخلية للعينة. يوضح هذا الرسم البياني أن معدل الطفرات في العلبة كان واحدا متشابها قبل وبعد وضع العلامات على البيوتين في مجموعات الخميرة الصغيرة المستقلة ، يمكن أن تكون ترددات الطفرات متشابهة أيضا في الخلايا الصغيرة قبل وبعد وضع العلامات على البيوتين عند نموها عند 20 درجة مئوية أو 30 درجة مئوية. يوضح الرسم البياني الموضح هنا ما يمكن ملاحظته عند عد الخلايا المستردة بعد وضع العلامات على البيوتين وفرز الخلايا غير المعالجة أو الخلايا المعالجة ببيروكسيد هيدروجين واحد بعد الفرز الأول.

قد يظهر عدد الخلايا أعلى من المتوقع بعد الفرز الأول ، ومن المتوقع فقدان تدريجي صغير للخلايا مع استمرار الفرز. تم تحديد العمر التكاثري عن طريق العد اليدوي للعلامات الفلورية ، ولكن الندوب على الخلايا كما هو موضح هنا كما هو موضح في هذا الشكل. تمت مقارنة إشارة الفلورسنت ولكن الندبة من قياس التدفق الخلوي بالعد اليدوي للحصول على علاقة خطية تسمح بتحديد العمر التكاثري لمجموعات الخلايا الأم والتحكم عن طريق قياس التدفق الخلوي.

تظهر هذه الرسوم البيانية أمثلة على ترددات الطفرات الملحوظة المماثلة أو المرتفعة للخلايا الأم المسنة مقارنة بالترددات المتوقعة المحسوبة من متوسط عمر الخلايا الأم وترددات الطفرات والمعدلات التي تم الحصول عليها لمجموعات الخلايا الشابة. اعتمادا على الموقع الجيني للعلبة واحدة الجين بعد هذا الإجراء. يمكن استخدام طرق أخرى مثل تلطيخ أنواع الأكسجين التفاعلية أو مورفولوجيا الوحدة للإجابة على أسئلة إضافية مثل التغييرات في فسيولوجيا الخلية المرتبطة بالتغيرات المرتبطة بالعمر في تراكم الطفرات.