Name: عزل بروتين من الفأر الجنينية القلب صمام منطقة نامية (فيديو) | JoVE Journal
Uploaded: 2014-09-23T14:00:00.000+00:00
Duration: 6 min 55 s
Description: تعلم عزل بروتين من صمامات القلب الجنينية للفأر باستخدام تقنية التحليل الكيميائي الغربي. تساعد هذه الطريقة الباحثين على دراسة التعبير البروتيني في الأنسجة الصغيرة بدقة عالية.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

نود أن نشكر أندريا بورتبري ودافين تاونلي تيلسون على القراءة النقدية للمخطوطة والمعاهد الوطنية للصحة (المنحة # R01HL061656) لتمويل الدعم.

ملاحظة: تمت الموافقة على جميع التجارب من قبل لجنة رعاية واستخدام الحيوان المؤسسي في جامعة كارولينا الشمالية في تشابل هيل. 1. المكوس الصمام الأبهري <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> باستخدام تقنية القتل الرحيم المعتمدة للمرحلة الجنينية من الفائدة، الموت ببطء ماوس حاملا مع الجراء في اليوم الجنينية المطلوب (E) للتنمية. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> استخدام الايثانول 70٪ لتعقيم البطن للإناث الحوامل. رفع الجلد وعضلات أسفل البطن وحتى بعيدا عن الأعضاء الداخلية، وتشريح تجويف أسفل البطن مفتوحة الأنثى للسماح بالوصول إلى قرن الرحم. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> لاسترداد قرن الرحم، عنق الرحم عقد مع ملقط وقطع بعناية الذيلية إلى ملقط. رفع قرن الرحم، وقطع أي نوع من الأنسجة الضامة التي تحافظ على القرن في مكان، وإتمام إزالة بقطع تقاطع قرن الرحم مع قناة البيض. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> وضع قرن الرحم تشريح في طبق بتري تحتوي على عمودد 0.1 M تريس العازلة (درجة الحموضة 7.6) وشطف حسب الحاجة. ثم، وقطع قرن الرحم مفتوح طول الحكمة لفضح الحويصلات الجنينية. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> للكشف عن الجنين، وقطع فتح الكيس الجنيني عند تقاطع المشيمة والجنين وقطع الأوعية الدموية السرية لتحرير الجنين. وضع الجنين تشريح في طبق بيتري الثاني مع بارد 0.1 M تريس العازلة. يعود أول طبق بيتري مع باقي الأجنة لundissected الجليد حتى جاهزة للجنين المقبل. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> لتحسين فرص الحصول جدار الصدر داخل الجنين، قطع رأس الجنين. إذا التنميط الجيني ضروري، وإزالة وحفظ قطعة النسيج إضافية في أنبوب إيبندورف وضعت على الجليد. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> وضع الجنين على ظهرها، وقطع جدار الصدر عموديا على طول الجانب من القفص الصدري، بالقرب من forelimb، وأفقيا فوق الحجاب الحاجز لتصور القلب. ثم فتح جدار الصدر لفضح القلب. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> باستخدام ملقط لنرفع عاليا على طول الأوعية الدموية الكبرى، ورفع القلب باستخدام ملقط وقطع الأوعية أدناه. ون، وقطع فوق ملقط لتحرير القلب. إذا بقيت الأوعية الرئوية غير المصقول، قد تتم إزالة الرئتين مع القلب ويجب إزالتها قبل المتابعة. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> قطع وإزالة الشريان الرئوي فوق مستوى صمام. في المراحل الجنينية الموصوفة هنا، الشريان الرئوي هو معتم قليلا، والذي يساعد في تمييز لها من منطقة صمام. قطع أسفل صمام الرئوي، وتجنب عضلة القلب البطيني trabeculated وجمع كما هو موضح في الخطوة 1.10 إذا هذه المنطقة هي أيضا من الفائدة. وهنا في الخطوة التالية، استخدام العمل الشعري لرسم عازلة تريس الزائدة بعيدا عن منطقة الفائدة قبل جمع في تحلل العازلة. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> إزالة بعناية الأبهر القاصي إلى الصمام الأبهري، وذلك فوق مستوى صمام. مثل الشريان الرئوي، لا يزال الشريان الأورطي مبهمة قليلا في هذه المراحل الجنينية، والمساعدة في زواله. مجرد قطع تحت الصمام الأبهري، ومرة ​​أخرى تجنب عضلة القلب البطيني trabeculated، ونقلصمام باستخدام ملقط لأنبوب إيبندورف مع 2 ميكرولتر تحلل العازلة (موضح في الجدول المواد) التي تحتوي على الأنزيم البروتيني والفوسفاتيز مثبطات على الجليد. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> كرر الخطوات 1،6-1،10 حتى يتم رفعه الصمامات من جميع الأجنة، وجمع كل صمام في أنبوب إيبندورف منفصل. إذا كان كل الأجنة لديها نفس التركيب الوراثي، يمكن جمع جميع الصمامات في أنبوب إيبندورف واحد. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> إذا التنميط الجيني التي يتعين القيام بها لتحديد الصمامات لتجميع، ضع على الفور العينات في تحلل العازلة في -80 درجة مئوية حتى استخدامها مرة أخرى. ويمكن بعد ذلك يتم تجميع العينات بعد التنميط الجيني (الخطوة 2.1.1). </li></ol> استخراج البروتين 2. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ذوبان الجليد الأنسجة التي تم جمعها على الجليد وأجهزة الطرد المركزي في 13،100 x ج لمدة 1 دقيقة لجمع الأنسجة العازلة في تحلل في أسفل الأنبوب. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> إذا كانت مرمزة الأجنة، استخدم ماصة لجمع بلطف وتجمع المخزن المؤقت تحلل تحتوي على مناطق صمام من الأجنة مع الأنماط الجينية مماثلة. لضمان ب قويةو، وتجميع صمام 3-4 المناطق من أجنة E13.5 لكل يوصى العينة. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> إذا كانت جميع الأجنة من نفس النمط الجيني وجمعت جميع المناطق صمام معا في الخطوة 1.10، ليز العينة بأكملها، كما هو موضح في الخطوة 2.2. </li></ol></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> تحقق من حجم العينة المجمعة الناتجة عنها، وإضافة العازلة تحلل إلى إجمالي حجم 40 ميكرولتر. ثم، وتعطيل والتجانس العينات باستخدام حبات الفولاذ المقاوم للصدأ 5 ملم في أنابيب إيبندورف. تشغيل ايزر لمدة 2-4 دقائق عند 50 هرتز، وفقا لتعليمات الشركة المصنعة. تدور الأنابيب لفترة وجيزة، (~ 13،100 x ج لمدة 1 دقيقة)، ونقل العينات إلى أنابيب جديدة، مخلفين وراءهم حطام غير قابلة للذوبان. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> إعداد وعينات منفصلة للSDS-PAGE ونقل لاحقا تحليل لطخة الغربي، بعد بروتوكول مثل اسلامي وآخرون 9. النشاف لبروتين السيطرة تحميل ضروري لالبروتين الكمي. </li></ol>

<ol><li>Wirrig, E. E., Hinton, R. B., Yutzey, K. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Differential+expression+of+cartilage+and+bone-related+proteins+in+pediatric+and+adult+diseased+aortic+valves%5BTitle%5D)+AND+%22J+Mol+Cell+Cardiol%22%5BJournal%5D)">Differential expression of cartilage and bone-related proteins in pediatric and adult diseased aortic valves.</a> J Mol Cell Cardiol. 50, 561-569 (2011).</li>
<li>Chakraborty, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Twist1+promotes+heart+valve+cell+proliferation+and+extracellular+matrix+gene+expression+during+development+in+vivo+and+is+expressed+in+human+diseased+aortic+valves%5BTitle%5D)+AND+%22Dev+Biol%22%5BJournal%5D)">Twist1 promotes heart valve cell proliferation and extracellular matrix gene expression during development in vivo and is expressed in human diseased aortic valves.</a> Dev Biol. 347, 167-179 (2010).</li>
<li>Lee, M. P., Yutzey, K. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Twist1+directly+regulates+genes+that+promote+cell+proliferation+and+migration+in+developing+heart+valves%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">Twist1 directly regulates genes that promote cell proliferation and migration in developing heart valves.</a> PLoS One. 6 (e29758), (2011).</li>
<li>Peacock, J. D., Huk, D. J., Ediriweera, H. N., Lincoln, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Sox9+transcriptionally+represses+Spp1+to+prevent+matrix+mineralization+in+maturing+heart+valves+and+chondrocytes%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">Sox9 transcriptionally represses Spp1 to prevent matrix mineralization in maturing heart valves and chondrocytes.</a> PLoS One. 6 (e26769), (2011).</li>
<li>Chakraborty, S., Cheek, J., Sakthivel, B., Aronow, B. J., Yutzey, K. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Shared+gene+expression+profiles+in+developing+heart+valves+and+osteoblast+progenitor+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Physiol+Genomics%22%5BJournal%5D)">Shared gene expression profiles in developing heart valves and osteoblast progenitor cells.</a> Physiol Genomics. 35, 75-85 (2008).</li>
<li>Vogel, C., Marcotte, E. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Insights+into+the+regulation+of+protein+abundance+from+proteomic+and+transcriptomic+analyses%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Rev+Genet%22%5BJournal%5D)">Insights into the regulation of protein abundance from proteomic and transcriptomic analyses.</a> Nat Rev Genet. 13, 227-232 (2012).</li>
<li>Meng, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Expression+of+functional+Toll-like+receptors+2+and+4+in+human+aortic+valve+interstitial+cells%3A+potential+roles+in+aortic+valve+inflammation+and+stenosis%5BTitle%5D)+AND+%22Am+J+Physiol+Cell+Physiol%22%5BJournal%5D)">Expression of functional Toll-like receptors 2 and 4 in human aortic valve interstitial cells: potential roles in aortic valve inflammation and stenosis.</a> Am J Physiol Cell Physiol. 294, 29-35 (2008).</li>
<li>Dyer, L. A., Wu, Y., Moser, M., Patterson, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((BMPER-induced+BMP+signaling+promotes+coronary+artery+remodeling%5BTitle%5D)+AND+%22Developmental+Biology%22%5BJournal%5D)">BMPER-induced BMP signaling promotes coronary artery remodeling.</a> Developmental Biology. 386, 385-394 (2014).</li>
<li>Eslami, A., Lujan, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Western+blotting%3A+sample+preparation+to+detection%5BTitle%5D)+AND+%22J+Vis+Exp%22%5BJournal%5D)">Western blotting: sample preparation to detection.</a> J Vis Exp. (44), (2010).</li>
<li>Garside, V. C., Chang, A. C., Karsan, A., Hoodless, P. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Co-ordinating+Notch%2C+BMP%2C+and+TGF-beta+signaling+during+heart+valve+development%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Mol+Life+Sci%22%5BJournal%5D)">Co-ordinating Notch, BMP, and TGF-beta signaling during heart valve development.</a> Cell Mol Life Sci. 70, 2899-2917 (2013).</li>
<li>Jiang, X., Rowitch, D. H., Soriano, P., McMahon, A. P., Sucov, H. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fate+of+the+mammalian+cardiac+neural%5BTitle%5D)+AND+%22Development%22%5BJournal%5D)">Fate of the mammalian cardiac neural.</a> Development. 127, 1607-1616 (2000).</li>
<li>Scherptong, R. W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Morphogenesis+of+outflow+tract+rotation+during+cardiac+development%3A+the+pulmonary+push+concept%5BTitle%5D)+AND+%22Dev+Dyn%22%5BJournal%5D)">Morphogenesis of outflow tract rotation during cardiac development: the pulmonary push concept.</a> Dev Dyn. 241, 1413-1422 (2012).</li>
<li>Mohler, E. R., Adam 3rd, L. P., McClelland, P., Graham, L., Hathaway, D. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Detection+of+osteopontin+in+calcified+human+aortic+valves%5BTitle%5D)+AND+%22Arterioscler+Thromb+Vasc+Biol%22%5BJournal%5D)">Detection of osteopontin in calcified human aortic valves.</a> Arterioscler Thromb Vasc Biol. 17, 547-552 (1997).</li>
</ol>

ليس لدى المؤلفين ما يكشفون عنه.

القدرة على قياس مستويات البروتين في أوائل الفأر الجنينية وكتكوت المناطق صمام القلب توفر أداة إضافية لفهم الأحداث الإشارات الخلوية الحرجة للتنمية صمام. لدينا بروتوكول الموصوفة هنا لا تختلف كثيرا من إجراءات عزل بروتين القياسية. ومع ذلك، عن طريق تعديل بعض الخطوات الرئيسية، التي حصلنا عليها بنجاح البروتينات فسفرته من أحجام عينة صغيرة للغاية. لتحقيق هذه النتيجة، والخطوات التالية هي ذات أهمية خاصة. لضمان الحصول على جودة البروتين، من الأهمية بمكان للحفاظ على عينات مبردة، سواء على الجليد ...

أن تكون قادرة على تحديد وقياس مستويات البروتين التعبير هو أسلوب القياسية لالحيواني والتجارب القائمة على الخلية. ومع ذلك، على الرغم من الفائدة في وقت مبكر الجنينية تطوير صمام القلب، وتقييم البروتين التعبير في هذا النسيج محددة خلال تطوير يقتصر حاليا على المناعية في كل من الفرخ والفأر 1،2 طويل الأمد. جزء من صعوبة تحديد كمية البروتين التعبير في صمامات تطوير معظم الكائنات نموذج (مثل الفرخ والفأر) هو صغر حجم الصمامات، مما يحد من كمية البروتين التي يمكن الحصول عليها. وهكذا، على التحليلات الكمية، يعتمد الباحثون عادة على استخراج الحمض النووي الريبي والتضخيم PCR الكمي لاحقة أو تحليل ميكروأري 2-5. ومع ذلك، RNA والبروتين مستويات التعبير ليست المترابطة 6 بالكامل، بحيث يمكن التركيز على التعبير RNA لا توفر حساب دقيق للتغيرات العديدة التي تحدث في أي إشارات معينةالمسار في أوقات مختلفة خلال التطورات. واستنادا إلى هذا الحد في المنهجية المتاحة حاليا، وكان الهدف من هذا الإجراء لوضع بروتوكول للحصول موثوق كميات كافية من البروتين من الفأر الجنينية المناطق صمام القلب النامية من أجل التحليل الكمي للتغيرات التي تحدث في مختلف مسارات الإشارات التي تعتبر مهمة في نضوج هذا النسيج. وبالفعل تشريح الصمامات عادة من الفئران الجنينية لعزل الحمض النووي الريبي وتحليل الجينات لاحق التعبير 2-5. ولكن هذه الدراسات اقتصرت على استخدام التعبير الجيني باعتبارها من قراءة إشارات من تفعيل المسار، والتي لا تسمح للكشف عن الكشف عن تعديلات البروتين بعد متعدية التي قد تؤثر إشارات المصب. باستخدام تقنيات العزل RNA كنقطة انطلاق، بدأنا مع تشريح المناطق ذات الأهمية. لأن مصلحتنا تم الكشف عن البروتينات فسفرته التي كانت مؤشرا يدل باتالنشاط hway خلال فترة محددة من تطوير الصمام الأورطي (E13.5-14.5)، أجرينا كل تشريح خالية من الفوسفات في تريس العازلة وجمع الصمامات في تحلل العازلة على أساس تريس، مع الفوسفاتيز ومثبطات الأنزيم البروتيني. في حالتنا هذه، تم جمع المناطق صمام الأبهري فقط، ولكن يمكن بسهولة الحصول عليها المنطقة صمام رئوي في نفس الوقت. كانت المناطق صمام ثم متجانسة وجنبا إلى جنب مع عينة العازلة التي تستخدم حاليا لدراسة التعبير البروتين في صمامات القلب الكبار 7. باستخدام وحدات التخزين عينة صغيرة (على سبيل المثال، 2 ميكرولتر) وتجميع صمام المناطق من أجنة بنفس النمط الجيني، تمكنا من الكشف عن بروتينات فسفرته وnonphosphorylated في اليوم الجنينية 13.5 8. لأن المناطق صمام يمكن تجميدها وتخزينها في المخزن تحلل، يمكن التنميط الجيني لأجنة إذا لزم الأمر قبل تجميع. هذه التقنية يوسع مجموعة من الأدوات المتوفرة لتقييم signalin خليةز مسارات خلال تطوير وتقدم مجاملة الكمية لالمناعية، وتحديدا لصمامات القلب النامية. وينبغي أن يكون هذا الأسلوب مفيدا ليس فقط لأطباء القلب التنموية ولكن أيضا لجميع علماء البيولوجيا التطورية الذين يعملون مع الأجنة مرحلة مبكرة يرغبون في المناطق التي تحتوي على الأنسجة محدودة.

<table><tbody><tr><td>فأر</td><td></td><td></td> حامل موقوت <td>ليتم تشريحه في المرحلة الجنينية من الاهتمام</td></tr><tr><td>المجهر المجهر المجسم</td><td>نيكون</td><td>SMZ645</td><td></td></tr><tr><td>0.1 M تريس ، درجة الحموضة 7.6</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>مقص</td> دقيق <td>أدوات العلوم الدقيقة</td><td>15003-08</td><td></td></tr><tr><td>ملقط دقيق ، # 5</td><td>أدوات العلوم الدقيقة</td><td>11251-30</td><td></td></tr><tr><td>إبرة تشريح حاملي</td><td>شركة تيد بيلا</td><td>13560</td><td></td></tr><tr><td>تشريح الإبر</td><td>شركة تيد بيلا</td><td>13561-10</td><td></td></tr><tr><td>ماصة دقيقة, 20 & mu; ل ، مع نصائح</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>عازلة</td><td></td><td></td> التحلل <td>50 ملي Tris-HCl ، درجة الحموضة 7.5 ، 150 ملي كلوريد الصوديوم ، 5 ملي EDTA ، 1٪ تريتون</td></tr><tr><td>فوسستوب</td><td>روش</td><td>4906845001</td><td>أضف 1 قرص إلى 10 مل عازلة التحلل</td></tr><tr><td>TissueLyser LT</td><td>Qiagen</td><td>85600</td><td></td></tr><tr><td>حبات الفولاذ المقاوم للصدأ</td><td>Qiagen</td><td>69989</td><td></td></tr> أجهزة <tr><td>الطرد</td><td></td><td></td><td></td> المركزي</tr> الدقيقة</tbody></table>

عزل بروتين من الفأر الجنينية القلب صمام منطقة نامية

Protein Isolation from the Developing Embryonic Mouse Heart Valve Region

تحليل اللطخة الغربية هو أسلوب شائع الاستخدام للكشف عن مستويات البروتين وقياسها. ومع ذلك ، بالنسبة لعينات الأنسجة الصغيرة ، قد لا تكون طريقة التحليل هذه حساسة بما يكفي للكشف عن البروتين ذي الأهمية. للتغلب على هذه الصعوبات ، قمنا بفحص بروتوكولات الحصول على البروتين من صمامات القلب البشرية البالغة وقمنا بتعديل هذه البروتوكولات لنظرائهم في الفئران الجنينية المبكرة. باختصار ، يتم جمع مناطق الصمام الأبهري الجنيني للفأر ، بما في ذلك الصمام الأبهري وجدار الأبهر المحيط به ، في أقل حجم ممكن من مخزن التحلل القائم على تريس مع مثبطات الإنزيم البروتيني. إذا لزم الأمر بناء على استراتيجية التكاثر ، يتم تنميط الأجنة جينيا قبل تجميع أربع مناطق للصمام الأبهري الجنيني للتجانس. بعد التجانس ، يتم استخدام مخزن مؤقت للعينة المستند إلى SDS لتغيير طبيعة العينة للتشغيل على هلام SDS-PAGE وتحليل اللطخة الغربية اللاحقة. على الرغم من أن تركيز البروتين لا يزال منخفضا جدا بحيث لا يمكن تحديده باستخدام فحوصات القياس الكمي للبروتين الطيفي ووجود عينة متبقية للتحليلات اللاحقة ، إلا أنه يمكن استخدام هذه التقنية لاكتشاف البروتينات المفسفرة وشبه كميتها بنجاح عبر اللطخة الغربية من عينات مجمعة لأربع مناطق جنينية للصمام الأبهري للفأر 13.5 ، ينتج كل منها ما يقرب من 1 ميكروغرام من البروتين. ستكون هذه التقنية مفيدة لدراسة تنشيط مسار إشارات الخلية ومستويات التعبير عن البروتين أثناء التطور المبكر لصمام الفأر الجنيني.

باستخدام هذه التقنية إعداد، تمكنا من كشف فسفرته لل Smad 1،5،8 (pSmad) في مناطق الصمام الأورطي واحدة من E13.5 الأجنة. كما هو مبين في الشكل 1A، البروتين معزولة حتى من منطقة صمام واحدة كافية لكشف عصابة pSmad باهتة. كثافة إشارة تزيد نسبيا إلى عدد من المناطق صمام التي يتم تجميعها. الأهم من ذلك، لا تزال pSmad / β-أكتين نسبة ثابتة تقريبا في جميع أنحاء أحجام العينات المختلفة (الشكل 1C). نظرا لانخفاض مستويات البروتين المتاحة، نفس وصمة عار لا يمك...

تم إعاقة تحليل تعبير البروتين في صمامات الفأر الجنينية الصغيرة بسبب الأنسجة المحدودة المتاحة. توفر هذه المخطوطة بروتوكولا لإعداد البروتين من تطوير مناطق صمام الفأر الجنيني لتحليل اللطخة الغربية.

Western blot analysis is a commonly employed technique for detecting and quantifying protein levels. However, for small tissue samples, this analysis ...

الهدف العام من هذا الإجراء هو عزل واستخراج البروتين من صمامات القلب الجنينية. يتم تحقيق ذلك عن طريق عزل الجنين أولا عن الفأر الحامل. في الخطوة الثانية ، يتم تشريح القلب من الجنين ، ثم يتم جمع صمامات القلب في الخطوة الأخيرة.يتم تحلل الأنسجة ويتم تحضير عينة البروتين الناتجة للتحليل اللاحق. في النهاية ، يمكن استخدام تحليل BLO الغربي لتقييم مستويات التعبير عن البروتين. يعد العرض المرئي لهذه الطريقة أمرا بالغ الأهمية حيث يصعب تعلم خطوات التشريح بسبب الشكل المضغوط الصغير للقلب النامي.في اليوم الجنيني المطلوب من التطور ، استخدم 70٪ من الإيثانول لتعقيم بطن الأنثى الحامل. ثم ارفع جلد وعضلات أسفل البطن لأعلى وبعيدا عن الأعضاء الداخلية ، وقم بتشريح تجويف أسفل البطن للسماح بالوصول إلى قرن الرحم. بعد ذلك ، أمسك عنق الرحم بالملقط وقم بقص التدليل بعناية على الأطراف.ثم ارفع قرن الرحم لقطع أي نسيج ضام يحافظ على القرن في مكانه ، واستكمل الإزالة عن طريق قطع تقاطع قرن الرحم مع uct. ضعي قرن الرحم المقطوع في طبق بتري يحتوي على عازلة باردة 0.1 مولار وشطفها حسب الحاجة. ثم قطع قرن الرحم.افتح بالطول لكشف الأكياس الجنينية. لفضح الجنين ، افتح كيسا جنينيا عند تقاطع المشيمة والجنين ، واقطع الأوعية السرية لتحرير الجنين. ضع الجنين المقطوع في طبق بتري ثان مع محلول بارد 0.1 مولار ، وأعد طبق بتري الأول مع الأجنة المتبقية التي تم تشريحها إلى الجليد حتى التشريح الجنيني التالي.بعد قطع الرأس ، ضع الجنين على ظهره واقطع جدار الصدر عموديا على طول جانب القفص الصدري بالقرب من العرج وأفقيا فوق الحجاب الحاجز. لتصور القلب ، افتح جدار الصدر. ثم امسك الملقط عاليا على طول الأوعية الكبيرة ، وارفع القلب واقطع الأوعية أدناه.بعد ذلك ، قم بقص فوق الملقط لتحرير القلب. إذا ظلت الأوعية الرئوية غير مقطوعة ، فقم بإزالة الرئتين بالقلب قبل الاستمرار في المراحل الجنينية الموضحة هنا ، يكون الشريان الرئوي معتما قليلا. بعد تحديد الشريان ، قم بقصه وإزالته فوق مستوى الصمام.الآن ، قم بقص أسفل الصمام الرئوي مباشرة ، وتجنب عضلة القلب البطينية في مرحلة الطفولة المبكرة ، وقم بإزالة المخزن المؤقت الزائد بعيدا عن منطقة الاهتمام. قبل وضع الصمام في أنبوب einor يحتوي على ميكرولترين من محلول التحلل مثل الشريان الرئوي ، سيبدو الشريان الأورطي معتما قليلا. بعد تحديده ، قم بقص أسفل الصمام الأبهري مباشرة.مرة أخرى ، تجنب عضلة القلب البطينية المربقة. قم بإزالة أي محلول ثلاثي زائد ، ثم انقل الصمام إلى أنبوب einor الذي يحتوي على التحلل والمخزن المؤقت وأنسجة الشريان الرئوي. بعد جمع كل الأنسجة ، ضع العينات على الفور عند 80 درجة مئوية تحت الصفر حتى أبعد من ذلك.استخدمه لاستخراج البروتين ، وقم بإذابة الأنسجة المجمعة على الجليد ، ثم قم بتقطيع العينات لمدة دقيقة واحدة عند 13 ، 100 جي عند أربع درجات مئوية. تحقق من حجم العينة الناتجة واستخدم مخزن التحلل ليصل الحجم الإجمالي إلى 40 ميكرولترا. ثم أضف حبات من الفولاذ المقاوم للصدأ بخمسة ملليمترات لتعطيل العينات وتجانسها في lyr لمدة دقيقتين إلى أربع دقائق عند 50 هرتز ، وفقا لتعليمات الشركة المصنعة.بعد التجانس ، قم بتدوير الأنابيب لفترة وجيزة ونقل العينات إلى أنابيب جديدة ، تاركا وراءها الحطام غير القابل للذوبان لمزيد من التحليل التجريبي. باستخدام تقنية التحضير هذه ، يمكن اكتشاف smad الفسفوري 1 5 8 في مناطق الصمام الأبهري الفردي من أجنة E 13.5. على سبيل المثال ، البروتين المعزول حتى من منطقة صمام واحدة كاف للكشف عن نطاق p smad باهت مع زيادة شدة الإشارة بشكل متناسب مع عدد مناطق الصمامات المجمعة.الأهم من ذلك ، أن نسبة الأكتين p smad beta تظل ثابتة بوضوح عبر أحجام العينات المختلفة نظرا لانخفاض مستويات البروتين المتاحة ، ولا يمكن تجريد نفس اللطخة وإعادة فحصها بحثا عن إجمالي smad. ومع ذلك ، فإن بقعة منفصلة تظهر إجمالي smad one و beta actin تظهر نفس نمط التعبير. تخلو مناطق الصمامات هذه بالكامل تقريبا من تلوث عضلة القلب البطينية باستخدام تقنية التحضير هذه بالاشتراك مع عينات من البطين الأيمن ، وعلامة عضلة القلب البطينية ، ولا يمكن اكتشاف NP في مناطق الصمام الأبهري ، بينما يتم اكتشاف هذه العلامة بسهولة في البطين.علاوة على ذلك ، يمكن أيضا اكتشاف سلسلة ضوء الميوسين الخفيفة لعلامة عضلة القلب البطينية Two V بسهولة في العينة البطينية ، ولكن بالكاد يمكن اكتشافها في مناطق الصمام الأبهري مما يؤكد دقة التسلخ بعد هذا التشريح. يمكن إجراء mes أخرى مثل QPCR أو RN AIC من أجل الإجابة على أسئلة إضافية مثل الجينات النهائية التي تتأثر خلال خطوات النمو المختلفة.

protein-isolation-from-developing-embryonic-mouse-heart-valve

Research

JoVE Journal

Biology

علم الأحياء

هذه المادة سوف توفر وسيلة لعزل وزراعة السمان أو الدجاج...

العزلة وثقافة الطيور الجنينية الخلايا الاصلية صمامي

في هذا البروتوكول، ث ه التعرف على السكان رواية من خلايا تشبه الخلايا الصباغية (المعروف أيضا باسم الخلايا الصباغية القلب) في قلوب الفئران والبشر التي تساهم في عدم انتظام ضربات القلب الأذيني يتسبب في الفئران.

عزل الخلايا الصباغية تشبه الأولية من القلب ماوس

في هذا الفيديو ، نوضح عزل الخلايا الخلالية للصمام الأبهري عن قلب الفأر البالغ باستخدام إجراء كولاجيناز من خطوتين وثقافتها اللاحقة في حجم منخفض من وسائط النمو.

عزل الخلايا الخلالية لصمام الفأر: طريقة إنزيمية لعزل واستزراع VICs من الصمام الأبهري للفأر

ثقافة الخلية الأولية هي تقنية مفيدة لتحليل فئات معينة من السكان من الخلايا، لا سيما من أجنة الفئران المعدلة وراثيا في مراحل نمو محددة. هنا، يتم تشريح البطينين الجنينية وفصلها، والخرز الأجسام المضادة، مترافق الاعتراف وفصل الخلايا البطانية لمزيد من التحليل.

عزلة الجنينية البطيني الخلايا البطانية

تعد القدرة على عزل الخلايا البطانية لصمام القلب (VECs) أمرا بالغ الأهمية لفهم آليات تطوير الصمام وصيانته ومرضه.  نصف هنا عزل VECs عن الفئران الجنينية والبالغة Tie2-GFP باستخدام FACS الذي سيسمح بإجراء دراسات تحدد مساهمة VECs في عمليات النمو والمرض.

عزل خلايا الفئران صمام غشائي

يصف هذا البروتوكول طريقة خطوة بخطوة للعزل القابل للتكرار والثقافة طويلة الأمد لخلايا عضلة القلب في الفئران البالغة ذات الغلة العالية والنقاء والجدوى.

العزلة والثقافة وتنبيغ الخلايا العضلية ماوس الكبار

في المختبر يمكن استخدام نماذج تولد الأوعية التاجية لاكتشاف الآليات الخلوية والجزيئية لتولد الأوعية التاجية. في المختبر الثقافات الاستئصالية من الأنسجة الودينة والشغاف تظهر نموا قويا استجابة لVEGF-A وعرض نمط مماثل من التعبير COUP-TFII كما هو الحال في الجسم الحي.

في المختبر نموذج الأوعية التاجية

طورنا طريقة simple لعزل خلايا قلب الفأر الفردية عالية الجودة عن طريق تقنية التشويش المسبق. هذه الطريقة خالية من Langendorff ومفيدة لعزل الخلايا العضلية البطينية والأبطية أو الخلايا الخلالية ، مثل الخلايا الليفية القلبية أو السلف.

طريقة ال perfusion أنتيغراد لعزل القلب من الفئران

توضح هذه المقالة عزل خلايا الصمام الأبهري للفأرة بواسطة إجراء كولاجيناز من خطوتين. خلايا صمام الماوس المعزولة مهمة لإجراء فحوصات مختلفة، مثل هذا المقايسة تكلس المختبر، والتحقيق في المسارات الجزيئية المؤدية إلى تمعدن الصمام الأبهري.

عزل خلايا الصمام الخلالي الماوس لدراسة تكلس الصمام الأبهري في المختبر

يصف هذا البروتوكول العزلة الحادة لخلايا العضلات الملساء القلبية والوعائية القابلة للحياة من أسماك الزرد البالغة واليافعة واليرقات والجنينية (Danio rerio) ، وهي مناسبة للدراسات الكهربية.

عزل خلايا العضلات الملساء القلبية والوعائية عن أسماك الزرد البالغة واليافعة واليرقات والجنينية للدراسات الكهروفسيولوجية

هنا ، نقدم بروتوكولا يصف تحضير نوى الخلية. بعد التشريح المجهري والتفكك الأنزيمي للأنسجة القلبية إلى خلايا مفردة ، تم تجميد الخلايا السلفية ، تليها عزل الخلايا النقية القابلة للحياة ، والتي تم استخدامها لتسلسل الحمض النووي الريبي أحادي النواة ومقايسة النواة المفردة للكروماتين الذي يمكن الوصول إليه بواسطة transposase مع تحليلات تسلسل عالية الإنتاجية.

عزل النوى من الخلايا السلفية القلبية للفأر من أجل التنميط فوق الجينوم والتعبير الجيني بدقة خلية واحدة

تعلم عزل بروتين من صمامات القلب الجنينية للفأر باستخدام تقنية التحليل الكيميائي الغربي. تساعد هذه الطريقة الباحثين على دراسة التعبير البروتيني في الأنسجة الصغيرة بدقة عالية.

عزل بروتين من الفأر الجنينية القلب صمام منطقة نامية

استكشف المزيد من الفيديوهات