قياس المكانية والزمانية كاليفورنيا ²⁺ إشارات في النباتات نبات الأرابيدوبسيس

الهدف العام من هذا الإجراء هو إظهار طريقة لمراقبة إشارات الكالسيوم على مستوى الخلوي والنبات بأكمله. يتم تحقيق ذلك عن طريق زراعة الشتلات أولا على لوحة أجار MS أو مباشرة داخل غرفة التصوير. الخطوة الثانية هي نقل الشتلات إلى فيلم لاصق أو الاحتفاظ بها في غرفة التصوير.

بعد ذلك ، يتم تطبيق المحفزات على الشتلات للحث على إشارات الكالسيوم. في النهاية ، يتم استخدام تلألؤ نمط الحياة أو التصوير الفلوري لإظهار استجابة الشتلات الكاملة أو الكالسيوم النووي العصاري الخلوي على التوالي لمحفزات مختلفة. الميزة الرئيسية لهذه التقنية على الطرق الحالية مثل النبات الفردي الذي يحدث على سبيل المثال ، هي أن مقايسة الشتلات اللاصقة للفيلم بسيطة وحساسة وقوية.

لذلك ، يمكن تكييف هذه التقنية مع الفحص عالي الإنتاجية للطفرات ذات استجابات إشارة الكالسيوم المتغيرة. بالإضافة إلى ذلك ، بالمقارنة مع تصوير الكالسيوم المسطح ، فإن استخدام مؤشر الكالسيوم المشفر وراثيا القائم على GFP يتجنب الإعدادات والحسابات المجهرية المعقدة. توفر هذه الطريقة نظرة ثاقبة لإشارات الكالسيوم أثناء استجابة الإجهاد في نبات الأرابيدوبسيس ، ولكن يمكن استخدامها أيضا في سياقات أخرى مثل أثناء التطوير أو الدفاع في نماذج النباتات الأخرى.

سيكون إظهار هذه الطريقة لامعا. طالب من مختبرنا لبدء هذا الإجراء تعقيم بذور نباتات الأرانب التي تعبر عن quain بمحلول مبيض 10٪ يحتوي على 0.01٪ تريتون 100 ، زرع البذور على صفيحة مربعة تحتوي على قوة كاملة MS 1٪ سكروز و 1.2٪ أجار. بعد ذلك ، ضع الصفائح عموديا في غرفة النمو بعد التقسيم الطبقي أربع درجات مئوية لمدة يومين.

بعد ذلك ، انقل الشتلات إلى فيلم. ضع طبقة لاصقة فوق الشتلات التي يبلغ عمرها من سبعة إلى 10 أيام تنمو على الطبق. ادفع الفيلم برفق يدويا للتأكد من أن الشتلات تلتصق بالفيلم.

ثم قشر الفيلم برفق حتى تظل الشتلات ملتصقة بالفيلم. بعد ذلك ، قم باحتضان الشتلات بالعامل المساعد عن طريق وضع شتلات A الملتصقة على صفيحة مربعة تحتوي على 15 مل من ميكروغرامين لكل مليلتر HCTZ في الماء. احتضان الشتلات في درجة حرارة الغرفة لمدة أربع ساعات إلى ليلة وضحاها.

للتحضير للتصوير التلألؤ ، أخرج الفيلم من محلول HCTZ واقطعه من المنتصف لتشكيل قطعتين. ضع قطعتي الفيلم بحيث تكون الشتلات متجهة لأعلى في طبقين مختلفين. ثم اترك الألواح في الظلام لمدة خمس دقائق للحصول على صور تلألؤ في الظلام.

ضع لوحين بجانب بعضهما البعض على مسرح نظام التصوير المضيء. احصل على الصور فور إضافة 20 مل من محلول المحفزات إلى الألواح في وقت واحد. لتحليل صور التلألؤ ، اختر نفس نطاق العرض لجميع صور التلألؤ ، واقتصاص عائد الاستثمار وإنشاء الصور كملفات jpeg.

بدلا من ذلك ، قم بتصدير الصور كملفات بتنسيق SPE واستيرادها إلى برنامج تحليل الصور J للصورة. قم بتعيين القياسات لحساب متوسط القيمة الرمادية لعائد الاستثمار ، وحدد نفس حجم منطقة عائد الاستثمار. ثم قم بقياس متوسط القيمة الرمادية وتقديم البيانات كرسوم بيانية شريطية.

لتحضير الشتلات للتصوير متحد البؤر. تعقيم بذور نباتات opsis التي تعبر عن الحالة 12 بمحلول مبيض 10٪ يحتوي على 0.01٪ تريتون. لذا فإن البذور المعقمة على طبق يحتوي على أملاح MS كاملة القوة ، 1٪ سكروز و 1.2٪ أجار.

ثم ضع الصفائح عموديا في غرفة النمو بعد التقسيم الطبقي عند أربع درجات مئوية لمدة يومين. في غضون ذلك ، قم بتجميع غرفة التصوير مع شريحة وزلة غطاء. ضع قطعة من الصوف القطني المنقوع بالماء في الجزء العلوي من الشريحة.

ثم انقل شتلة أو شتلتين عمرها خمسة أيام من اللوحة إلى منتصف الشريحة. ثم قم بلصق قطع صغيرة من الطين على كل ركن من أركان زلة الغطاء وضع زلة الغطاء فوق الشتلات لخلق فجوة بين زلة الغطاء والانزلاق. بعد ذلك ، قم بتوصيل أحد طرفي أنبوب البولي إيثيلين بحقنة سعة مليلتر واحد وضع الطرف الآخر من الأنبوب المجاور مباشرة للغرفة.

امسك الأنبوب في مكانه بشريط لاصق لتجميع غرفة التصوير بغرفة زجاج شبكي. انشر طبقة رقيقة من شحم السيليكون حول أنبوبين من البولي إيثيلين واضغط على الأنابيب المطلية في القنوات الموجودة على كل جانب من حجرة زجاج شبكي. ثم انشر طبقة رقيقة من شحم السيليكون على سطح الغرفة التي تحتوي على أخاديد الأنبوب وضع زلة غطاء على الشحوم لإغلاق جانب واحد من فتحة الغرفة.

بعد ذلك ، انقل شتلة عمرها خمسة أيام من الطبق إلى الغرفة وضع قطعة من الصوف القطني مبللة بالماء فوق الشتلات. انشر شحم السيليكون على السطح الآخر للغرفة واضغط على زلة غطاء أخرى في الأعلى لإغلاقها. بعد ذلك ، قم بتوصيل نهاية أحد الأنابيب بحقنة سعة مليلتر واحد واترك نهاية الأنبوب الآخر مفتوحة.

لتحضير غرفة تصوير بغطاء زجاجي ذو حجرة ، قم أولا بتعقيم زجاج الغطاء المزود بغرفة بنسبة 70٪ من الإيثانول واتركه في الغطاء حتى يجف عند 0.6 مل أو 0.2 مل من MS كامل القوة. وسط يحتوي على 1٪ سكروز و 0.5٪ هلام مقاتل في كل بئر من غرفة بئرين أو غرفة ثمانية آبار على التوالي. ثم قم بتعقيم البذور وزرعها مباشرة على غطاء زجاجي يحتوي على طبقة رقيقة من الجل الشفاف واتركها تنمو عموديا لمدة خمسة أيام. للحصول على الصور.

باستخدام المجهر متحد البؤر ، يطبق محفزات الإجهاد عن طريق حقن 200 ميكرولتر من 150 مللي مولار كلوريد الصوديوم أو الماء المثلج أو محلول بيروكسيد الهيدروجين المليمولي في الغرفة قبل الحصول على الصور مباشرة. التقط الصور مباشرة بعد تطبيق محلول التحفيز. باستخدام مجهر المسح الضوئي بالليزر متحد البؤر المقلوب مع عدسة غمر الماء 20 ×.

اجمع سلسلة زمنية من الصور على فترات أربع ثوان بأطوال موجية للإثارة والانبعاث تبلغ 4 88 نانومتر و 500 إلى 550 نانومتر على التوالي ، ودقة AIX من خمسة 12 × خمسة 12 أو تحليل الصور باستخدام عناصر نيكون. يتم سحب عائد الاستثمار حول كل خلية ذات أهمية. يتم قياس الكثافة الإجمالية داخل كل عائد استثمار بمرور الوقت باستخدام مربع حوار قياس الوقت.

ثم يتم تصدير قياسات الكثافة الإجمالية ومعالجتها في الرسم البياني للبيانات المعروضة. فيما يلي مقارنة بين استجابة الكالسيوم الزمانية المكانية لشتلات 10 أيام. محفزات الإجهاد المختلفة هنا هي السلسلة الزمنية للتلألؤ ، وصور الشتلات المعرضة ل 400 مللي مولار مانيتول و 400 مللي مولار أولي بالإضافة إلى كلوريد نحاس مليمولار واحد ، و 75 مللي مولار كلوريد الصوديوم و 75 ملليمولار كلوريد الصوديوم بالإضافة إلى كلوريد نحاس مليمولار واحد وبيروكسيد هيدروجين مليمولار واحد أو بيروكسيد هيدروجين مولار واحد بالإضافة إلى كلوريد نحاس مليمول.

اللوحات العلوية والسفلية هي صور التلألؤ التي تم الحصول عليها خلال أول 40 ثانية و 40 ثانية ثانية على التوالي. وهنا هو الرسم البياني الشريطي لمتوسط شدة تلألؤ الشتلات استجابة لمنبهات الإجهاد المشار إليها الموضحة هنا على أنها تذبذب العصارة الخلوية والكالسيوم النووي. استجابة لإجهاد الملح ، تظهر الصور متحدة البؤر أن الحالة 12 يتم التعبير عنها في السيتوبلازم ونواة الخلايا الجذرية وخلايا أوراق النباتات المعدلة وراثيا التي تعبر عن الحالة 12.

ظهرت هذه الصورة ، صورة اللون الأحمر ، التألق الذاتي للبلاستيدات الخضراء والتألق الأخضر للحالة 12. تظهر هاتان المخططتان تذبذب الكالسيوم الناجم عن إجهاد الملح في العصارة الخلوية ، وهي نواة الخلايا الجذرية. أثناء محاولة هذا الإجراء ، من المهم أن تتذكر استخدام الشتلات المزروعة جيدا.

بعد مشاهدة هذا الفيديو ، يجب أن يكون لديك فهم جيد لكيفية مراقبة الديناس على مستوى الخلوي والمستوى النباتي بأكمله.