من بقعة 2DE جل لوظيفة البروتين: الدرس المستفاد من HS1 في سرطان الدم الليمفاوي المزمن

الهدف العام للتجربة التالية هو استخدام نهج بروتيني مشترك لتحديد علامات التشخيص المحتملة و / أو الأهداف العلاجية في الأمراض البشرية. يتم تحقيق ذلك عن طريق عزل خلايا سرطان الدم الأولية من الدم المحيطي للمريض ، وتحمل تشخيصا جيدا أو سيئا ، والتعبير عن كل من CD 19 و CD خمس علامات سطحية لاستخدامها في التحليل البروتيني كخطوة ثانية. يتم حل محللات الخلايا البيضاء عن طريق الرحلان الكهربائي ثنائي الأبعاد أو اثنين من DE ، وتسمح مقارنة الخرائط البروتينية بتحديد البقع المعبر عنها بشكل تفاضلي بين مرضى التشخيص الجيد مقابل السيئ ، والتي يمكن تحديدها لاحقا عن طريق قياس الطيف الكتلي أو التصلب المتعدد.

بعد ذلك ، يمكن استخدام المقايسات المختلفة من أجل التحقق من صحة وتشريح دور البروتينات المحددة في التاريخ الطبيعي للمرض. تظهر النتائج أن حالة الفسفرة المختلفة ل HS التي تم اكتشافها بواسطة اثنين من المواد الهلامية ، ترتبط بالنتائج السريرية للمرضى. تمتد الآثار المترتبة على هذه التقنية نحو علاج ابيضاض الدم الليمفاوي المزمن لأنها يمكن أن تساعد في تحديد البروتين المتورط في تطور المرض والذي يمكن استغلاله كعلامة تنبؤية و / أو أهداف علاجية توضح أن هذا الإجراء سيكون معي.

ركضت باميلا إلى فني في المختبر وباحث ما بعد الدكتوراه من مختبر خارجي قبل البدء في هذا الإجراء ، اجمع الدم المحيطي في أنابيب جمع الدم بالفراغ باستخدام هيبارين الصوديوم. نقل الدم إلى أنبوب سعة 15 مليلتر وإضافة كوكتيل تخصيب الخلايا البائية البشرية بمعدل 50 ميكرولتر لكل مليلتر من الدم الكامل. ثم تخلط جيدا وتحتضن لمدة 20 دقيقة في درجة حرارة الغرفة.

بعد الحضانة ، قم بتخفيف العينة بحجم متساو من PBS بالإضافة إلى 2٪ FBS ، ومزيج برفق وقم بتراكب الدم بعناية فوق مكالمة الذبابة مع التأكد من عدم كسر الواجهة. الطرد المركزي للعينة عند 400 مرة G في درجة حرارة الغرفة لمدة 20 دقيقة دون انقطاع. عند الانتهاء ، قم بشفط الواجهة بعناية لاستعادة الخلايا ووضعها في أنبوب جديد.

اغسل الخلايا مرة واحدة باستخدام PBS بعد الطرد المركزي وإزالة المواد الطافية. ريسوس. قم بتعليق الحبيبات في المادة الطافية المتبقية عن طريق تحريك الأنبوب يدويا ذهابا وإيابا بعد التخفيف. باستخدام وسيط RPMI الكامل ، قم بحساب الخلايا باستخدام طريقة استبعاد Trian blue.

بعد ذلك ، أضف الأجسام المضادة التالية إلى 100 ميكرولتر من تعليق الخلية المنقى في أنبوب فاكس. احتضان العينة لمدة 20 دقيقة عند أربع درجات مئوية في الظلام. بعد غسل العينة بأربعة ملليلتر من PBS ، تحقق من النقاء عن طريق قياس التدفق الخلوي.

تحقق من النسبة المئوية لسرطان الدم الليمفاوي المزمن أو خلايا CLL ، والتي يعبر عنها Coex CD 19 و CD five على سطحها. تأكد من أن المستحضرات خالية فعليا من الخلايا الليمفاوية والخلايا الوحيدة NK عن طريق التحقق من النسبة المئوية للقرص المضغوط الثالث و CD 14 و CD 1656 في المؤامرة ، والتي يجب أن تكون قريبة من الصفر في هذه المرحلة. قم بإذابة كريات خلايا CLL بحجم نهائي يبلغ 380 ميكرولتر من المخزن المؤقت للرحلان الكهربائي ثنائي الأبعاد.

ضع ملليغراما واحدا من عينات البروتين على 18 شريطا IPG لأداء التركيز الكهربائي iso. بعد التشغيل ، قم بموازنة الشرائط في ملليلترين من المخزن المؤقت للتوازن ، مع استكمالها بنسبة 2٪ من DTT الطازج لمدة 15 دقيقة في درجة حرارة الغرفة. بعد التخلص من المحلول ، أضف ملليلترين من المخزن المؤقت للتوازن ، مع 2.5٪ أنا أسيتاميد.

ثم احتضان العينة لمدة 15 دقيقة في درجة حرارة الغرفة على منصة هزازة. بعد ذلك ، جفف الشرائط على الورق دون لمس الجل لإزالة المحلول الزائد. بمجرد أن يجف ، قم بتحميل كل شريط فوق جل صفحة SDS متدرج من تسعة إلى 16٪.

أضف حجما صغيرا من المخزن المؤقت للرحلان الكهربائي SDS أعلى الجل لتسهيل تحميل الشريط. بعد ذلك ، أغلق الجل بإضافة ما يقرب من خمسة ملليلتر من محلول أجار 0.8٪ لمنع تعويم الشريط. بمجرد تجميع وحدة الرحلان الكهربائي ، املأها ب SDS Electrophoresis Buffer.

ثم قم بإجراء التشغيل بمعدل 60 مللي أمبير لكل هلام لمدة أربع ساعات أو أربع درجات مئوية أو باستخدام نظام تبريد. بعد إزالة الجل من الوحدة الكهربية ، ضعه في صندوق التلوين المناسب. تحضير حوالي 200 مل من كل محلول.

أضف كل محلول بعناية إلى صندوق التلوين الذي يحتوي على الجل. قم بإجراء جميع الحضانات على منصة هزازة. بعد التلوين ، قم بإزالة محلول التوقف واترك الجل في محلول 1٪ حمض الخليك حتى الحصول عليه.

بالنسبة لمقايسة الهجرة ، يعلق التقييس الخلايا المنقاة مسبقا. في RPMI الكامل ، قم بإعداد غرفة الصب السفلية عن طريق إضافة 600 ميكرولتر من RPMI الكامل مع أو بدون المحفزات المحددة. لقياس الهجرة المستحثة والتلقائية على التوالي ، ضع الغرفة العلوية في الأعلى واترك النظام يتوازن لمدة 30 دقيقة عند 37 درجة مئوية في الحاضنة.

عند الانتهاء ، قم بزرع 10 إلى الخلايا الست لكل 200 ميكرولتر في الغرفة العلوية واحتضان اللوحة لمدة أربع ساعات عند 37 درجة مئوية في الحاضنة. بعد الحضانة ، قم بإزالة الغرفة العلوية وجمع الوسائط في الغرفة السفلية. ثم اغسل الغرفة السفلية مرة واحدة بمليلتر واحد من PBS.

بعد جمع PBS في أنبوب ، قم بالطرد المركزي للعينة لمدة خمس دقائق عند 300 مرة G بعد إزالة المادة الطافية. أعد تعليق العينة في 500 ميكرولتر من PBS عن طريق قياس التدفق الخلوي. احسب عدد الخلايا التي تم ترحيلها بعد دقيقة واحدة من الاستحواذ.

تحقق من عدد الخلايا في مخطط نقطي ثنائي الأبعاد مع الأخذ في الاعتبار الانتثار الجانبي للخلايا وعدد الأحداث التي تم تصورها في دقيقة واحدة ، وهو الرقم الذي يجب استخدامه في الحساب. تم تجميع عينات خلايا اللوكيميا الأولية المعزولة من مرضى CLL في مجموعتين فرعيتين رئيسيتين بناء على السمات السريرية لكل مريض وتحليلها بواسطة كتلتين من DE و MS ضمن تحمل كتلة معينة. تم تعيينها لتسلسلات الببتيد في قاعدة البيانات ثم تم تجميعها في بروتين يعتبر محددا إذا اجتاز درجة احتمالية معينة.

من خلال هذا التحليل ، تم تحديد البروتينات المشاركة بشكل أساسي في نشاط الهيكل الخلوي وعمليات التمثيل الغذائي بين هذه البروتينات. النسب المكونة للدم ، البروتين الخاص بالخلية أو hs. الشخص الذي ارتبط فسفرته التفاضلية ارتباطا وثيقا بالمسار السريري للمرض تم التعبير عنه بشكل تفاضلي.

على وجه الخصوص ، يعاني المرضى الذين يحملون بقعة واحدة من نتائج سريرية سيئة بينما المرضى الذين يعانون من بقعتين لديهم تشخيص جيد. تم العثور على خلايا CLL التي تحمل HS واحد كبقعة واحدة ، لديها نشاط هيكل خلوي ضعيف من حيث الهجرة والالتصاق وبلمرة الأكتين مقارنة ب HS ناقص الفسفرة. عينة واحدة أو عينتان موضعيتان. وبالتالي شرح سلوك سريري مختلف.

بعد مشاهدة هذا الفيديو ، يجب أن يكون لديك فهم جيد لكيفية استخدام البروتينات لتحديد المرشحين البيولوجيين المشاركين في تطور المرض والتي يمكن استخدامها كعلامة تنبؤية و / أو أهداف علاجية.