جمع وعزل، وتحليل تدفق Cytometric العينات باطن عنق الرحم الإنسان

الهدف العام من هذا الإجراء هو عزل الخلايا أحادية النواة لعنق الرحم عن كشط باطن عنق الرحم باستخدام فرشاة سيتو. بمجرد عزلها ، يمكن استخدام هذه الخلايا في فحوصات متعددة ، بما في ذلك قياس التدفق الخلوي ، حيث يمكنك تحديد النمط الظاهري ووظيفة الخلايا المناعية في الجهاز التناسلي الأنثوي. يعد جمع عينات فرشاة السيتو وغسل عنق الرحم إجراء غير جراحي يجب إجراؤه من قبل طبيب أمراض النساء أو الطبيب المدرب.

يتم إجراء غسل مهبلي عنق الرحم أولا حيث يتم غسل باطن عنق الرحم بمطحنتين من PBS ، والتي يتم جمعها بعد ذلك من القب الخلفي بعد الغسيل. يتم وضع الطرف المقعر لمكشطة عنق الرحم مقابل عنق الرحم وتدويرها لأخذ عينات من فتحة عنق الرحم أو عظم الرحم. بعد ذلك ، يتم إدخال فرشاة cyto في نظام التشغيل Endocervical OS وتدويرها 360 درجة.

سيساعد استخدام الضغط اللطيف على ضمان عدم تلوث العينة بالدم. يتم تجميع فرشاة cyto في الكاشطة في أنبوب يحتوي على خمسة مل من PBS. بعد نقلها على الجليد ، تكون العينة دوامة بسرعة لفصل الخلايا عن فرشاة cyto.

بمجرد غسل العينات بالوسائط ، يتم ترشيحها بعد ذلك من خلال مرشح نايلون مائة ميكرون. هذا يسمح بجمع الخلايا الليمفاوية والخلايا الوحيدة والخلايا الظهارية من العينة. أصبحت الخلايا الآن جاهزة لتلطيخها بالأجسام المضادة ضد البروتينات السطحية ، وبمجرد إصلاحها ، يمكن تشغيلها على مقياس التدفق الخلوي.

سنوضح لك كيف نحلل البيانات الناتجة لتقييم النمط الظاهري لكل من الخلايا التائية الأربعة والقرصة الثمانية الموجودة في عنق الرحم. مرحبا ، أنا طالب دكتوراه في مختبر الدكتور كيث الشعبي. يركز بحثنا على العلاقة بين التنشيط المناعي وقابلية الإصابة بفيروس نقص المناعة البشرية بالإضافة إلى تطور المرض.

نظرا لأن غالبية الإصابات بفيروس نقص المناعة البشرية تحدث الآن من خلال الجماع بين الجنسين ، فنحن مهتمون أيضا بتحديد ارتباطات الحماية بانتقال فيروس نقص المناعة البشرية إلى الجهاز التناسلي الأنثوي. لسوء الحظ ، يمكن أن يكون جمع العينات من الجهاز التناسلي أمرا صعبا للغاية بالإضافة إلى أنه غازي إلى حد ما للمشاركين في الدراسة. يعد استخدام فرش cyto لجمع خلايا CMCs أو الخلايا أحادية النواة العنقية طريقة أسرع وأسهل مقارنة بالبروتوكولات الأخرى مثل الخزعات.

في هذا الفيديو ، سنوضح لك كيفية عزل وإعداد CMCs لاستخدامها في قياس التدفق الخلوي أو التطبيقات النهائية الأخرى. بعد التجميع ، يتم نقل فرشاة cyto ومكشطة في خمسة مل من PBS البارد. من المهم نقل العينات على الجليد حتى وقت المعالجة ، والذي يجب ألا يزيد عن ساعتين بعد جمع العينة.

يجب استبعاد أي عينات ملوثة بآثار الدم في هذه المرحلة الزمنية من مزيد من التحليل لفصل الخلايا عن فرشاة سيتو. قم بتدوير الأنبوب على ارتفاع لمدة 45 ثانية لأن الخلايا ستظل على فرشاة cyto ومكشطة. يجب إزالتها يدويا.

ارتد زوجا جديدا من القفازات واستخدم فرشاة cyto لكشط أي مادة متبقية من الكاشطة. بعد التخلص منه في محلول التبييض ، استخدم الإبهام والسبابة لإزالة جميع الخلايا المتبقية من فرشاة السيتو عن طريق الضغط لأعلى ولأسفل فوق أنبوب الصقر. بعد التخلص من فرشاة cyto ، قم بتغيير القفازات قبل تحضير عينة أخرى ، واستخدم ماصة نقل لغسل جوانب الأنبوب باستخدام PBS لضمان جمع كل العينة.

تناسب مائة ميكرون نايلون. قم بالتصفية فوق أنبوب فالكون جديد واستخدم الماصة لتصفية الحجم الكامل لمحلول PBS. أضف خمسة ميلات من وسائط RPMI التي تفتقر إلى FBS إلى الأنبوب الأصلي.

استخدم الماصة لغسل جوانب الأنبوب جيدا لإزالة أي مخاط أو حطام ملتصق. ثم انقل الوسائط من خلال الفلتر. استخدم بعض الوسائط المفلترة لغسل الجزء السفلي من الفلتر قبل التخلص منه في المبيض.

لتبيير الخلايا المعزولة. الطرد المركزي للعينات لمدة 10 دقائق عند 1500 دورة في الدقيقة لمنع الحبيبات من الإزاحة. تذكر إيقاف تشغيل فرامل الطرد المركزي إذا تم استخدام الخلايا لقياس التدفق الخلوي.

قم بإعداد محلول الحجب المطلوب لمنع ارتباط الأجسام المضادة غير المحدد. أثناء خطوة الطرد المركزي ، استخدم 100 ميكرولتر من محلول الحجب لكل عينة. يحتوي محلول الحظر على 93.2 ميكرولتر من الفاكس أو الغسيل أو PBS بالإضافة إلى 2٪ FBS وخمسة ميكرولتر من FBS و 1.8 ميكرولتر من IgG للفأر.

بعد الدوران ، سيكون لمعظم العينات ذات الخلايا القابلة للحياة حبيبات مرئية. في بعض الحالات ، ستكون الحبيبات كبيرة جدا. بينما في عينات أخرى قد يكون بالكاد مرئيا.

يرتبط حجم الحبيبات دائما بإنتاجية الخلية. بعناية لعدم تمكن من طافي التأكد من أنك لا تزعج الخلايا ، قم بإعادة تعليق الحبيبات عن طريق التحريض اللطيف. اغسل الخلايا بخمسة ميل من PBS وكرر الطرد المركزي لمدة 10 دقائق عند الساعة 1500.

سعر التجزئة الموصى به M مع القطع ، مرة أخرى ، صب المادة الطافية وإعادة تعليق الحبيبات كما كان من قبل. في هذه المرحلة ، تكون الخلايا جاهزة إما لتكون محفوظة بالتبريد أو ملطخة بالسطح قبل تلطيخها باستخدام الأجسام المضادة الفلورية ، من المفيد منع الارتباط غير المحدد عن طريق احتضان الخلايا بمحلول مانع تم تحضيره أثناء الطرد المركزي السابق. بعد إعادة تعليق حبيبات الخلية ، أضف مائة ميكرولتر من محلول الحجب إلى العينة واخلطها جيدا.

يمكن تنفيذ خطوات البروتوكول المتبقية إما في لوحة 96 بئر أو أنبوب فاكس. اعتمادا على حجم حبيبات CMC. انقل محلول الحجب وخليط الخلية إلى أنبوب فاكس.

احتضان العينة لمدة 10 دقائق عند أربع درجات مئوية. خلال الحضانة لمدة 10 دقائق ، قم بإعداد صبغة البقاء التي سيتم استخدامها للتمييز بين الخلايا الحية والميتة. أثناء تحليل البيانات ، قم بإعداد صبغة الجدوى وفقا للشركة المصنعة والمعايرة المسبقة حسب الحاجة.

تأكد من إبقاء خليط الصبغة مغطى من الضوء حتى يصبح جاهزا للاستخدام. بعد الحضانة لمدة 10 دقائق ، اغسل الخلايا ب 500 ميكرولتر من الفاكس ، أو اغسل أو PBS باستخدام 2٪ FBS ، ثم جهاز الطرد المركزي لمدة 10 دقائق عند 1600 دورة في الدقيقة. بعد الغزل ، قم بصب المادة الطافية من أنبوب الفاكس.

إعادة تعليق الخلايا عن طريق التحريض. أضف الآن الحجم المناسب لصبغة الجدوى التي تم إعدادها مسبقا. احتضان الخلايا لمدة 30 دقيقة عند أربع درجات مئوية تأكد من بقاء العينات مغطاة من الضوء عن طريق لفها بورق القصدير.

خلال هذه الحضانة ، يمكنك تحضير المزيج الرئيسي من الأجسام المضادة الفلورية التي سيتم استخدامها لتسمية الخلايا. تأكد من المعايرة مسبقا والتحقق من صحة الأجسام المضادة الخاصة بك على عينات التحكم في الدم المحيطية قبل استخدامها على CMCs. امزج الأجسام المضادة الممعايرة واجعلها تصل إلى الحجم النهائي مائة ميكرولتر لكل عينة.

باستخدام الفاكس ، اغسل ، احم جميع الأجسام المضادة من الضوء خلال هذه الخطوات. بعد الحضانة لمدة 30 دقيقة ، مرة أخرى ، اغسل العينة ب 500 ميكرولتر من الفاكس ، واغسلها ، وأجهزة الطرد المركزي ، وصب الخلايا ، وأعد تعليقها كما كان من قبل. حان الوقت الآن لاحتضان الخلايا ب 100 ميكرولتر من كوكتيل الأجسام المضادة المحضرة خلال الحضانة السابقة.

مرة أخرى ، احتضان العينات لمدة 30 دقيقة عند أربع درجات مئوية ، مع التأكد من حمايتها من الضوء. أصبحت CMCs المحتضنة جاهزة الآن للغسل ب 500 ميكرولتر من PBS للمرة الأخيرة. الطرد المركزي العينة عند 1600 دورة في الدقيقة لمدة 10 دقائق.

بعد الصب وتعليق الحبيبات ، قم بتخفيف الخلايا في حجم نهائي قدره 750 ميكرولتر في محلول بارالديهايد بنسبة 1٪. لإصلاحها ، من المهم إعادة تعليق الخلايا في هذا الحجم الكبير لمنع انسداد مقياس التدفق الخلوي. حتى في هذا الحجم ، قد يبدو أنبوب العينة غائما تماما.

احتفظ بالخلايا في الظلام عند أربع درجات مئوية حتى يتم اكتسابها على مقياس التدفق الخلوي. بالإضافة إلى عينة فرشاة cyto ، نجمع بشكل روتيني ملين من غسل PBS من عنق الرحم والمهبل. هذه العينة عبارة عن جهاز طرد مركزي عند 1400 دورة في الدقيقة لمدة سبع دقائق لإزالة الحطام الخلوي من الغسيل.

يمكن بعد ذلك تخصيص المادة الطافية المتبقية وتجميدها عند 80 درجة مئوية تحت الصفر للتحليل المستقبلي لتركيز البروتين القابل للذوبان. يمكن أن تكون هذه البيانات مفيدة بشكل خاص بالاقتران مع بيانات النمط الظاهري الخلوي التي تم الحصول عليها عن طريق قياس التدفق الخلوي. قبل تشغيل نموذج CMC الخاص بك.

من المفيد إعداد أدوات التحكم PBMC للمساعدة في أنابيب تعويض تشغيل البوابات ، باستخدام الخرز أو خلايا البقع المفردة من أجل ضبط التداخل الطيفي. احصل على أنبوب CMC بالكامل لجمع جميع الأحداث مقارنة بعينات PBMC. ستظهر CMCs المزيد من الزوجيات في منطقة FSC مقابل مخطط الارتفاع وقد لا تظهر مجموعة خلايا ليمفاوية مميزة مثل pbmc.

بعد الحصول على عيناتك ، قم بتصدير الملفات لتحليلها في برنامج مثل FlowJo. سنعرض هنا المكونات الرئيسية لاستراتيجية البوابات النموذجية ل CMC المشتقة من القرص المضغوط أربع خلايا موجبة و CD ثمانية خلايا تائية موجبة. استخدم منطقة FSC مقابل مخطط الارتفاع إلى G على المفردات في العينة.

في هذه المقارنة المتطابقة ، يمكنك أن ترى بوضوح العدد المتزايد من الزوجات في عينة CMC مقارنة ب p BMCs. بعد ذلك ، يعد رسم علامة الفلورسنت أو FSC مقابل الوقت بمثابة خطوة لمراقبة الجودة. إذا أدخلت أي تغييرات في معدل التدفق البيانات الاصطناعية في البيانات، فيمكن إزالتها في هذه الخطوة.

في الجزء العلوي ، يمكنك رؤية ملف تعريف مضان ثابت بمرور الوقت يشير إلى عينة عالية الجودة. أدناه يمكنك رؤية عينة ذات انقطاعات متعددة ومعدل تدفق ، والتي يمكن استبعادها من مزيد من التحليل. قد يكون تحديد مجموعات الخلايا الليمفاوية في عينات CMC أمرا صعبا.

سيساعد استخدام التحكم A-P-B-M-C في وضع المشي. كما ترون ، تظهر بعض العينات مجموعات كبيرة واضحة بينما تفتقر العينات الأخرى إلى مجموعات الخلايا الليمفاوية. إجمالا ، يجب استبعاد هذه العينات.

على الرغم من أننا سنركز على مجموعات الخلايا الليمفاوية. من الممكن أيضا استخدام الخلايا الوحيدة عن طريق البوابات على الخلايا التي تفتقر إلى التعبير عن علامات النسب. من الممكن تحديد الخلايا التي تعبر عن مجموعات من الخلايا المتغصنة وعلامات الخلايا الأحادية مثل CD 16 و CD 11 C.يعد تضمين علامة أو صبغة قابلية للحياة أمرا بالغ الأهمية لتحليل CMC حتى على الخلايا الطازجة.

كما ترون ، فإن غالبية الخلايا الليمفاوية CMC قابلة للحياة ، لكن بعض العينات تحتوي على ترددات عالية من الخلايا الميتة التي يجب استبعادها من التحليل. قد تمتص الخلايا الميتة الأجسام المضادة بشكل غير محدد وتربك تحليل البيانات داخل مشية الخلايا الليمفاوية. يجب أن يكون تلطيخ القرص المضغوط ثلاثة قويا.

نسبة الخلايا التائية الموجبة المضغوطة الثلاثة أقل وأكثر تنوعا مما هي عليه في عينات PBMC ، وهذا هو السبب في أنه من الأهمية بمكان الحصول على عينة CMC بأكملها وزيادة عدد الأحداث التي تم جمعها. يمكن تحديد مجموعات الخلايا التائية الأربعة موجبة و CD الثمانية موجبة تماما كما هو الحال في عينات TBMC. في بعض عينات CMC.

نسبة القرص المضغوط أربعة إلى ثمانية أقل مما لوحظ في الدم المحيطي ويظهر بعض الأفراد مجموعة كبيرة من الخلايا التائية السالبة المزدوجة. بعد تحديد القرص المضغوط أربعة مجموعات إيجابية و ثمانية خلايا تائية إيجابية ، من الممكن تحديد التعبير عن العديد من علامات النمط الظاهري. على الرغم من أنه يمكن اكتشاف تعبير CD 1 61 في CMCs ، إلا أن مجموعة CD 1 61 الساطعة التي تظهر في الدم غائبة في الجهاز التناسلي.

وبالمثل ، يمكن قياس التعبير عن علامات التنشيط مثل CD 69 و H-L-A-D-R ، بالإضافة إلى علامات مثل CCR five و PD one بشكل موثوق بين عينات CMC وقياسها كميا. يسمح لنا استخدام عينات فرشاة cyto بتوصيف كل من النمط الظاهري ووظيفة الخلايا المناعية المخاطية ، خاصة في سياق الأمراض المعدية. لا يمنحنا هذا نظرة ثاقبة على الآليات التي تنظم علم المناعة المخاطية والتناسلية فحسب ، بل يوفر أيضا الأساس لتطوير مقاييس جديدة لفعالية لقاح الغشاء المخاطي.