Name: منهج في Microinjection من Patiria minata بيضات ملقحة (فيديو) | JoVE Journal
Uploaded: 2014-09-01T15:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 48 s
Description: تعلم تقنية الحقن الدقيق في أجنة نجم البحر Patiria miniata لدراسة شبكات تنظيم الجينات في علم الأحياء التنموي. يوضح البروتوكول جمع الخلايا التناسلية والإخصاب وحققيق الخلايا الجنينية بالمواد المؤثرة.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

وأيد هذا العمل من قبل مؤسسة العلوم الوطنية وIOS IOS 0844948 1024811

<ol><li>Terasaki, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Quantification+of+fluorescence+in+thick+specimens%2C+with+an+application+to+cyclin+B-GFP+expression+in+starfish+oocytes%5BTitle%5D)+AND+%22Biol.+Cell+Auspices+Eur.+Cell+Biol.+Organ%22%5BJournal%5D)">Quantification of fluorescence in thick specimens, with an application to cyclin B-GFP expression in starfish oocytes.</a> Biol. Cell Auspices Eur. Cell Biol. Organ. 98, 245-252 (2006).</li>
<li>Terasaki, M., Runft, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Two-stage+dependence+for+1-methyladenine+induced+reinitiation+of+meiotic+maturation+in+starfish+oocytes%5BTitle%5D)+AND+%22Exp.+Cell+Res%22%5BJournal%5D)">Two-stage dependence for 1-methyladenine induced reinitiation of meiotic maturation in starfish oocytes.</a> Exp. Cell Res. 316, 2654-2663 (2010).</li>
<li>O'Neill, F. J., Gillett, J., Foltz, K. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Distinct+roles+for+multiple+Src+family+kinases+at+fertilization%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Cell+Sci%22%5BJournal%5D)">Distinct roles for multiple Src family kinases at fertilization.</a> J. Cell Sci. 117, 6227-6238 (2004).</li>
<li>McCauley, B. S., Akyar, E., Filliger, L., Hinman, V. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Expression+of+wnt+and+frizzled+genes+during+early+sea+star+development%5BTitle%5D)+AND+%22Gene+Expr.+Patterns+GEP%22%5BJournal%5D)">Expression of wnt and frizzled genes during early sea star development.</a> Gene Expr. Patterns GEP. 13, 437-444 (2013).</li>
<li>Yankura, K. A., Koechlein, C. S., Cryan, A. F., Cheatle, A., Hinman, V. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Gene+regulatory+network+for+neurogenesis+in+a+sea+star+embryo+connects+broad+neural+specification+and+localized+patterning%5BTitle%5D)+AND+%22Proc.+Natl.+Acad.+Sci.+U.+S.+A%22%5BJournal%5D)">Gene regulatory network for neurogenesis in a sea star embryo connects broad neural specification and localized patterning.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 110, 8591-8596 (2013).</li>
<li>McCauley, B. S., Wright, E. P., Exner, C., Kitazawa, C., Hinman, V. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Development+of+an+embryonic+skeletogenic+mesenchyme+lineage+in+a+sea+cucumber+reveals+the+trajectory+of+change+for+the+evolution+of+novel+structures+in+echinoderms%5BTitle%5D)+AND+%22EvoDevo%22%5BJournal%5D)">Development of an embryonic skeletogenic mesenchyme lineage in a sea cucumber reveals the trajectory of change for the evolution of novel structures in echinoderms.</a> EvoDevo. 3, 17(2012).</li>
<li>Annunziata, R., Martinez, P., Arnone, M. I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Intact+cluster+and+chordate-like+expression+of+ParaHox+genes+in+a+sea+star%5BTitle%5D)+AND+%22BMC+Biol%22%5BJournal%5D)">Intact cluster and chordate-like expression of ParaHox genes in a sea star.</a> BMC Biol. 11, 68(2013).</li>
<li>Morino, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Heterochronic+activation+of+VEGF+signaling+and+the+evolution+of+the+skeleton+in+echinoderm+pluteus+larvae%5BTitle%5D)+AND+%22Evol.+Dev%22%5BJournal%5D)">Heterochronic activation of VEGF signaling and the evolution of the skeleton in echinoderm pluteus larvae.</a> Evol. Dev. 14, 428-436 (2012).</li>
<li>Hart, M. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Structure+and+evolution+of+the+sea+star+egg+receptor+for+sperm+bindin%5BTitle%5D)+AND+%22Mol.+Ecol%22%5BJournal%5D)">Structure and evolution of the sea star egg receptor for sperm bindin.</a> Mol. Ecol. 22, 2143-2156 (2013).</li>
<li>McGovern, T. M., Keever, C. C., Saski, C. A., Hart, M. W., Marko, P. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Divergence+genetics+analysis+reveals+historical+population+genetic+processes+leading+to+contrasting+phylogeographic+patterns+in+co-distributed+species%5BTitle%5D)+AND+%22Mol.+Ecol%22%5BJournal%5D)">Divergence genetics analysis reveals historical population genetic processes leading to contrasting phylogeographic patterns in co-distributed species.</a> Mol. Ecol. 19, 5043-5060 (2010).</li>
<li>Keever, C. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Discordant+distribution+of+populations+and+genetic+variation+in+a+sea+star+with+high+dispersal+potential%5BTitle%5D)+AND+%22Evol.+Int.+J.+Org.+Evol%22%5BJournal%5D)">Discordant distribution of populations and genetic variation in a sea star with high dispersal potential.</a> Evol. Int. J. Org. Evol. 63, 3214-3227 (2009).</li>
<li>Lambert, P. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aLambert%2C+P+%22Sea+Stars+of+British+Columbia%2C+Southeast+Alaska%2C+and+Puget+Sound%22">Sea Stars of British Columbia, Southeast Alaska, and Puget Sound</a>. , UBC Press. (2000).</li>
<li>Dorée, M., Guerrier, P., Leonard, N. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Hormonal+control+of+meiosis%3A+specificity+of+the+1-methyladenine+receptors+in+starfish+oocytes%5BTitle%5D)+AND+%22Proc.+Natl.+Acad.+Sci.+U.+S.+A%22%5BJournal%5D)">Hormonal control of meiosis: specificity of the 1-methyladenine receptors in starfish oocytes.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 73, 1669-1673 (1976).</li>
<li>Hinman, V. F., Nguyen, A. T., Cameron, R. A., Davidson, E. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Developmental+gene+regulatory+network+architecture+across+500+million+years+of+echinoderm+evolution%5BTitle%5D)+AND+%22Proc.+Natl.+Acad.+Sci%22%5BJournal%5D)">Developmental gene regulatory network architecture across 500 million years of echinoderm evolution.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. 100, 13356-13361 (2003).</li>
<li>Hinman, V. F., Nguyen, A., Davidson, E. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Caught+in+the+evolutionary+act%3A+precise+cis-regulatory+basis+of+difference+in+the+organization+of+gene+networks+of+sea+stars+and+sea+urchins%5BTitle%5D)+AND+%22Dev.+Biol%22%5BJournal%5D)">Caught in the evolutionary act: precise cis-regulatory basis of difference in the organization of gene networks of sea stars and sea urchins.</a> Dev. Biol. 312, 584-595 (2007).</li>
<li>McCauley, B. S., Weideman, E. P., Hinman, V. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+conserved+gene+regulatory+network+subcircuit+drives+different+developmental+fates+in+the+vegetal+pole+of+highly+divergent+echinoderm+embryos%5BTitle%5D)+AND+%22Dev.+Biol%22%5BJournal%5D)">A conserved gene regulatory network subcircuit drives different developmental fates in the vegetal pole of highly divergent echinoderm embryos.</a> Dev. Biol. 340, 200-208 (2010).</li>
<li>Wessel, G. M., Voronina, E., Brooks, J. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Obtaining+and+handling+echinoderm+oocytes%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Obtaining and handling echinoderm oocytes.</a> Methods Cell Biol. 74, 87-114 (2004).</li>
<li>Sweet, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Blastomere+isolation+and+transplantation%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Blastomere isolation and transplantation.</a> Methods Cell Biol. 74, 243-271 (2004).</li>
<li>Cheers, M. S., Ettensohn, C. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Rapid+microinjection+of+fertilized+eggs%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Rapid microinjection of fertilized eggs.</a> Methods Cell Biol. 74, 287-310 (2004).</li>
<li>Core, A. B., Reyna, A. E., Conaway, E. A., Bradham, C. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Pantropic+retroviruses+as+a+transduction+tool+for+sea+urchin+embryos%5BTitle%5D)+AND+%22Proc.+Natl.+Acad.+Sci.+U.+S.+A%22%5BJournal%5D)">Pantropic retroviruses as a transduction tool for sea urchin embryos.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 109, 5334-5339 (2012).</li>
</ol>

أي تضارب في المصالح أعلنت من قبل المؤلفين.

هناك نوعان من الخطوات الحاسمة التي من الصعب بالنسبة للمستخدمين المبتدئين لهذه التقنية ولكن لا غنى عنها لخلق أجنة morphant بنجاح. الأول هو اختيار البويضات السليمة التي من شأنها أن تنضج وتسميد بشكل صحيح. نسبة التطور الطبيعي في ثقافة تعتمد على الموسم، وصحة الحيوان، وعدد المرات التي تم حصادها البويضات من فرد واحد. البويضات تميل إلى أن تكون ذات نوعية أفضل من أبريل حتى أكتوبر تشرين الاول. من المهم أن ننظر بعناية في البويضات قبل الشروع في ضمان أن الغالبية تبدو وكأنها الشكل 2A</st...

نجم البحر، Patiria miniata، (المعروف باسم نجم الخفافيش) في الظهور كنظام نموذج للاهتمام وتنوعا لمجموعة متنوعة من الخلايا 1- 3، 4،5 التنموية، التطورية 6- 8، والدراسات البيئية 9- 11. الكبار P. وتوزع miniata على طول ساحل المحيط الهادئ من سيتكا، ألاسكا إلى باجا كاليفورنيا 12 ويتم الاحتفاظ بسهولة في الأحواض المائية البحرية. البويضات التي يمكن الحصول عليها على مدار السنة وكل أنثى يمكن إلقاء عشرات الآلاف من البيض. ونضجت بسهولة البويضات المخصبة وخارجيا 13. الأجنة الناتجة شفافة مما يسمح للمراقبة سهلة؛ أن تتطور بشكل متزامن، وتحتاج إلى مياه البحر الوحيد للتنمية. التجمع الجينوم كله وtranscriptomes متعددة متاحة للP. أيضا miniata ( <a href="http://www.echinobase.org/Echinobase/">Echinobase.org</a> ). هذه المزايا تجعل يجعلها مثالية لمجموعة واسعة من البحوثوأغراض التدريس. في السنوات الأخيرة، P. أصبح miniata نظام نموذجي لشبكة تنظيمية الجينات التنموي يحلل 14- 16. والهدف من هذه الدراسات هو تحديد مجاملة كاملة من الجينات التنظيمية وتحديد شبكة من تفاعلاتها. الكثير من هذا العمل ينطوي على التعبير الجيني من خلال إقلاق إدخال أليغنوكليوتيد] العقاقير أو في المختبر توليفها من mRNAs. بالإضافة إلى ذلك، يتم استخدام التحليلات التنظيمية رابطة الدول المستقلة لتوصيف وظيفة الحمض النووي التنظيمي 15. هذه التحليلات تتطلب إدخال الكواشف اضطراب و / أو مراسل الحمض النووي يبني في الأجنة. وعلاوة على ذلك، لوصف آثار المصب من هذه الاضطرابات، لا بد من مقايسة العديد من الأجنة لإجراء تغييرات في التعبير الجيني من الأهداف المحتملة. تقنيات Microinjection من عدة مئات من بيضات ملقحة هي المركزية لهذا العمل. شوكيات الجلد، بما في ذلك P. miniata </م&gt;، يتطلب عدة أشهر لتصل إلى مرحلة النضج الجنسي. وبسبب هذا، فهو عموما ليس العملي لتطوير وصيانة خطوط المعدلة وراثيا من هذه الحيوانات للتجريب. لذا، تربية البالغين المعدلة وراثيا لا يمكن بكفاءة خلق الأجنة تعديل. بدلا من ذلك، يجب أن يحدث الاضطراب من جديد من خلال حقن مكروي. يقدم حقن مكروي فرصة لتعديل الأجنة مع الكواشف التي ليست خلية منفذة. يصف بروتوكول التالية طريقة لإدخال DNA، مرنا، استشفاف خلية، وأليغنوكليوتيد] morpholino العقاقير إلى مئات من البويضات المخصبة في واحدة 2-3 ساعة يجلس من خلال حقن مكروي. هذا وتنتج مادة كافية لمجموعة متنوعة من التجارب المصب بما في ذلك، ولكن ليس على سبيل الحصر، QPCR، الموقع التهجين، RNA تسلسل، والنشاف الغربي في.

<table><tbody><tr><td>1-ميثيل أدينين</td><td>أكروس أورجانيكس (فيشر ساينتفيكيف)</td> <td>AC20131-1000</td><td></td></tr><tr><td>190 ميكرون نيتكس نايلون فلتر</td><td>أجزاء صغيرة (في الأصل سيفر)</td> <td>CMN-0185-C / 5PK-05</td><td></td></tr><tr><td>100 ميكرون نيتكس نايلون</td><td>فلتر أجزاء صغيرة (في الأصل سيفر)</td><td>CMN-0105-C / 5PK-05</td><td></td></tr><tr><td>أطباق بوليسترين بتري ، 60 مم × 15 مم</td><td>فيشر ساينتفيك</td><td>FB0875713A</td><td></td></tr><tr><td>أنابيب الشعيرات الدموية</td><td>FHC، Inc</td><td>30-30-0</td><td>لسحب إبر الحقن المجهري</td></tr><tr><td>نموذج P-97 مجتذب إبرة</td><td>أدوات Sutter</td><td>P-97</td><td></td></tr><tr><td>ديكستران ، Rhodamine Green</td><td>Life Technologies</td><td>D7163</td><td>في حالة حقن مراسل تعبير GFP ، من المفيد استبدال Texas Red dextern كمتتبع حقن</td></tr><tr><td>Instant Ocean Sea</td><td>Salt Doctors Foster and Smith</td><td>CD-116528</td><td>متوفر أيضا في العديد من متاجر الأليفة</td></tr><tr><td>نصائح Microloader</td><td>Eppendorf</td><td>5242 956.003</td><td></td></tr></tbody></table>

منهج في microinjection من patiria minata بيضات ملقحة

A Method for Microinjection of Patiria minata Zygotes

كانت شوكيات الجلد لفترة طويلة نظام نموذجي المفضل للدراسات الاستنساخ والتنمية، ومؤخرا لدراسة تنظيم الجينات وتطور العمليات التنموية. نجم البحر، Patiria miniata، تكتسب انتشار كنظام نموذج لهذه الأنواع من الدراسات التي أجريت سابقا على وجه الحصر تقريبا في قنافذ البحر، Strongylocentrotus purpuratus وLytechinus variegatus. ميزة هذه الأنظمة النموذج هو سهولة إنتاج أجنة تعديل فيها هو جين معين صعودا أو downregulated، ووضع العلامات مجموعة من الخلايا، أو إدخال الجين المراسل. وهناك طريقة حقن مكروي واحد قادر على خلق مجموعة واسعة من هذه الأجنة تعديل. هنا، فإننا نقدم وسيلة للحصول على الأمشاج من P. miniata، وإنتاج بيضات ملقحة، وإدخال الكواشف مشوشة عبر حقن مكروي. يتم عزل الأجنة morphant صحية في وقت لاحق للدراسات الكمية والنوعية للجنرال الكتريكوظيفة الشرق الأدنى. توافر الجينوم وTranscriptome على البيانات لهذا الكائن الحي ازدادت أنواع الدراسات التي يتم تنفيذها وسهولة تنفيذها.

الهدف من هذا البروتوكول هو تقديم الكواشف إلى الأجنة. نحن إثبات فعالية البروتوكول عن طريق حقن مراسل بناء الحمض النووي الذي يدفع التعبير عن بروتين الفلورية الخضراء (GFP). حقن الأجنة تعبر عن GFP في بقع نسيلي (الشكل 4A-B) والحمض النووي خلال الانقسام يتضمن المبكر. العديد من الكواشف أن تكون مرغوبة لإدخال الأجنة في سامة بكميات عالية وعلى دفعات دون المستوى الأمثل من الأجنة. كشوف سمية عن طريق تأخير التنمية، اعتقال التنمية في الانقسام المبكر أو في مرحلة البويضة الملقحة، أو ...

الأساليب التي تنتج أجنة morphant ضرورية لدراسة آليات تنموية والشبكات التنظيمية الجينات. نجم البحر Patiria miniata هو نظام نموذجي الناشئة عن هذه الدراسات. هنا نقدم بروتوكول للحصول على الأمشاج، وتنتج ثقافات الأجنة، وحقن مكروي السريع للبيضات ملقحة من هذا النوع.

منهج في Microinjection من Patiria minata بيضات ملقحة

Echinoderms have long been a favorite model system for studies of reproduction and development, and more recently for the study of gene regulation and ...

الهدف العام من هذا الإجراء هو تعديل أجنة مياتا الحبيبية باستخدام الكواشف المزعجة عن طريق إدخالها عن طريق الحقن المجهري. يتم تحقيق ذلك عن طريق جمع الأمشاج ونضجها أولا من البالغة. الخطوة الثانية من الإجراء هي تسميد البويضات الناضجة.الخطوة الثالثة هي إزالة البيضة الملقحة ووضعها في صفوف على طبق الحقن. تتمثل الخطوة الأخيرة في حقن البيضة الملقحة بالكواشف المزعجة المرغوبة التي يتم إدخالها في النهاية ، مثل GFP Reporter ، ويمكن عرضها من خلال التصوير الفلوري للأجنة المحقونة. يعد العرض المرئي لهذه التقنية مهما حقا لأنه من الصعب تعلم كيفية الحقن الدقيق ، وخاصة كيفية توجيه الإبرة في مساحة ثلاثية الأبعاد ، وكيفية إدخال حجم البلعة الصحيح في البويضة.لذا فإن إظهار هذه التقنية اليوم سيكون طالبة دراسات عليا من مختبري ، إليز تلا. ابدأ بمجموعة من. يتم إجراء الجنس عن طريق استئصال الأمشاج.مثل P Miata ، نجوم البحر ليست ثنائية الشكل جنسيا. لإزالة الغدد التناسلية ، استخدم شفرة لقطع فتحة صغيرة ، لا يزيد حجمها عن سنتيمتر واحد على طول جانب الذراع. يمكن استخدام ملقط غير حاد لسحب الحواف للخلف.تجنب إزالة أنسجة الأمعاء الرخوة والرمادية والبنية. المبايض برتقالية إلى فاتحة. أسمر. اجمعها في طبق زجاجي صغير مع بضعة ملليلتر من الماء.سيؤدي إغاظة هذه الأنسجة الرخوة إلى إطلاق سراح الصلاجات بداخلها. تحقق من جودة cytes لتحديد ما إذا كانت ستنضج بشكل صحيح. ثم قم بتصفية البويضات لإزالة أنسجة المبيض والبويضات الصغيرة غير الناضجة ، أضف خمسة ملليلتر من 200 ميكرومولار ، وميثيل واحد إلى 100 مل من البويضات في مياه البحر ، واسمح للبويضات بالنضوج في المحلول لمدة 45 إلى 90 دقيقة عند 15 درجة مئوية.تعد جودة SA أمرا بالغ الأهمية لتحديد ما إذا كانت الثقافة ستنضج وتخصيب وتتطور بشكل صحيح. استخدم فقط دفعات البيض عندما يكون معظمها كبيرا أو بني أو شفاف وأصفر أو بني فاتح وملون. تخلص من دفعات الأجنة حيث يكون معظمها صغيرا.الخصيتان البنيتان أو الخضراءان بيضاء أو بيج ، وسوف تعتيم الماء عند تعطلها. اجمع الخصيتين في أنبوب سعة 1.5 مل مع أقل قدر ممكن من مياه البحر وقم بتخزينها على الجليد. ابدأ بفرم مجموعة بحجم حبة البازلاء من أنسجة الخصية في مليلتر من مياه البحر.انقل قطرتين أو ثلاث قطرات من مياه البحر اللبنية الناتجة إلى 100 مل من البويضات الناضجة في طبق الاستزراع. يجب أن تمنع هذه النسبة المنوية المتعددة. لا تنقل أيا من قطع المناديل.حرك المزيج إلى GAMTs. بعد بضع دقائق ، تحقق من GAMTs تحت مجهر تشريح البيض المخصب. احصل على مظروف إخصاب يشبه فقاعة شفافة حول البويضة.بمجرد تأكيد الإخصاب ، قم بتغيير الماء عن طريق جمع البيضة الملقحة أولا في كوب ترشيح 100 ميكرون ، ثم غسلها من الفلتر إلى طبق نظيف بمياه البحر العذبة. الآن انقل البيضة الملقحة إلى 15 درجة مئوية لمدة 15 إلى 30 دقيقة. أثناء التحضير ، قم بتحمض مياه البحر إلى درجة حموضة تبلغ حوالي أربعة عن طريق إضافة حمض هيدروكلوريك عادي واحد بالتنقيط.راقب درجة الحموضة واخلطها تماما في كل قطرة قبل الإضافة. التالي. مطلوب أيضا ماصة الفم مع الفتحة.أكبر قليلا من قطر البيضة الملقحة بزاوية 45 درجة. الآن تابع مع de هلام البيضة الملقحة، حتى تلتصق بشكل جيد بالطبق البلاستيكي. شفرة الهلام أكثر شمولا من شفرة قنفذ البحر ، ولكن يمكن إزالتها بمياه البحر الحمضية.أولا ، قم بتصفية البيضة البيضاوية من مياهها بشبكة 100 ميكرون. ثم انقلها إلى دورق سعة 200 مل مع الحد الأدنى من مياه البحر. ثم أضف 150 مل من مياه البحر المحمضة إلى الدورق ، واتركها لمدة ثلاث دقائق.في الدقيقة الرابعة والخامسة ، قم بإزالة طلاء الهلام عن طريق سكب البيضات البيقية من خلال شبكة 200 ميكرون مع مياه البحر المحمضة. افعل هذا من خمس إلى 10 مرات. بعد مرور خمس دقائق.اجمع البيضة الملقحة على شبكة 100 ميكرون. ثم اشطفها في طبق زجاجي صغير بمياه البحر العادية. بمجرد دخولك الطبق ، ركب البيضة الملقحة على الفور قبل أن تنتج المزيد من الهلام.استخدم الشفط من ماصة الفم للتعامل مع البيضات البيقية. انقلها من الطبق الزجاجي إلى لوحة حقن بلاستيكية معدة. البيضة الملقحة طافية قليلا.ضع الماصات بحيث يتم ضغط البيضة البيضية برفق على السطح أثناء إخراجها. تساعد النهاية الزاوية في هذه العملية. إذا لم تلتصق البيضة الملقحة بالطبق البلاستيكي ، فقم بنقلها مرة أخرى إلى مياه البحر الحمضية لبضع دقائق وحاول مرة أخرى.لن تكون البيضة الملقحة غير العالقة قابلة للحقن بأكبر عدد ممكن من البيضة الملقحة حسب الرغبة. لا تتغير قابليتها للاختراق بمرور الوقت. تحضير جميع محاليل الحقن بغض النظر عن المكياج 200 مللي مولار كلوريد البوتاسيوم.يجب أن يكون مورفو قليل النوكليوتيد عند 400 إلى 800 ميكرومولار والحمض النووي عند حوالي 2.5 نانوجرام لكل ميكرولتر من محلول حقن الهيتي مع قليل النوكليوتيدات إلى 65 درجة مئوية لمدة خمس دقائق قبل استخدامها مباشرة ، أضف 0.1٪ قضيب دومين DExT متتبع حبلا إلى محلول الحقن للتصور لاحقا. يمكن سحب إبرة الحقن من شعرية زجاجية بقطر خارجي بقطر ثلاثة أرباع ملم محملة بواحد إلى اثنين من ميكرولتر من محلول الحقن عبر ماصة محمل صغيرة. ثم نعلقه على المناور.تحكم في الطرد باستخدام رشاشات بيكو مضبوطة على نبضات 100 مللي ثانية بمعدل 40 رطلا لكل بوصة مربعة. استخدم دواسة قدم لتشغيل زاوية طرد الماصة عند حوالي 60 درجة على سطح الطبق. اكسر الطرف عن طريق تشغيله برفق في البلاستيك البارز عند خط محدد على الطبق.ثم اصطفها إلى بيضة. يجب أن تخترق الإبرة البيضة الملقحة بسهولة. إخراج البلعة بناء على الحقنة الأولى.اضبط مدة الطرد لتوصيل بلعة لتكون حوالي 20 إلى 30٪ من متوسط قطر البيضة الملقحة. استمر في ضبط المدة حتى الوصول إلى البلعة المطلوبة. ثم اترك ضبط التوقيت.إذا انسدت الإبرة ، اكسر الإبرة مرة أخرى. ثم عد إلى نبضة 100 مللي ثانية وأعد ضبط البلعة. إذا كانت مدة الحقن أكثر من 200 مللي ثانية مطلوبة للحصول على البلعة المناسبة ، فقم بكسر الإبرة مرة أخرى.وإذا كانت مدة الحقن تحتاج إلى 20 مللي ثانية أو أقل ، فاستبدل الإبرة. إذا علقت البيضة الملقحة على الإبرة ، فقم بإزالة الإبرة من الماء لإزالتها. حاول إكمال الحقن قبل الانقسام الأول.خلاف ذلك ، سيتأثر جزء فقط من الجنين بالكواشف المزعجة. بمجرد أن يبدأ الانقسام ، يمكن حقن تجديف واحد ، والذي قد يكون مثاليا لبعض خطوط التجريب باستخدام التقنية الموصوفة. تم حقن بنية مراسل الحمض النووي التي تعبر عن GFP في نجوم البحر الجنينية.أظهرت الأجنة المحقونة بقعا نسيلة من التعبير البنائي حيث كان الكاشف الموجز المتوقع ساما للأجنة عند الإفراط في الحقن. هنا ، توقف جنين محقون أكثر من اللازم في مرحلة الخلية الواحدة. في أحيان أخرى ، أدت المادة المحقونة إلى انقسام غير طبيعي مثل الانقسام المبكر غير المتماثل.يمكن أن تظهر السمية أيضا في تطور شاذ. بعد مشاهدة هذا الفيديو ، يجب أن يكون لديك فهم جيد حقا لكيفية استزراع الزيجوت الخارجي الصغير والحقن الصغير. ستقوم بإنشاء أجنة تحويل لإجراء مجموعة متنوعة من التجارب النهائية.

a-method-for-microinjection-of-patiria-minata-zygotes

Research

JoVE Journal

Biology

علم الأحياء

Microinjection طريقة راسخة وفعالة لإدخال المؤثرات الأجنبية في الأجنة المخصبة الزرد. هنا ، علينا أن نظهر تقنية microinjection قوية لأداء overexpression مرنا ، والدراسات morpholino ضربة قاضية قليل النوكليوتيد الجينات في الزرد.

Microinjection من مرنا والعقاقير [أليغنوكليوتيد] Morpholino اسماك الزرد في الأجنة.

هذا الفيديو يبين كيف يمكن حقنها أو morpholino مرنا في الأجنة الزرد في مرحلة واحدة الخلية إلى نقصان أو زيادة مستوى المنتجات جين معين خلال التطور اللاحق.

Microinjection الجنين اسماك الزرد إلى تحليل وظائف الجينات

الميداكا الزرد ومكملة للتشريح وظائف الجينوم الوراثي للالفقاريات. هذا البروتوكول يسلط الضوء على النقاط الرئيسية للنجاح في microinjection الميداكا الأجنة ، وهي تقنية هامة لتحليل الجنينية والجينية باستخدام الميداكا والزرد في المختبر.

Microinjection الجنين الميداكا لاستخدامها بوصفها كائنا النموذجي الوراثية

يصف هذا الفيديو تقنية الحقن المجهري للأجنة لتوصيل المركبات إلى كيس صفار الزرد.

الحقن المجهري للأجنة: تقنية لتوصيل مركب إلى صفار الزرد

حقن مكروي هو أسلوب شائع يستخدم لتقديم بنيات الحمض النووي، mRNAs و، أليغنوكليوتيد] morpholino بواسطة العقاقير أو العلاجات الأخرى في البيض والأجنة، وخلايا الأنواع المختلفة.

عالية الإنتاجية إبر دقيقة جدا لقنفذ البحر بيضات ملقحة

Microinjection اليرقات والأجنة الزرد أسلوب حاسم ولكنها صعبة المستخدمة في نماذج الزرد كثيرة. نقدم هنا، مجموعة من الأدوات عبارة للمساعدة في تحقيق الاستقرار والتوجه الزرد microinjection والتصوير.

أجهزة ميكروستروكتوريد Microinjection الأمثل وتصوير يرقات الزرد

يصف هذا البروتوكول إجراءات التلقيح المجهري لأجنة Culex quinquefasciatus التي تم تحسينها للعمل مع أدوات تحرير الجينات CRISPR/Cas9. يمكن لهذه التقنية أن تولد بكفاءة طفرات جرثومية محددة الموقع وقابلة للوراثة يمكن استخدامها لبناء تقنيات جينية في ناقلات الأمراض هذه غير الم مدروسة.

تقنيات التلقيح الدقيق الجنيني لتولد موتاسيس محدد الموقع الفعال في Culex quinquefasciatus

تقنيات الميكروجينكشن ضرورية لإدخال الجينات الخارجية في جينوم البعوض. يشرح هذا البروتوكول طريقة استخدمها مختبر جيمس لاستئصال الحمض النووي الدقيق في أجنة أنوفيليس غامبيا لتوليد البعوض المتحول.

طريقة الميكروبيكشن للأجنة الغامبية Anopheles

يصف البروتوكول الحالي الحقن المجهري للزيجوت ل CRISPR-Cas9 والحمض النووي للمتبرع لإنتاج فئران كاسيت الجينات وفئرانها المتخبطة بكفاءة.

الحقن المجهري للزيجوت لإنشاء أليلات كاسيت الجينات وأليلات فلوكس في الفئران

في هذا الفيديو ، Nijole Jasinskiene يوضح المنهجية المستخدمة لتوليد البعوض المعدلة وراثيا الزاعجة المصرية ، والتي هي نواقل حمى الضنك. وأظهرت أساليب إعداد صحيح microinjection الإبر ، dessicating الأجنة ، وأداء microinjection.

Microinjection الجنين بعوض ألف الحصول على البعوض المعدلة وراثيا

تعلم تقنية الحقن الدقيق في أجنة نجم البحر Patiria miniata لدراسة شبكات تنظيم الجينات في علم الأحياء التنموي. يوضح البروتوكول جمع الخلايا التناسلية والإخصاب وحققيق الخلايا الجنينية بالمواد المؤثرة.

منهج في Microinjection من Patiria minata بيضات ملقحة

استكشف المزيد من الفيديوهات