عالية الإنتاجية المعايرة من luciferase المراسل، معربا عن الفيروسات المؤتلف

الهدف العام من التجربة التالية هو تقدير العيار الفيروسي للفيروس الموسوم ب luciferase باستخدام طريقة القياس الكمي عالية الإنتاجية. يتم تحقيق ذلك عن طريق نقل المادة الطافية للعينات المراد تحويلها ، بالإضافة إلى منحنى قياسي فيروسي على خط خلية متساهل للسماح بالتعبير عن لوسيفيراز. كخطوة ثانية ، يمكن إضافة RESA zurin إلى العينات الأصلية ، والتي سيتم استخدامها لتقييم صلاحية الخلية.

بعد ذلك ، بعد وقت الحضانة المناسب ، يضاف لوسيفيريان إلى الخلايا من أجل القياس الكمي عن طريق اللمعان. تظهر النتائج كمية الفيروس في العينة بناء على تعبير لوسيفيراز. الميزة الرئيسية لهذه التقنية على الطرق الحالية مثل تقويم البلاك ، هي أنه يمكن معالجة عدد كبير من العينات بسرعة وفي وقت واحد.

يمكن أيضا توسيع هذه الطريقة لتشمل الفيروسات التي تعبر عن لوسيفيراز غير قعقعة. نظرا لأنه لا يعتمد على تكوين البلاك ، يمكن بسهولة دمج قراءة السمية الخلوية للخلية في سير العمل وقد تكون مفيدة في سياق شاشة الدواء. سيتم توضيح الإجراء فانيسا راميا وكولين ثلاثة طلاب دراسات عليا من مختبري أولا بإجراء العدوى باستخدام VSP Delta 51 للتعبير عن Firefly Luciferase في عام 96.

حسنا ، سيتم معايرة المواد الطافية لألواح زراعة الأنسجة من هذه الألواح بعد وقت حضانة مناسب قبل 24 ساعة من المعايرة. تحضير معلق من خلايا Vero بتركيز 2.5 مرة 10 إلى الخلايا الخامسة لكل مليلتر في DMEM تحتوي على 10٪ FBS 30 ملليمولار أكوام و 1٪ بنسلين ستربتومايسين C ، 2.5 مرة 10 إلى الخلايا الرابعة في 96. ألواح سفلية مسطحة صلبة بيضاء جيدا باستخدام موزع صفيحة دقيقة لإعداد تعليق الخلية ، قم بتنظيف كاسيت موزع الصفيحة الدقيقة عن طريق شطف الأنبوب ب 50 مل من الماء المعقم.

ثم املأ خطوط موزع الصفيحة الدقيقة بتعليق الخلية ، مما يسمح بتدفق خمسة ملليلتر من تعليق الخلية. حدد برنامجا يوزع 100 ميكرولتر في كل بئر من لوحة بئر 96 ذات جدران بيضاء وكرر ذلك حسب الضرورة لألواح إضافية. قم أيضا بزرع بعض الآبار في صفيحة سفلية بيضاء صافية 96 جيدا للتحقق من صحة الخلية وكثافتها.

عند الانتهاء ، اغسل الخلايا مرة أخرى في الحاوية الأصلية. نظف الكاسيت عن طريق تشغيل 50 مل من 70٪ من الإيثانول ، متبوعا ب 50 مل من الماء الدافئ المعقم عبر الأنبوب. بعد ذلك ، احتضان الخلايا لمدة 24 ساعة عند 37 درجة مئوية في حاضنة مرطب بثاني أكسيد الكربون بنسبة 5٪.

قم بإعداد منحنى قياسي ل VSV Delta 51 في DMEM الخالي من المصل بحيث يكون التركيز النهائي لوحدات المنصات لكل مليلتر بعد النقل إلى خلايا Vero على النحو التالي. قم بإعداد 50 ميكرولترا من كل تركيز لكل لوحة من خلايا Vero ، بالإضافة إلى 10٪ إضافية يمكن نقل المنحنى القياسي إلى صفيحة بئر عميقة 96. بعد ذلك ، تحقق من خلايا Vero المطلية في صفيحة البئر السفلية الشفافة 96 تحت المجهر الضوئي للتأكد من أن الطبقات الأحادية هي 95٪ على الأقل من النقل العابر.

25 ميكرولترا من العينة الطافية على خلايا Vero الموجودة في الألواح ذات الجدران البيضاء باستخدام ماصة متعددة القنوات من 12 قناة عند 25 ميكرولترا من كل تخفيف للمنحنى القياسي إلى خلايا Vero في العمودين المعينين. الطرد المركزي للألواح لمدة خمس دقائق عند 430 Gs في درجة حرارة الغرفة. ثم احتضان الصفائح لمدة خمس ساعات عند 37 درجة مئوية في حاضنة مرطبة بنسبة 5٪ من ثاني أكسيد الكربون.

في هذه المرحلة ، أضف الزورين بكمية تساوي 10٪ من الحجم في كل بئر من لوحة 96 بئر من العينات التي تحتوي على فيروسات وخلايا. بعد ساعتين إلى أربع ساعات ، اقرأ الإشارة وسجلها باستخدام قارئ لوحة مضان باستخدام 530 إلى 560 للإثارة و 590 لتقرير الانبعاث. صلاحية الخلية للعينة وفقا للصيغة التالية.

قبل 30 دقيقة من نهاية الحضانة لمدة خمس ساعات ، قم بإعداد اللوسيفر للحصول على محلول ملليغرام لكل مليلتر في محلول ملحي معقم بالفوسفات المعقم. قم بحماية المحلول من الضوء بعد فترة الحضانة التي تبلغ خمس ساعات عند 25 ميكرولتر من Lucifer إلى كل بئر من خلايا Vero في الألواح الصلبة البيضاء باستخدام موزع آلي مدمج في مقياس الإلواء. اقرأ اللوحات بالمعلمات التالية.

رج العبوة لمدة خمس ثوان وانتظر لمدة 30 ثانية. اقرأ التلألؤ بقيمة تعريض مائلة ذات حساسية ثابتة مناسبة ، ثم قم بتسجيل وحفظ شدة الإضاءة الحيوية الكمية. إذا تم استخدام موزع آلي لإضافة لوسيفيريان ، فقم بالجلوس في اللوسيفيريان وتجهيز الخطوط بمياه معقمة أو نتائج دقيقة ، فقم بحل الانحدار غير الخطي لتوليد معادلة تل من المنحنيات القياسية.

قم بتطبيق هذه المعادلة على العينات المعيرة لحساب وحدات التعبير الفيروسي. يتم عرض نتائج المنحنى القياسي النموذجي ل VSV Delta 51 هنا ، أو أنتج تحليل الانحدار غير الخطي للمعلمة مخطط برد يمكن من خلاله استيفاء وحدات تشكيل المدخلات غير المعروفة. تمت مقارنة العيارات الفيروسية التي تم الحصول عليها عن طريق اختبار البلاك القياسي على خلايا Vero مع العيارات الفيروسية المحسوبة من نفس العينات.

نشأت عينات فحص اللوسيفيراز عالية الإنتاجية باستخدام عينات فحص اللوسيفيراز عالية الإنتاجية من تجربة حيث تم استخدام مواد كيميائية مختلفة لتعزيز النسخ المتماثل والانتشار لخلايا VSV Delta 51 و 7 8 6 0. يتم تصوير الارتباط الخطي بين العيارات ووحدات التعبير الفيروسي بمربع R 0.8083 ودرجة بيرسون R البالغة 0.899 هنا. تظهر هنا بيانات السمية الخلوية النموذجية التي تم الحصول عليها من اختبار التمثيل الغذائي ل 7 ، 8 6 0 خلايا معالجة بمواد كيميائية قبل الإصابة.

مع VSV Delta 51 ، يتم عرض المنحنيات القياسية النموذجية التي تم الحصول عليها باستخدام فيروس الهربس البسيط وفيروس اللقاح والفيروس المرتبط بالغدة ، وكلها تعبر عن لوسيفيراز اليراع هنا. بمجرد إتقانها ، يمكن استخدام هذه التقنية لإجراء شاشات عالية الإنتاجية للمكتبات المركبة بالاشتراك مع الفيروس الذي يثير اهتمامك لإنشاء بيانات العيارات والسمية الخلوية. أثناء محاولة هذا الإجراء ، من المهم أن تتذكر تخفيف المنحنى القياسي بشكل صحيح لأن هذا أمر بالغ الأهمية لاستيفاء وحدات التعبير الفيروسي.

لا تنس أن العمل مع الفيروسات الحية يمكن أن يكون خطيرا للغاية ويجب دائما اتخاذ الاحتياطات مثل العمل في خزانة السلامة البيولوجية وارتداء معدات الحماية الشخصية المناسبة أثناء تنفيذ هذا الإجراء. بعد مشاهدة هذا الفيديو ، يجب أن يكون لديك فهم جيد لكيفية تقدير العيارات الفيروسية باستخدام طريقة قياس كمية عالية الإنتاجية بناء على التعبير عن قياس الجينات المحورة لوسيفيراز للتلألؤ البيولوجي في استيفاء وحدات التعبير الفيروسي غير المعروفة. من عينة المنحنى القياسية ، يمكن تحديد السمية الخلوية في وقت واحد عن طريق مقايسة الجدوى المناسبة.