حقن الفيروسي Intracerebroventricular من حديثي الولادة ماوس الدماغ للاستمرار وانتشار تنبيغ العصبية

الهدف العام من هذا الإجراء هو نقل الخلايا العصبية فيروسيا. يتم تحقيق ذلك عن طريق التخدير بالتبريد للصغار حديثي الولادة ، متبوعا بنقل حديث الولادة إلى مرحلة التبريد للحقن. بعد ذلك ، حدد موقع الحقن لاستهداف البطينين الجانبيين بين خياطة لامدا وكل عين أو جانبية من الخيط السهمي في منتصف الطريق بين Lambda و Bgma.

الخطوة الأخيرة هي إدخال الإبرة إلى العمق الصحيح وزرع ما يصل إلى ميكرولتر من محلول الفيروس ببطء في البطين الجانبي لكل نصف كرة الأرضية. في النهاية ، يتم استخدام علامة الفلورسنت أو التألق المناعي للجين المعني لإظهار نمط التعبير الجيني المعدل الناتج عن الحقن داخل البطين. بشكل عام ، سيكافح الأفراد الجدد في هذه التقنية من أجل استهداف البطينين الجانبيين بدقة.

يتم إثبات هذه التقنية من خلال الحقن اليدوي داخل الجمجمة وكذلك من خلال الحقن التجسيمي ، مما يدل على أن تقنية اليد الحرة ستكون باحثا آخر في مختبري. للبدء ، قم بإعداد حقنة حقن سعة 10 ميكرولتر بإبرة قياس 32 لحديثي الولادة العامين بعد الولادة. ثم ضع لوحا صغيرا من الألومنيوم على الثلج ليبرد وضع مهمة جافة ، امسح فوق اللوحة لحماية جلد الجرو من المعدن البارد.

هذا بمثابة سطح بارد مستو لتخدير الجراء وحقنها. بعد ذلك ، قم بإعداد وسادة تدفئة مناسبة للحفاظ على دفء الفئران حديثي الولادة قبل الحقن وبعده. بمجرد أن يبدأ الجراء حديثي الولادة في الرضاعة ، قم بإزالة نصفهم تقريبا من القفص واترك النصف الآخر مع والدتهم.

ضع الجراء التي تم جمعها على وسادة التدفئة أثناء انتظار الحقن. انقل جروا واحدا من وسادة التدفئة إلى الصفيحة المعدنية الباردة للحث على انخفاض حرارة الجسم. تخدير. انتظر دقيقتين إلى ثلاث دقائق حتى يصبح الجرو مخدرا تماما.

تأكد من التخدير عن طريق الضغط برفق شديد على المخلب ومراقبة قلة الحركة أو التنفس مجانا. تحميل الحقن اليدوي داخل الجمجمة خمسة ميكرولترات من الفيروس المرتبط بالأدينو المخفف ، أو A V مع 0.05٪ Trian blue في حقنة الحقن. امسح رأس الجرو المخدر برفق بقطعة قطن مبللة بنسبة 70٪ من الإيثانول.

حدد مواقع الحقن عند خمسي المسافة من خياطة لامدا إلى كل عين ويقع موقع الحقن البديل على بعد حوالي 0.8 إلى ملليمتر واحد جانبيا من الخيط السهمي في منتصف الطريق بين Lambda و Bgma. تظهر هذه المعالم من خلال الجلد في يوم ما بعد الولادة صفر. ضع علامة على موقع الحقن بقلم مختبر غير سام.

أمسك المحقنة بمقياس مرئي لمراقبة حجم المحلول الذي تم توزيعه. تأكد من أن الإبهام يمكن أن يصل إلى الجزء العلوي من المكبس. ثم قم بإزالة الإبهام من المكبس أثناء وضع الإبرة.

لتجنب الاستغناء عن الفيروس عن طريق الخطأ ، ضع الجرو على جانبه مع رأسه مباشرة تحت المحقنة. أدر رأس P بحيث يكون موقع الحقن المحدد متجها لأعلى وبلطف ولكن بحزم. شغل هذا المنصب بيد مفتوحة.

أمسك المحقنة بشكل عمودي على سطح الجمجمة وأدخل الإبرة في موقع الحقن المحدد على عمق ثلاثة ملليمترات تقريبا. حقن الإبرة حتى تنخفض المقاومة قليلا مما يشير إلى أن الإبرة قد اخترقت البطين الجانبي. ابدأ بحقن الفيروس ببطء أثناء مراقبة الحجم الذي يتم توزيعه من المحقنة.

قم بإعطاء حجم أقصى يبلغ ميكرولترين في البطين. اسحب الإبرة ببطء. السماح لموقع الحقن الأول بإغلاق قبل حقن نصف الكرة الآخر.

إذا كانت الإبرة في الموضع الصحيح ، فسوف تنتشر الصبغة لملء البطين. قم بتبريد مرحلة حديثي الولادة إلى ما بين أربع وثماني درجات مئوية عن طريق إضافة 100٪ من الإيثانول والثلج الجاف إلى الخزان. في الطرف الأمامي من قفل الكتلة.

حافظ على درجة حرارة أعلى من درجة مئوية واحدة لتجنب قضمة الصقيع لدى الجراء. قم بتحميل خمسة ميكرولترات من A a V المخفف مع 0.05٪ trian blue في حقنة الحقن التي يحملها مناور التجسيم. في وقت لاحق ، ضع رأس الجرو برفق بين قضبان الأذن في إطار حديثي الولادة.

تأكد من أن الرأس مستوي في المحور Y عن طريق التحقق من أن الخط الفاصل بين lambda و Bgma مواز للمرحلة. تأكد من أن الرأس مستوي في المحور السيني عن طريق التحقق من أن الخط المتخيل بين الأذنين أو خط بين العينين مواز للمرحلة. امسح رأس الجرو المخدر برفق بقطعة قطن مبللة بنسبة 70٪ من الإيثانول.

ثم استخدم مناور التجسيم لوضع المحقنة فوق Lambda والصفر. إحداثيات x و Y. حرك الأذرع التجسيمية إلى موضع 0.8 ملم جانبي و 1.5 ملم أمام خياطة لامدا أو الجراء القياسية بعد الولادة التي تخفض الإبرة ببطء في موقع الحقن.

سوف يدخل سطح الجمجمة ثم يحرر. بمجرد أن تخترق الإبرة الجلد ، اسحب الإبرة حتى تستعيد الجمجمة شكلها المقعر الطبيعي ، لكن احتفظ بشطبة الإبرة تحت الجلد صفر. إحداثيات Z في هذه المرحلة.

أدخل الإبرة حتى يساوي Z سالب 1.7 ملليمتر، ثم تراجع إلى سالب 1.5 ملليمتر. حقن الفيروس ببطء. يمكن أن يقبل كل نصف كرة كرة ما يصل إلى ميكرولتر من المحلول.

احتفظ بالمحقنة في مكانها لمدة 30 إلى 60 ثانية بعد الانتهاء من الحقن ثم اسحب الإبرة ببطء على مدى دقيقة إلى دقيقتين. كرر ذلك لنصف الكرة الأرضية المقابل باستخدام الإحداثيات السالبة في المحور x لموقع الحقن. بعد الانتهاء من الحقن في نصفي الكرة الأرضية ، ضع الجرو مرة أخرى على وسادة التدفئة حتى تعود درجة حرارة جسمه ولون بشرته إلى طبيعته ويبدأ الجرو في الحركة.

بعد ذلك ، قم بإزالة الجراء المتبقية المحقونة إلى وسادة الاحترار وأعد الجراء المحقونة إلى القفص بعد استعادة الحركة الطبيعية. كرر الإجراء حتى يتم حقن جميع الفئران. ينتج عن الحقن الفيروسي الناجح داخل البطين واسع النطاق وقوية.

تم تعبئة التعبير العصبي ، YFP أو TD ، التركيبات الجينية الفلورية للطماطم في V ثمانية وحقنها في البطينين الجانبيين للفئران حديثي الولادة. أدت العيارات الفيروسية العالية إلى وضع العلامات الكثيفة على البصلة الشمية والمخطط والقشرة الدماغية والحصين والمخيخ. كان وضع العلامات واضحا أيضا في الخلايا العصبية البركنجي المخيخية ، ولكنه غائب بشكل ملحوظ عن الخلايا العصبية الحبيبية المخيخية التي لم تكن موجودة بعد بأعداد كبيرة في يوم ما بعد الولادة أدى الحقن الصفري لعدد أقل من الجسيمات الفيروسية إلى وضع العلامات المتناثرة والتعبير الأقل كثافة.

يعد استخدام AA V ثمانية ضمن نطاق تركيز يتراوح بين 10 إلى السابع و 10 إلى 10 جسيمات لكل طريقة سهلة وموثوقة للتحكم في درجة الفسيفساء الجينات المعدلة وراثيا الناتجة عن الحقن. يمكن التعبير عن الجينات المعدلة وراثيا المتعددة عن طريق حقن فيروسين أو أكثر. يؤدي الحقن المشترك لفيروسين معبأين في نفس النمط المصلي إلى تحيز التنبيغ الناتج إلى مجموعات عصبية متداخلة بحيث تعبر العديد من الخلايا عن كلا الجينات المعدلة بتركيزات أقل.

تصبح أنماط التعبير أكثر استقلالية وتقل النسبة المئوية للخلايا المصنفة بشكل مشترك. يمكن أيضا تحقيق التعبير غير المتداخل عن طريق حقن أنماط مصلية مختلفة من AAV واحد و AAV ثمانية. ينتج عن ترميز مراسلي الفلورسنت المتميزين نمطا مستقلا إلى حد كبير من الفسيفساء المزدوجة بمجرد إتقانها.

يمكن إكمال هذه التقنية في غضون خمس إلى 10 دقائق لكل حديث الولادة إذا تم إجراؤها بشكل صحيح.