مناعي للبروتينات الغشاء الخارجي بواسطة التدفق الخلوي من الميتوكوندريا المعزولة

الهدف الشامل من هذا الإجراء هو وضع العلامات المناعية للبروتينات ذات الأهمية على غشاء الميتوكوندريا ER بجسم مضاد من اختيارك وتحليله بالتزامن مع وظيفة الميتوكوندريا. يتم تحقيق ذلك عن طريق جمع الأنسجة ذات الأهمية مثل الدماغ أو النخاع الشوكي أو الكبد من الفئران. الخطوة الثانية هي عزل الميتوكوندريا عن الأنسجة ، وفي هذه الحالة الحبل الشوكي.

تجانس الحبل الشوكي برقصة. تتم إزالة الخالط والعضيات الأخرى وحطام يوم الخلية من خلال سلسلة من خطوات الطرد المركزي حتى يتم تحقيق حنك الميتوكوندريا الخام ، تتم إزالة الملوث الرئيسي للأنسجة العصبية المركزية عن طريق خلط الميتوكوندريا بمحلول 12٪ من التحضير البصري والتسريب المركزي مرة أخرى. بعد ذلك ، يتم تصنيف الميتوكوندريا المعزولة بجسم مضاد أساسي مفضل ، متبوعا بجسم مضاد ثانوي مقترن بالفلور.

الخطوة الأخيرة هي إضافة أصباغ الفلورسنت لتأكيد هوية الميتوكوندريا أو بالأحرى المعلمات الوظيفية. في النهاية ، يتم استخدام قياس التدفق الخلوي لإظهار الوفرة النسبية لأغشية ألتو الميتوكوندريا في جميع أنحاء علم وظائف الأعضاء الطبيعي أو المرض. الميزة الرئيسية لهذه التقنية على الطرق الحالية مثل الفحص المجهري هي أنها تسمح بالإنتاجية العالية والكمية السريعة لآلاف الميتوكوندريا الفردية.

تم التعامل مع المستخدمة في هذه الدراسة بما يتفق بدقة مع بروتوكول وافقت عليه اللجنة المؤسسية لحماية C-R-C-H-U-M ، والذي يتبع المعايير الوطنية على النحو المبين من قبل المجلس الكندي لرعاية الهواء. لبدء هذا الإجراء ، ضع حبلا نخاخا سليما بالكامل تم جمعه من فأر في خالط زجاجي سعة خمسة ملليلتر يحتوي على خمسة أحجام من المخزن المؤقت للتجانس. ضع الخالط الزجاجي على الثلج وقم بتجانس الأنسجة يدويا حتى لا تبقى قطع أكبر من الأنسجة ، الأمر الذي سيستغرق ما يقرب من ثماني ضربات.

انقل الجانس إلى اثنين أو ثلاثة أنابيب طرد مركزي دقيقة وأجهزة طرد مركزي عند 1 ، 300 مرة G لمدة 10 دقائق من أربع درجات مئوية ، الماصة الطافية التالية S إلى أنبوب طرد مركزي فائق سعة خمسة ملليلتر. أضف 750 ميكرولتر من مخزن التجانس إلى الحبيبات وأعد تعليق الحبيبات برفق. ثم الطرد المركزي التعليق وإعادة تعليق الحبيبات.

مرتين أخريين لإزالة الحطام الصغير ، اسحب جميع المواد الطافية إلى نفس أنبوب الطرد المركزي الفائق سعة خمسة ملليلتر ، ثم ضع الأنابيب في دوار جهاز طرد مركزي فائق. مجهزة بدلاء متأرجحة ، قم بالطرد المركزي للأنابيب عند 17 ، 000 مرة G لمدة 15 دقيقة من أربع درجات مئوية. عند اكتمال الطرد المركزي ، احتفظ بالمادة الطافية لمزيد من المعالجة إذا كان الجزء العصاري الخلوي ذا أهمية.

بعد ذلك ، يقوم resus بتعليق الحبيبات ، وهو جزء الميتوكوندريا الخام في أربعة ملليلتر من مخزن التجانس الذي يحتوي على 50 مليمولار من أجهزة الطرد المركزي كلوريد البوتاسيوم. الحبيبات المعلقة عند 17 ، 000 مرة G لمدة 15 دقيقة عند أربع درجات مئوية في دوار دلو متأرجح ، ثم تخلص من supinate وأعد تعليق الحبيبات برفق في 800 ميكرولتر من مخزن التجانس في أنبوب طرد مركزي فائق جديد سعة خمسة ملليلتر عند 800 ميكرولتر بالضبط من الحبيبات المعلقة. بعد ذلك ، قم بعمل 200 ميكرولتر من اليود إلى 800 ميكرولتر من الحبيبات المعلقة لإنشاء تركيز نهائي قدره 12٪ من اليود دال.

امزج محتويات الأنبوب برفق ولكن جيدا باستخدام ماصة P 1000 ثم جهاز الطرد المركزي عند 17،000 مرة G لمدة 15 دقيقة عند أربع درجات مئوية في دوار دلو متأرجح ، واستنشق طبقة المايلين في الجزء العلوي من الأنبوب وتخلص من السوبينات بعناية لأن اللوحة قد تكون فضفاضة. يقوم Resus بتعليق الحبيبات في أربعة ملليلتر من المخزن المؤقت للتجانس. ثم قم بالطرد المركزي مكاسبك عند 17،000 مرة G لمدة 15 دقيقة عند أربع درجات مئوية في دوار دلو متأرجح.

تجاهل الاستلقاء والاستشارة. قم بتعليق الحبيبات في أربعة ملليلتر من المخزن المؤقت للتجانس. ثم كرر الطرد المركزي مرة أخرى وقم بإزالة عامل الاستلقاء reus.

ثني الحبيبات النهائية في 100 إلى 200 ميكرولتر من مخزن التجانس المؤقت ونقله إلى أنبوب طرد مركزي دقيق سعة 1.7 ملليلتر. حدد كمية البروتين في كل عينة باستخدام مقايسة كمية البروتين القياسية مثل مقايسة حمض بيونيك أو BCA. عند تحضير العينات للقياس الكمي ، قم بتخفيف العينات والمنحنى القياسي في كبريتات الصوديوم بنسبة 2٪ لضمان الذوبان الكافي للميتوكوندريا.

لكل مزيج تلطيخ يتم اختباره ، قم بإدخال 25 ميكروغراما من الميتوكوندريا المعزولة في أنبوب مركزي صغير سعة 1.7 ملليلتر. تأكد من تضمين عينة غير ملوثة في كل تجربة بالإضافة إلى عنصر تحكم مناسب في النمط الإسوبي لكل جهاز طرد مركزي تم اختباره للجسم المضاد كل عينة عند 17،000 مرة G لمدة دقيقتين عند أربع درجات مئوية في جهاز طرد مركزي دقيق على الطاولة. ثم قم بإزالة الميتوكوندريا المعزولة وإعادة تعليقها في 50 ميكرولتر من عازلة الميتوكوندريا.

مع استكمال 10٪ من الأحماض الدهنية خالية من الأحماض الدهنية ، تحتضن المحلول لمدة 15 دقيقة عند أربع درجات مئوية ، ثم تضيف 20 ميكروغراما من الجسم المضاد الأساسي لكل مليلتر من المحلول. احتضان الميتوكوندريا المعزولة بالجسم المضاد الأساسي لمدة 30 دقيقة عند أربع درجات مئوية لغسل الجسم المضاد غير المرتبط ، والطرد المركزي لكل عينة والتخلص من المستقيم. بعد ذلك ، قم بإعادة تعليق الحبيبات برفق في 200 ميكرولتر من عازلة الميتوكوندريا ، ثم كرر خطوة الطرد المركزي ، وتخلص من العجينة المستلقية وأعد تعليق الحبيبات في 50 ميكرولتر من عازلة الميتوكوندريا.

أضف 0.5 ميكروغرام من الجسم المضاد الثانوي لكل مليلتر من العينة. ثم احتضان العينات لمدة 30 دقيقة عند أربع درجات مئوية ، محمية من الضوء. عند اكتمال الحضانة ، قم بالطرد المركزي لكل عينة وتخلص من السوبينات الذي يحتوي على الجسم المضاد الثانوي غير المرتبط. ريس.

قم بتعليق الحبيبات في 200 ميكرولتر من عازلة الميتوكوندريا وقم بالطرد المركزي للعينة. مرة أخرى. ثم قم بإزالة supinate و Reese. الحبيبات في 500 ميكرولتر من عازلة الميتوكوندريا للتأكد من أن الأحداث المرصودة هي في الواقع ميتوكوندريا.

تلطخ العينة بصبغة فلورية خاصة بالميتوكوندريا مثل جهاز تعقب معهد ماساتشوستس للتكنولوجيا باللون الأخضر من الجسم الزجاجي لمدة 15 دقيقة في الظلام. إذا لم يكن هناك حاجة إلى مزيد من التلوين للتحقيق في المعلمات الوظيفية الأخرى ، فقم بنقل العينة المسماة إلى أنبوب مناسب للتحميل في مقياس التدفق الخلوي. احتفظ بالعينات على الجليد وانتقل إلى مقياس التدفق الخلوي للحصول عليه للتحقق من أن الميتوكوندريا المعزولة تحتوي على غشاء محتمل سليم ، وصمة عار للميتوكوندريا مع 100 نانومولار رباعي إيثيل قضيب دومين ميثيل إستر لمدة 15 دقيقة في درجة حرارة الغرفة في الظلام كعنصر تحكم في التلوين باستخدام رباعي إيثيل قضيب دومين.

يلطخ إستر الميثيل الميتوكوندريا المعزولة ب 100 نانومولار قضيب رباعي إيثيل دومين ميثيل إستر في وجود 100 ميكرومولار كربونيل سيانيد م كلورو فينول هيدروون. هذه المادة الكيميائية عبارة عن مزوج من الميتوكوندريا وستقوم بإزالة استقطاب الميتوكوندريا للتحقق من أن الميتوكوندريا المعزولة تنتج فائق أكسيد وصمة عار على الميتوكوندريا بمؤشر فائق أكسيد مناسب مثل الجوارب الميتوزية الحمراء من الجسم الزجاجي لمدة 15 دقيقة في درجة حرارة الغرفة في الظلام كتحكم في إنتاج أكسيد الميتوكوندريا الفائق. ابق في الميتوكوندريا المعزولة مع صبغة في وجود 10 ميكرومولار أنتيمايسين.

مضاد مايسين أ هو مثبط للمركب الثالث من سلسلة الجهاز التنفسي وسيزيد من إنتاج أكسيد الميتوكوندريا الفائق قبل بدء الاستحواذ. قم بإعداد الأداة كما هو موضح في بروتوكول النص المصاحب. ثم امزج العينات عن طريق النقر برفق على الأنبوب ، لكن لا تقم بالدوامة.

ابدأ في جمع الأحداث الأولية عند ضغط منخفض أثناء البوابة. تأكد من تحديد إجمالي عدد السكان. بعد ذلك ، اضبط الفولتية للرسوم البيانية وفقا لذلك.

عادة ما تتوافق ذروة العينة غير الملوثة مع العقد الثاني. ثم بمجرد إنشاء البوابات ومعالجة العينات ، قم بتبديل الضغط إلى قياس الخلايا عالي التدفق. حدد تحليل مستحضرات الحبل الشوكي أن 94٪ من الأحداث كانت إيجابية لصبغة خاصة بالميتوكوندريا.

في هذه التجربة ، تم تصنيف 30٪ من الأحداث الإيجابية للميتوكوندريا بجسم مضاد خاص باندماج معهد ماساتشوستس للتكنولوجيا الثاني ، وهو بروتين متورط في اندماج الغشاء الخارجي للميتوكوندريا. وجد تحليل إمكانات الغشاء الميتوكوندريا باستخدام إستر ميثيل رباعي إيثيل الروم أن 95٪ من الميتوكوندريا المعزولة لها إمكانات غشاء سليمة. تبين أن هذا التلوين محدد حيث لوحظ انخفاض كبير في التلوين عند إجراؤه في وجود الميتوكوندريا غير الوظيفية الميتوكوندريا التي تم العثور عليها لإنتاج كمية أساسية من أكسيد SUP كما تم قياسها باستخدام صبغة نفاذة للغشاء.

أن يصبح تفاعل فلورسنت P مع أكسيد SUP. تؤدي معالجة الميتوكوندريا بمضادات المايسين أ إلى زيادة تقريبية بنسبة 10٪ في إنتاج الأكسيد الفائق بمجرد إتقانها. يمكن إجراء هذه التقنية في غضون ست إلى سبع ساعات إذا تم إجراؤها بشكل صحيح.