جيل من الأمعائية س. YSU Auxotrophs عن طريق الطفرات ينقول

الهدف العام من التجربة التالية هو إنتاج TROs من سلالة بكتيرية من النوع البري تنمو في الحد الأدنى من الأملاح المتوسطة المكملة بالجلوكوز. يتم تحقيق ذلك عن طريق تحويل منطقة ترانسبو إلى سلالة مضيف من النوع البري للحصول على مجموعة من البكتيريا المقاومة للقانا مايسين مع تبديل عشوائي على الإدخالات. يتم فحص المحولات التالية عن طريق الطلاء المقلد ، والذي يحدد TROs التي تنمو على وسط غني ، ولكنها تفشل في النمو على الحد الأدنى من الأملاح ، المتوسطة المكملة بالجلوكوز.

بعد ذلك ، يتم هضم الحمض النووي من الطفرة وربطه وتحويله إلى بكترونية قولونية من أجل الحصول على بلازميد يحتوي على الينقولات المحاطة على كل طرف بأجزاء من الجين المتقطع. يتم الحصول على النتائج التي تظهر الهوية المفترضة للجين المتقطع بناء على تسلسل الحمض النووي وتحليل أداة البحث عن المحاذاة المحلية الأساسية. الينقولات المستخدمة في هذه التقنية لها أصل النسخ المتماثل ، وجين مقاوم للكاناميسين ، ونهايات الفسيفساء.

لنقل ربط البروتين. إنه يفتقر إلى جين البروتين المنقول ، وبالتالي يتعين علينا إضافة هذا الجين الذي ينقل مع جزء الحمض النووي للينقولات ، ثم يتم تكليف المركب بين الحمض النووي للناقل والبروتين بالكهرباء في المضيف. المزايا الرئيسية للتثقيب الكهربائي هي القضاء على الحاجة إلى التنبيغ أو الاقتران.

ما ينتج عن عدم وجود الجين إدخالات مستقرة ووجود أصل النسخ المتماثل وجين مقاومة CIN يسمح بالتعرف السهل على الجين المتحور ، والذي يتم استرداده كبلازميد مؤتلف. يمكن أن تساعد هذه الطريقة في الإجابة على الأسئلة الرئيسية في مجال فسيولوجيا الميكروبات ، مثل تحديد الجينات المطلوبة للتخليق الحيوي للأحماض الأمينية والأحماض النووية والفيتامينات. خطرت لي فكرة هذه الطريقة لأول مرة عندما كنت أبحث عن جينات مقاومة المعادن في أنواع البكتيريا المعوية YSU وقررت دمجها في مختبر فسيولوجيا الميكروبات الذي كنت أقوم بتطويره لتغذية الخلايا المختصة بالكهرباء باستخدام ثقافة بين عشية وضحاها لأنواع البكتيريا.

تقوم YSU بإعداد تخفيف من واحد إلى 20 في وسط LB جديد وتحتضن عند 30 درجة مئوية و 120 دورة في الدقيقة إلى OD 600 بين 0.4 و 0.6. عندما تصل الخلايا إلى الكثافة المناسبة ، قم بتبريدها على الجليد لمدة خمس دقائق ثم جهاز الطرد المركزي عند أربع درجات مئوية و 7000 جم لمدة خمس دقائق. تخلص من المادة الطافية واستخدم كمية متساوية من الماء المثلج في Resus.

قم بتعليق أجهزة الطرد المركزي للخلايا عند أربع درجات مئوية و 7 ، 000 جي سات لمدة خمس دقائق. بعد تكرار الغسيل ، تخلص من المادة الطافية وباستخدام الماء المثلج ، قم بتعليق الخلايا بحجم يساوي حجم حبيبات الخلية. بعد ذلك ، أضف 0.5 ميكرولتر من منطقة الترانسبو إلى 40 ميكرولتر من الخلايا.

ثم ضع خليط منطقة نقل الخلية في طبيب بيطري للتثقيب الكهربائي المثلج واضغط على الخليط في قاع Q Vet ، وصدم الخلايا عند 25 ميكرو phs و 200 أوم و 2.5 كيلو فولت. أضف على الفور 960 ميكرولترا من وسط SOC المعقم بالفلتر الممزوج بسحب العينة لأعلى ولأسفل قبل نقل الخلايا إلى أنبوب فوج دقيق معقم سعة 1.5 ملليلتر. احتضان الخلايا عند 30 درجة مئوية و 120 دورة في الدقيقة لمدة 45 إلى 60 دقيقة.

ثم انشر 100 ميكرولتر من الخلايا على صفيحة أجار LB قبل احتضان اللوحة طوال الليل عند 30 درجة مئوية لشبكة المحولات. قم بلصق شبكة على غطاء طبق بتري فارغ مقاس 100 × 15 ملم. ارسم خطا في الجزء السفلي من لوحة أجار LB واستخدم قطعة صغيرة من الشريط اللاصق لتثبيتها على الغطاء الشبكي بحيث تكون الشبكة مرئية من خلال المثقاب باستخدام عود أسنان معقم.

اختر محولا واحدا وحدده في وسط مربع في الشبكة ، ضع محولا آخر في مربع مجاور واستمر حتى تمتلئ اللوحة. ثم احتضنها طوال الليل عند 30 درجة مئوية. هذه هي اللوحة الرئيسية لكل لوحة تم شبكتها.

اصنع كومة من ثلاث لوحات مثقاب جديدة مرقمة من واحد إلى ثلاثة. رقم واحد ل LB يمكن أن رقم اثنين ل M تسعة. ورقم ثلاثة ل LB يمكن أن يجفف الألواح رأسا على عقب طوال الليل عند 37 درجة مئوية قبل الاستخدام.

بعد رسم خط في الجزء العلوي من كل لوحة كما هو موضح سابقا ، استخدم 70٪ من الإيثانول لمسح أداة الطلاء المقلدة ووضع مربع فيلتين معقم فوقه قبل تثبيت مربع الفيلتين لأسفل. بعد ذلك ، قم بمحاذاة الخط الموجود على اللوحة الرئيسية بخط مرسوم على المشبك وضع اللوحة أعلى مربع فيلتين. اضغط برفق لنقل البكتيريا من اللوحة إلى مربع فيلتين.

ثم قم بمحاذاة الخط المرسوم على اللوحة رقم واحد مع الخط الموجود على المشبك وضعه أعلى مربع الفيلتين. ضع ضغطا لطيفا لنقل البكتيريا من مربع الفيلتين إلى اللوحة. قم بإزالة اللوحة رقم واحد.

تخلص من مربع المراهق المخملي في دورق من الماء وضع مربع مخملي معقم نظيف على أداة الطلاء المقلدة. كما كان من قبل ، قم بمحاذاة الخط الموجود على اللوحة رقم واحد مع الخط الموجود على المشبك وضعه فوق المربع المخملي الجديد. ضع ضغطا لطيفا لنقل البكتيريا من اللوحة رقم واحد إلى المربع المخملي.

قم بإزالة اللوحة رقم واحد ، وقم بمحاذاة الخط المرسوم على اللوحة رقم اثنين بخط على المشبك وضعه فوق المربع المخملي. ضع ضغطا لطيفا لنقل البكتيريا من مربع المراهقة المخملي إلى اللوحة الثانية ، وقم بإزالة اللوحة الثانية بعد تكرار العملية للوحة رقم ثلاثة ، واحتضان الألواح بين عشية وضحاها عند 30 درجة مئوية. تعتبر المستعمرات التي تنمو على كل من صفائح LB ولكنها تفشل في النمو على M تسعة صفائح كنيزة.

اختر TROs من اللوحة رقم واحد وقم بخطها على طبق LB جديد. بعد الحضانة طوال الليل ، اختر ثلاث مستعمرات من لوحة الخط وقم بإخراجها على طبق LB جديد في اليوم التالي. قم بتحديد المستعمرات من اللوحة المخططة حديثا على لوحة LB واستخدم هذه اللوحة لتكرار الطلاء المتماثل كما هو موضح للتو.

تنفيذ إنقاذ الجينات. استخدم مستعمرة متحولة معزولة لزراعة ثلاثة ملليلتر رطل. يمكن استزراع بين عشية وضحاها عند 30 درجة مئوية.

ثم استخدم مجموعة تنقية الحمض النووي الجينومي المتوفرة تجاريا لتنقية الحمض النووي من مليلتر واحد من المزرعة عند 0.025 وحدة من نوكلياز تقييد واحد BFUC إلى 14 ميكرولترا من ميكروغرام واحد لكل ميكرولتر من الحمض النووي الجيني في تفاعل 20 ميكرولتر على الجليد. ثم احتضان التفاعل عند 37 درجة مئوية لمدة 25 دقيقة قبل نقله إلى 80 درجة مئوية لمدة 20 دقيقة. لتعطيل الإنزيم ، قم بتحليل ثلاثة ميكرولترات من الحمض النووي المهضوم جزئيا على هلام AROS بنسبة 0.8٪.

بعد ذلك ، أضف 800 وحدة من T four DNA ligase إلى 15 ميكرولترا من الحمض النووي الجيني المهضوم جزئيا في تفاعل 500 ميكرولتر واحتضان التفاعل عند أربع درجات مئوية بين عشية وضحاها في اليوم التالي. قم بترسيب الحمض النووي المرتبط بإضافة 50 ميكرولترا من ثلاثة أسيتات الصوديوم المولية درجة الحموضة 5.5 ومليلتر واحد من 95٪ من الإيثانول يحتضن عند سالب 20 درجة مئوية لمدة 20 دقيقة. قم بفحص الحمض النووي عند أربع درجات مئوية و 13 ، 500 جم لمدة 10 دقائق.

اسكب الأماكن الفائقة ، سبعة 70٪ إيثانول لغسل الحبيبات. جففه في مكثف فراغ الطرد المركزي واستخدم 10 ميكرولترات من الماء الخالي من النوكلياز. لإعادة تعليق الحمض النووي ، استخدم أربعة ميكرولترات من الحمض النووي المعلق للتحويل عن طريق التثقيب الكهربائي e كولي سلالة ، ECD 100 DPIR أو ECD 100 DPIR ، 16 واحد 16 تلقيح خمسة ملليلتر من LB يمكن أن يكون متوسطا بمستعمرة واحدة.

قم بزراعته عند 37 درجة مئوية و 120 دورة في الدقيقة بين عشية وضحاها. في اليوم التالي بعد تنقية الحمض النووي من الثقافة بأكملها ، استخدم Joe one لهضم 14 ميكرولترا من البلازميد. قم بتحليل 10 ميكرولتر من البلازميد غير المهضوم والمهضوم على هلام أجارو 0.8٪.

بعد تسلسل البحث عن البلازميد للتسلسل الخمسة الأولي GA ، G-A-C-A-G ثلاثة أولي ، وهو آخر سبعة أزواج أساسية من التبديل وسيتبعه تسلسل الجين المتقطع. استخدم الانفجار لتحديد الوظيفة المحتملة للجين المتقطع. أسفر التثقيب الكهربائي الناجح عن عدة آلاف من المحولات لكل منها تبديل واحد على الأقل في هذا الشكل.

تظهر المربعات السوداء مستعمرتين نمت على صفيحة LB ، ولكن ليس على اللوحة المتوسطة البسيطة M التسعة. ربما احتوت هذه TROs على انقطاعات في الجينات المشاركة في تخليق حمض أميني أو حمض نووي أو فيتامين ، وكلها موجودة في lb ، ولكن ليس في M nine ، الحد الأدنى من الوسط. لم يكن لدى المستعمرات ال 86 الأخرى انقطاع في الجين المطلوب للنمو في M تسعة.

الحد الأدنى من الوسط كما هو موضح هنا ، الحمض النووي الجيني المهضوم جزئيا من TRO معزول يمتد من أكثر من 10 كيلو قواعد إلى أقل من 0.5 كيلو قاعدة في الحجم. يتكون البلازميد الذي تم إنقاذه من اثنين من الترانسبوزونات كيلو بيس بالإضافة إلى الحمض النووي المضيف المحيط. يوضح هذا الشكل نتيجة انفجار لبلازميد تم عزله من tro.

يشبه التسلسل المتقطع جين كلوي المعوي لتناول الطفرة ، والذي يشارك في التخليق الحيوي ل L tyrosine و L phenylalanine و L tryptophan بسبب خطوات النمو المتعددة بين عشية وضحاها. يمكن إكمال هذه التقنية في غضون 10 أو 11 يوما إذا تم إجراؤها بشكل صحيح. أثناء النسخة المتماثلة من جيش التحرير الشعبى الصينى ، من المهم أن تتذكر عدم تشويه الألواح ، ويمكنك منع ذلك باستخدام الألواح الجافة وعدم تحريك الألواح بمجرد وضعها على مربع فيلتين.

بعد هذا الإجراء ، يمكن إجراء طرق أخرى مثل تجارب الاستنساخ أو التكملة للتحقق من وظيفة الجين المحدد. بعد مشاهدة هذا الفيديو ، يجب أن يكون لديك فهم جيد لكيفية توليد TROs باستخدام طفرات الينقولات ، وكيفية تحديد الجينات المتحولة مبدئيا.