و في المختبر نموذج لدراسة الفيزيولوجيا المرضية الخلوي في الخلية حثل المادة البيضاء الكروي

الهدف العام من هذا الإجراء هو إظهار التحول الفريد للخلايا الدبقية الصغيرة إلى خلايا GLO في وجود السم السيكلين. يتم تحقيق ذلك عن طريق زلات غطاء الطلاء الأولى ببروتينات المصفوفة خارج الخلية. في الخطوة الثانية ، يتم طلاء الخلايا الدبقية على زلات الغطاء ، ثم يتم إعطاء حبات الحل واللاتكس للثقافات.

في الخطوة الأخيرة ، يتم تلطيخ الخلايا بالكيمياء المناعية. في النهاية ، يمكن تقييم تأثيرات السيكلين على التنوي والقدرة البلعمية للخلايا الدبقية الدقيقة عن طريق الفحص المجهري المناعي الفلوري. الميزة الرئيسية لهذه التقنية على الأساليب الحالية مثل استخدام خطوط الخلايا الدبقية الدقيقة ، هي أن استخدام الثقافات الدبقية الأولية يحاكي التفاعلات المفترضة بين الخلايا النجمية والخلايا الدبقية الصغيرة في أدمغة الأفراد المصابين بحمور بيضاء الخلايا الفارغة GLO أو GLD مما يدل على أن الإجراء سيكون KO Claycomb ، طالب دراسات عليا من مختبري.

لتحضير مصفوفة خارج الخلية أو زلات الغطاء المطلية ب ECM ، قم أولا بنقع زلات الغطاء الدائري بحمض الهيدروكلوريك المعقم في طبق بتري معقم. بعد 30 دقيقة ، اغسل الغطاء ثلاث مرات بالماء المعقم ثم انقعه في 95٪ من الإيثانول لمدة 20 دقيقة على الأقل. بعد ترك الغطاء ينزلق يجف في الهواء ، أضف 150 إلى 250 ميكرولتر قطرة من مواد طلاء بروتين ECM المخففة على ورقة من الطفيلي توزع القطرات بحيث لا تتداخل زلات الغطاء بعد وضعها.

بعد ذلك ، استخدم الملقط لوضع زلة غطاء برفق على كل قطرة ثم ضع الطفيلي داخل غطاء مزرعة الخلية مع إغلاق الوشاح بعد أربع إلى ست ساعات ، ضع زلات الغطاء المطلية ب ECM لأعلى في آبار فردية من صفيحة 24 بئر. ثم اغسل كل بئر بمعقم PB S3 مرات وقم بتخزين زلات الغطاء عند أربع درجات مئوية. لتحضير الخلايا الدبقية للطلاء على زلات الغطاء ، قم بشفط الوسائط من مزارع الخلايا الدبقية ثم اغسل الطبقات الأحادية برفق ثلاث مرات باستخدام 10 ملليلتر من PBS المعقم.

افصل الخلايا بثمانية إلى 10 ملليلتر من التربسين EDTA بعد خمس إلى 10 دقائق. عند 37 درجة مئوية ، أضف 20 مل من الوسائط الكاملة إلى القارورة لإيقاف التفاعل. ثم انقل معلق الخلية إلى أنبوب مخروطي سعة 50 مليلتر وقم بتدوير الخلايا لمدة 10 دقائق.

عند 300 جي ودرجة حرارة الغرفة ، استخدم P 1000 لإعادة تعليق الحنك برفق في ملليلترين من الوسائط الطازجة والكاملة. بعد العد ، قم بتخفيف الخلايا إلى ما يقرب من واحد في 10 إلى الخلايا الخامسة لكل مليلتر. الآن قم بوضع 500 ميكرولتر من الخلايا على كل من زلات الغطاء المطلي ب ECM.

أضف وسائط كاملة جديدة إضافية إلى كل بئر ثم احتضن الطبق عند 37 درجة مئوية لمدة ثلاثة إلى خمسة أيام. بمجرد أن تصل الخلايا إلى التقاء المطلوب ، أضف السيكلين الطازج إلى كل بئر وقم بتدوير صفيحة الثقافة برفق للخلط. بعد أسبوع من العلاج بالسيكلين, جمع الوسائط وإصلاح الخلايا في 500 ميكرولتر من البرد, 4٪ بارا فورمالديهايد لكل بئر في درجة حرارة الغرفة.

ثم اغسل كل بئر ثلاث مرات باستخدام PBS وقم بتخزين الأطباق على أربع درجات مئوية. لتصور خلايا GLO عن طريق كيمياء cyto المناعية ، استبدل PBS أولا بمخزن مؤقت مانع واحتضان الخلايا في درجة حرارة الغرفة. بعد ساعة ، احتضن الخلايا في الأمصال الأولية ضد علامة الخلايا الدبقية الصغيرة IO واحد لمدة ساعة واحدة على الأقل في درجة حرارة الغرفة ، ثم اغسل كل بئر ثلاث مرات في PBS لمدة خمس دقائق.

بعد احتضان الخلايا بالجسم المضاد الثانوي المترافق الفلوري المناسب ، قم بمضاد الخلايا باستخدام DAPI لتحديد النوى. ثم بعد غسل الخلايا كما هو موضح للتو ، استخدم وسيط التثبيت لتركيب كل زلة غطاء على شرائح مجهر فردية وعرض الشرائح على مجهر فلوري للتحليل البصري والكمي. لتقييم النشاط البلعمي للخلايا الدبقية الصغيرة المعالجة بالسيكلين بعد العلاج بالسيكلين ، ولكن قبل التثبيت ، أضف حبات اللاتكس المسماة ب FITC إلى كل ثقافة لخلايا G OID وفقا للشركة المصنعة والتعليمات.

بعد 48 ساعة ، قم بإصلاح الخلايا في PFA كما هو موضح للتو ، ثم قم بمعالجة الخلايا للكيمياء المناعية كما هو موضح. أخيرا ، قم بتقييم عدد الخلايا الدبقية الصغيرة الإيجابية التي تتشارك مع الخرزات المصنفة بالفلورسنت بواسطة الفحص المجهري المناعي الفلوري. يتيح تلطيخ الخلايا الدبقية الصغيرة باستخدام IO one جنبا إلى جنب مع صبغة مضادة نووية تحديد الخلايا الكبيرة المستديرة متعددة النوى.

لاحظ أنه في كثير من الحالات ، يعكس التضخم الإجمالي لحجم النواة الحالة متعددة النوى لهذه الخلايا كما لوحظ في هذه الصورة ، كما يثير علاج الإعصار تنشيطا معمما للخلايا الدبقية الصغيرة التي يمكن قياسها من خلال زيادة النشاط الحمضي PHA للخلايا الدبقية الصغيرة أحادية النواة ، بالإضافة إلى خلايا GLO متعددة النواة. كما لوحظ في هذه الصورة التمثيلية ، يمكن التعرف بسهولة على الملامح النشطة الحمضية ل IBO one microglia الإيجابية أثناء الزراعة المشتركة مع الخلايا السلفية قليلة التغصن. تمتد الآثار المترتبة على هذه التقنية نحو علاج GLD حيث أن تكوين هذه الخلايا متعددة النوى استجابة لعلاج السيكلين هو سمة مميزة لعلم الأمراض العصبية ل GLD ولم يتم استكشاف مساهمة هذه الخلايا في هذا المرض بهذه الطريقة من قبل.