التعبير البروتين المؤتلف لعلم الأحياء الهيكلي في HEK 293F خلايا نظام التعليق: رواية ويمكن الوصول إليه المنهج

أصبح التعبير عن البروتينات المؤتلفة بواسطة أنظمة الثدييات طريقة جذابة لإنتاج مجمعات البروتين للبيولوجيا الهيكلية. نقدم هنا نظام تعبير بسيط ولكنه عالي الكفاءة باستخدام خلايا الثدييات المزروعة المعلقة لتنقية مجمعات البروتين للدراسات الهيكلية.

الهدف العام من الفيديو التالي هو إظهار تقنية بسيطة وبأسعار معقولة لإنتاج عائد جيد من مجمعات البروتين أو البروتين باستخدام نظام تعبير الثدييات. يتم تحقيق ذلك من خلال زراعة خلايا HEC 2 93 F في معلق في حاضنة اهتزاز رطبة مع جو يتم الحفاظ عليه عند 5٪ من ثاني أكسيد الكربون. كخطوة ثانية ، يتم نقل الخلايا بشكل عابر باستخدام واحد أو أكثر من البلازميدات ذات التعبير عن عدد النسخ العالي.

باستخدام عامل التعدي البولي إيثيلين EIN أو PEI ، سمح للخلايا بالنمو لمدة 48 ساعة قبل الحصاد. يتم إجراء تنقية البروتين التالي باستخدام راتنج التقارب ، يليه ترشيح الجل لتنقية مركب البروتين ذي الأهمية من أجل إجراء دراسات هيكلية ووظيفية. في النهاية ، يتيح نظام التعبير البسيط والميسور التكلفة هذا للثدييات التعبير عن البروتينات ومجمعات البروتين التي يصعب التعبير عنها في الخلايا البكتيرية وتنقيتها

الميزة الرئيسية لهذا النهج هي ملاءمته وتعدد استخداماته للتعبير عن مجمعات البروتين. يكاد يكون الأمر سهلا مثل صنع البروتينات في البكتيريا ، خاصة أنه يمكنك مزج ومطابقة نواقل التعبير عن البروتين. يمكن استخدام الطريقة في البداية على نطاق صغير لاختبار التعبير عن كمادات البروتين ، ولكنها قابلة للتطوير بسهولة لإنتاج عائد جيد من كمادات البروتين للدراسات الهيكلية والوظيفية ، فإن مفتاح النجاح هو الحفاظ على الخلايا في حالة صحية ، خالية من البكتيريا أو عدوى الخميرة.

حيث أن المضادات الحيوية في وسائل الإعلام تقلل بشكل كبير من إنتاجية البروتين. للبدء ، قم بإزالة قارورة التبريد التي تحتوي على مليلتر واحد من خلايا HEC 2 9 3 F بكثافة 20 مليون خلية لكل مليلتر من النيتروجين السائل وقم بإذابة الجليد بسرعة في حمام مائي 37 درجة مئوية. قم بتفكيك أي كتل عن طريق سحب العينات لأعلى ولأسفل عدة مرات وقم بتقطيع المحتوى بالكامل إلى قارورة مزرعة خلوية مخروطية سعة 250 مل تحتوي على 34 مل من وسائط Prewarm.

ضع المزرعة في حاضنة اهتزاز مدارية مرطبة عند 37 درجة مئوية و 120 دورة في الدقيقة و 5٪ ثاني أكسيد الكربون بعد 48 ساعة. تحقق من صلاحية الخلية عن طريق trian blue. تلطيخ صلاحية الخلية الطبيعية في هذه المرحلة هي حوالي 70٪ عندما تصل الخلايا إلى عدد حوالي 1 مليون خلية لكل مليلتر.

قم بتدليكها إلى العد النهائي البالغ 0.35 مليون خلية لكل مليلتر في قارورة ثقافة الخلايا المخروطية سعة 250 ملليلتر تحتوي على 60 مل من وسائط التدفئة الجاهزة ، واستمر في تدليك الخلايا كل 48 ساعة أو عندما تصل إلى ما يقرب من 2 مليون خلية لكل مليلتر. تظهر هنا عينة من خلايا Trian blue stain HEC 2 9 3 F عند 2.3 مليون خلية لكل مليلتر من مخزون جاهز للبذر لخلايا التعدي يجب أن تكون موجودة فقط كخلايا مفردة أو منقسمة. إذا كانت الخلايا متضخمة ، فستشكل كتل كبيرة وستكون قابليتها للحياة منخفضة جدا كما هو موضح في هذه الصورة.

إذا كانت الخلايا تشكل مجموعات ، فقد يتم تفكيكها عن طريق دوامة قوية لمدة 25 ثانية. للبدء ، بذر الثقافات على نطاق واسع الخلايا بنصف مليون خلية لكل مليلتر في حجم نهائي يبلغ 300 ملليلتر في كل زجاجة أسطوانية سعة لتر واحد. احتضان لمدة 24 ساعة في شاكر مداري مرطب عند 37 درجة مئوية و 135 دورة في الدقيقة و 5٪ ثاني أكسيد الكربون حتى تصل الخلايا إلى كثافة 1 مليون خلية لكل مليلتر.

بعد ذلك ، قم بعمل ماصة ما مجموعه 300 ميكروغرام من الحمض النووي المعقم بالمرشح إلى 30 مل من الفوسفات أو المحلول الملحي أو PBS والدوامة بقوة لمدة ثلاث ثوان. ثم أضف 1.2 مل من 0.5 ملليغرام لكل ملليلتر. قم بتصفية PEI المعقم إلى محلول PB SDNA والدوامة بقوة لمدة ثلاث ثوان إضافية.

احتضن المزيج في درجة حرارة الغرفة لمدة 20 دقيقة قبل إضافة الخليط إلى الخلايا التالية للسرير. يحتضن التعدي الخلايا في حاضنة اهتزاز مدارية رطبة لمدة 48 ساعة أخرى عند 37 درجة مئوية و 135 دورة في الدقيقة و 5٪ من ثاني أكسيد الكربون بعد 48 ساعة. حصاد البروتينات داخل الخلايا عن طريق الطرد المركزي للخلايا عند 3000 مرة جم لمدة خمس دقائق.

إذا لم تكن حبيبات الخلية للاستخدام الفوري, يمكن تخزينها عند 80 درجة مئوية تحت الصفر. تم تحسين هذا البروتوكول لتنقية مجمعات البروتين من النواة التي يحتوي فيها أحد البروتينات على علامة علم. لبدء تنقية التصفية ، قم بتعليق لوحة الخلايا في ما يقرب من 40 مل من التحلل المبرد مسبقا ، والمخزن المؤقت لكل لتر من الثقافة ، باستخدام مزيج من الماصة لأعلى ولأسفل عدة مرات ، وصوتنة الخالط الزجاجي لثلاث دورات من 15 ثانية على 15 ثانية.

ثم قم بالطرد المركزي 108،000 مرة G لمدة 25 دقيقة عند أربع درجات مئوية واحتفظ بالطرد الضعيف. بعد ذلك ، قم بموازنة 1.2 مل من راتنج aros المعبأ المضاد للعلم لكل لتر من الثقافة عن طريق الغسيل ثلاث مرات باستخدام مخزن مؤقت لتوازن الراتنج يحتضن supinate ، والذي يمثل مستخلص الخلية بالكامل مع راتنج التقارب في واحد أو أكثر من أنابيب الطرد المركزي سعة 50 ملليلتر تدور بلطف لمدة 30 إلى 120 دقيقة من أربع درجات مئوية بعد الحضانة جهاز الطرد المركزي عند 3000 مرة G لمدة دقيقة واحدة عند أربع درجات مئوية. بعد التخلص من supinate ، انقل الراتنج إلى أنبوب طرد مركزي سعة 15 مليلتر واغسله بما مجموعه 45 مل من المخزن المؤقت المبرد مسبقا ، وجهاز طرد مركزي واحد قبل ثم تخلص من الغسيل المتكرر والطرد المركزي باستخدام عازلة عالية الملح ، متبوعا بمخزن مؤقت منخفض للملح ومخزن انقسام TEV.

تأكد من أن كل غسلة كافية لإعادة تعليق الراتنج بالكامل ولكن ليس بعد الآن. بعد ذلك ، اجمع عينة سعة 10 ميكرولتر من الراتنج وقم بتخفيفها إلى حجم واحد من المخزن المؤقت لتحميل البروتين مرتين لتحليلها لتمثيل عينة البروتين المقلدة. لا تستخدم عوامل الاختزال لأنها ستطلق الجسم المضاد من الراتنج.

ثم أعد تعليق الراتنج إلى 10 ملليلتر من المخزن المؤقت للانقسام TEV المبرد مسبقا عند حوالي 40 ميكروغراما من بروتياز TEV لكل لتر من الثقافة الأصلية وخلطه عن طريق قلب الأنبوب عدة مرات. يمكن تحسين مستويات البروتياز TEV وفقا لكمية البروتين السريع. استبدل غلاف الأنبوب بغاز نيتروجين بنسبة 100٪ لمنع أكسدة البروتين قبل الدوران برفق طوال الليل عند أربع درجات مئوية في اليوم التالي.

بالطرد المركزي للعينة عند 3000 مرة G لمدة 10 دقائق ، ثم انقل السوبينات إلى مرشح طرد مركزي فائق مع قطع مناسب للوزن الجزيئي والتركيز حتى 500 ميكرولتر. اجمع عينة سعة 10 ميكرولتر من البروتين المركز وقم بتخفيفها إلى حجم واحد من المخزن المؤقت لتحميل البروتين مرتين لتحليله. تمثل هذه العينة عينة التصريف TEV.

ثم اجمع عينة 10 ميكرولتر من الراتنج وقم بتخفيفها إلى حجم واحد من المخزن المؤقت لتحميل البروتين مرتين. تمثل هذه العينة عينة راتنج ما بعد TEV. الخطوة التالية هي تشغيل البروتين من خلال عمود استبعاد الحجم ويجب استخدام مصفوفة ترشيح الهلام المناسبة وفقا لحجم المجمع محل الاهتمام.

في هذه الحالة ، استخدمنا عمود كروماتوغرافيا استبعاد بحجم 10 × 300 ملم S 200 يساوي عمود كروماتوغرافيا استبعاد الحجم مع المخزن المؤقت للترشيح الهلامي. قم بتصفية البروتين من خلال مرشح 0.22 ميكرون وقم بتحميل العينة في العمود. تابع جمع الكسور عند خروجها من العمود.

كخطوة أخيرة ، قم بإجراء فصادة كهربائية لهلام بولي أكريلاميد SDS أو صفحة SDS على العينات التي تم جمعها ، بالإضافة إلى كسور ترشيح الهلام ، هيستون DS SLA واحد أو HD مثبط واحد للإسكات المعيب ثلاثة أو SDS ثلاثة ومزامنة ثلاثة ، مجال تفاعل HDAC أو syn ثلاثة ، يشكل HID مركب منعطف مستقر. يمكن ملاحظة تنقية تقارب مركب الدوران من خلال صفحة SDS. يظهر هنا المركب المنقى الذي ينتجه سرير الأطفال ، الذي ينقل لترين من الخلايا.

يظهر ممر البروتين المرتبط المركب المرتبط براتنج التقارب. بعد هضم TEV ، يتم قطع العلامة الموجودة على الخطيئة الثالثة A HID ويتم التلميح إلى المركب. الراتنج الموضح هنا عبارة عن كروماتوجرام لمركب البروتين المنقى باستخدام عمود كروماتوغرافيا استبعاد بحجم 10 × 300 ملم S 200.

لاحظ أن المركب النقي يتراوغ بالقرب من حجم الفراغ لأنه يشكل ثنائيا في المحلول. أخيرا ، يكشف تحليل صفحة SDS عن البروتين المنقى في كسور ترشيح الجل. بعد مشاهدة هذا الفيديو ، يجب أن يكون لديك فهم جيد لكيفية نمو خلايا تطبيق HEC الثانية والثالثة والحفاظ عليها وتعليقها ، بالإضافة إلى كيفية تقارب البروتين الخاص بك وتنقيته وتركيزه.

الخلايا السليمة المعقدة ضرورية لنجاح التجارب ، لذا تأكد من نموها والحفاظ عليها في ظروفها ومرورها بانتظام. لا تتأخر عن زراعة الأنسجة. من السهل على علماء الأحياء الهيكلية التعبير عن كميات كبيرة من مجمعات البروتين والبروتين من خلايا الثدييات وتنقيتها