استراتيجيات لتتبع القيامة، خلية بقاء ظاهرة التي عكس موت الخلايا المبرمج

الهدف العام من هذا الإجراء هو اكتشاف وتتبع انعكاس عملية موت الخلايا المبرمجة والخلايا المستنبتة عن طريق الفحص المجهري للخلايا الحية. تنتشر الخلايا السليمة على الركيزة وتحتوي على ميتوكوندريا خيطية أنبوبية حول النواة. ومع ذلك ، عندما تنتحر الخلايا من خلال موت الخلايا المبرمج ، تظهر الخلايا المحتضرة ميزات مورفولوجية فريدة لاكتشاف وتتبع انعكاس موت الخلايا المبرمج.

يتم طلاء الخلايا في أطباق زراعة الخلايا ذات القاع الزجاجي. الخطوة التالية هي إجراء تلطيخ الخلايا الحية لتسمية الميتوكوندريا والنوى. هذا يسمح بالكشف عن السمات المورفولوجية للخلايا السليمة والخلايا المبرمجة.

عن طريق الفحص المجهري للخلايا الحية ، تتعرض الخلايا السليمة المسماة لحافز الموت للحث على موت الخلايا المبرمج. عندما يتم الكشف عن موت الخلايا المبرمج ، يتم غسل الخلايا المحتضرة ثم تحضينها بوسط زراعة خلايا جديدة للسماح باستعادة الخلايا ، ويستخدم تصوير الخلايا الحية لاكتشاف وتتبع انعكاس موت الخلايا المبرمج وعواقبه مثل إصلاح الخلايا وبقائها كما هو موضح في الانتعاش المورفولوجي للخلية والهجرة على التوالي ، على التوالي. موت الخلايا المبرمج هو نوع من موت الخلايا المبرمج الذي يلعب دورا أساسيا في القضاء على الخلايا غير المرغوب فيها أو الخطرة في أجسامنا.

يفترض عموما أن هذه العملية المركبة للخلايا لا رجعة فيها لأنه بمجرد أن تبدأ تموت الخلية بالتأكيد بعد ذلك ، ومع ذلك ، اكتشفنا أنه في الواقع ، يمكن للخلية المحتضرة أن تعكس عملية موت الخلية ثم تبقى على قيد الحياة وتستمد حتى. لديهم خطوات حاسمة محتملة أجبرت على أن تكون نقطة العائد المنخفض ، مثل cyto C ، والإفراج ، والتنشيط القائم على الحالة ، والتجزئة النووية ، وتكوين الجسم موت الخلايا المبرمج. بعد استشارة الخبراء اليونانيين ، نعتمد مصطلحا ، الركود ، والذي يعني النهوض إلى الحياة.

لوصف ظاهرة عكس موت الخلايا المبرمج وعمليات موت الخلايا الأخرى ، يصعب اكتشاف التشريح لأن الخلية التي تعكس موت الخلايا المبرمج تبدو مثل الخلايا الثقيلة الطبيعية. ومع ذلك ، من خلال الفحص المجهري المستمر للخلايا الحية ، يمكننا اكتشاف حدوث التوسع في جزء كبير من الخلايا. إتقان هذه التقنية مهم لأنها تسمح لنا بدراسة استجمام التشريح.

اقترحنا أن هذا التشريح قد يشفي الأنسجة الضارة، ولكنه قد يسمح أيضا للخلايا التالفة بالبقاء على قيد الحياة وتكوين السرطانات. لذلك ، فإن تحديد الآليات التي تتحكم في التخدير قد يوفر لنا طرقا جديدة لعلاج الأمراض عن طريق الحقن مثل السرطان وفشل القلب والتنكس عن طريق التوسط في موت الخلايا والبقاء على قيد الحياة لاكتشاف وتتبع الورم الداخلي. بعد أحداث موت الخلايا المبرمج ، يتم إجراء الفحص المجهري للخلايا الحية بفاصل زمني لتتبع الخلايا التي يمكنها عكس موت الخلايا المبرمج بعد تحريض موت الخلايا العابرة.

للبدء ، أضف ملليلترا واحدا من محلول بولي دي ليسين إلى طبق زراعة خلية 35 ملم بقاع زجاجي أرق. بعد حضانة دقيقة واحدة لتغطية السطح الزجاجي ، استنشق المحلول وغسل الزجاج بملليلترين من محلول ملحي مخزن بالفوسفات لتحضير الخلايا أولا عيون التربسين ، خلايا الكعب عند التقاء 80 إلى 90٪ بعد انفصال الخلايا ، أضف 10 ملليلتر من 37 درجة مئوية متوسطة لتعليق الخلايا. ثم انقل محلول تعليق الخلية إلى أنبوب معقم سعة 10 ملليلتر إلى جهاز طرد مركزي بمعدل 160 مرة G لمدة دقيقة إلى دقيقتين.

بعد الدوران ، استنشق الوسط بعناية. لا تزعج بيليه الخلية في الجزء السفلي من الأنبوب. استمر في إعادة تعليق الخلايا ب 10 ملليلتر من وسط زراعة الخلايا عن طريق سحب العينة اللطيف.

ثم انظر ملليلترين من الخلايا العالقة على زجاج مطلي مسبقا مقاس 35 ملم. أطباق زراعة الخلايا السفلية. احتضان الخلايا في حاضنة مرطبة عند 37 درجة مئوية مع 5٪ ثاني أكسيد الكربون لمدة يوم.

قد يكون ضبط أرقام الخلايا ضروريا حتى تتمكن الخلايا من تحقيق 80٪ طلاقة مشتركة في وقت التصوير. تجزئة الميتوكوندريا والنووية هي السمات المورفولوجية لموت الخلايا المبرمج. لتصور الميتوكوندريا والنوى ، قم بإجراء تلطيخ قبل وقت قصير من تصوير الخلايا الحية.

ابدأ بروتوكول التلوين بإضافة ميكرولترين من صبغة الميتوكوندريا أولا. تعقب معهد ماساتشوستس للتكنولوجيا أحمر 50 محلول مخزون ميكرومولار ، واثنين من ميكرولتر من صبغة الحمض النووي معقوفة 3 3 3 4 2 10 ملليغرام لكل مليلتر محلول مخزون في أنبوب طرد مركزي دقيق معقم ، أضف ملليلترا واحدا من وسط الثقافة المكيفة من طبق زراعة الخلية إلى أنبوب الطرد المركزي الصغير واخلطه جيدا مع البقع عن طريق سحب العينات. ثم يضاف الخليط مرة أخرى إلى طبق الثقافة.

بعد احتضان الطبق عند 37 درجة مئوية مع 5٪ ثاني أكسيد الكربون لمدة 20 دقيقة ، قم بشفط الوسط وغسل الخلايا الملطخة ثلاث مرات بمليلتر واحد من ثقافة الخلايا الدافئة أو محلول ملحي متوسط أو فوسفات. ثم احتضان الخلايا بوسط زراعة الخلايا عند 37 درجة مئوية مع 5٪ ثاني أكسيد الكربون لمدة خمس دقائق إضافية. تجنب وقت التلوين لفترات طويلة حيث يمكن أن تزداد إشارة الخلفية غير المحددة لخلايا البقعة بسبب الإفراط في التلوين.

بعد الحضانة ، استنشق الوسط ، واغسل الخلايا مرة أخرى ، ثم استمر في احتضان الخلايا بملليلترين من وسط زراعة الخلايا عند 37 درجة مئوية مع 5٪ ثاني أكسيد الكربون. يجب أن تصل مكونات المجهر إلى التوازن الحراري لتجنب انجراف التركيز وتحول مستوى XY بسبب التمدد الحراري وانكماش المكونات. لضمان تحقيق التوازن الحراري ، قم بتشغيل غرفة التحكم البيئي وحاضنة المرحلة لتسخين المجهر مسبقا إلى 37 درجة مئوية قبل ساعتين على الأقل من بدء التصوير.

ثم قم بتشغيل منظم ثاني أكسيد الكربون لتزويد غرفة التحكم البيئية بنسبة 5٪ من ثاني أكسيد الكربون. عندما لا يتوفر إمداد ثاني أكسيد الكربون ، يمكن استخدام وسط مستقل لثاني أكسيد الكربون لدعم نمو الخلايا. قبل التصوير ، ضع قطرة من زيت الغمر مباشرة على هدف 40 × بفتحة عددية 1.4.

ثم ضع طبق الثقافة برفق مع الخلايا الملطخة على حاضنة المرحلة 37 درجة مئوية. قم بتغطية الطبق بورق بارد شفاف لمنع فقدان الماء عن طريق التبخر وتلوث العينة لإجراء الفحص المجهري لتباين التداخل التفاضلي. لا تستخدم غطاء طبق الثقافة البلاستيكي لأن البلاستيك يمكن أن يزعج قطبية الضوء.

بعد ذلك ، حدد موقع مجموعة من الخلايا السليمة التي تنتشر على السطح الزجاجي مع الميتوكوندريا الأنبوبية والنوى المستديرة وركز عليها. اختر الخلايا الموجودة في مركز طبق المزرعة أو بالقرب منه للتأكد من أن الخلايا في نفس المستوى البؤري بمجرد وضعها في مكانها ، وقم بتعرض سريع عن طريق الفحص المجهري متحد البؤر لتحديد الحد الأدنى من شدة الليزر ووقت التعرض للحصول على صور واضحة للخلايا وعضياتها. هذه الخطوة حاسمة.

نظرا لأن ضوء الليزر سام للخلايا ، فإن التحسين والتعديل ضروريان للتخلص من انجراف التركيز ، استخدم جهاز تعويض انجراف التركيز التلقائي المستمر الذي يستخدم الصمام الثنائي الباعث للضوء بالأشعة تحت الحمراء. بدلا من ذلك ، يمكن تصحيح مستوى التركيز يدويا. عندما يتم تحديد الخلايا والمستوى البؤري ، قم بتحسين جميع المعلمات والتقط صورة اختبار قبل بدء تصوير الخلايا الحية.

ثم ابدأ التصوير المباشر لتصوير الخلايا السليمة بفواصل دقيقة واحدة لمدة 10 دورات للحث على موت الخلايا المبرمج. قم بإزالة وسط الخلية بماصة شفافة. ضع حافز موت الخلايا الممزوج مسبقا بوسط زراعة خلية 37 درجة مئوية على الطبق.

استمر في تغطية الطبق بورق عبادة شفاف. أثناء التصوير بفاصل زمني بعد تطبيق محفز موت الخلية ، اضبط الفاصل الزمني لتصوير الخلايا المعالجة للكشف عن موت الخلايا المبرمج عن طريق التقاط السمات المورفولوجية المميزة لموت الخلايا المبرمج مثل انقطاع غشاء البلازما ، وتجزئة الميتوكوندريا ، والتكثيف النووي والتجزئة ، والتكثيف السيتوبلازمي ، وانكماش الخلية ، وتكوين الجسم موت الخلايا المبرمج. عند ملاحظة موت الخلايا المبرمج ، قم بإزالة الوسط مع حافز موت الخلية وقم بتطبيق ملليلترين من وسط زراعة الخلايا الطازجة لاحتضان الخلايا.

استمر في التصوير بفاصل زمني لمراقبة الانتعاش المورفولوجي للخلايا ونتيجة الاستحمام. بعد إزالة محفز موت الخلايا الذي يموت سرطان الرئة البشري ، يمكن لخلايا H 4 46 عكس موت الخلايا المبرمج. على الرغم من أن الخلايا تظهر السمات المميزة لموت الخلايا المبرمج مثل انكماش الخلايا ، وثرثرة الغشاء ، وتجزئة الميتوكوندريا ، والتكثيف النووي ، والتجزئة وموت الخلايا المبرمج ، إلا أن تكوين الجسم بعد انقسام خلايا التوسع يمكن أن يكون غير طبيعي.

في هذا المثال ، بدلا من نواتين نقطتين ، تتشكل ثلاث نوى رئيسية بعد انقسام الخلية مع تكوين نوى دقيقة تشير إلى التغيرات الجينية في الخلايا المنقطة. يشير هذا إلى أن الاستحمام يمكن أن يكون مطفرات بعد تعرض الخلية لمحفز موت الخلية. تنتقل عوامل موت الخلايا المبرمج إلى الميتوكوندريا لتحفيز إطلاق السيتوكروم C ، مما يؤدي إلى تجميع التنشيط القائم على الجسيم الأولي والقالب لتدمير الخلايا ثم موت الخلايا المظهر.

فيما يلي خلايا HELOC التي تعبر عن GFP الموسومة بالسيتوكروم C ، والذي يتوجب في الميتوكوندريا بعد تحريض موت الخلايا المبرمج. يتم إطلاق السيتوكروم C في العصارة الخلوية. ومع ذلك ، بعد غسل الخلايا ثم احتضانها بعصارة خلوية متوسطة جديدة ، ينخفض السيتوكروم C مرة أخرى إلى المستويات الطبيعية مما يشير إلى أن الاستحمام يمكن أن يحدث بعد إطلاق السيتوكروم C.

تظهر هنا خلايا هيلا التي تعبر عن المستشعر الحيوي القائم على CA N-E-S-D-E-V-D-Y-F-P-N-L-S ، والذي يتم توطينه أولا في العصارة الخلوية بعد تحريض موت الخلايا المبرمج كما هو متوقع. ينتقل Y-F-P-N-L-S إلى النواة بسبب انقسام DEVD بواسطة قواعد الصب المنشطة. ومع ذلك ، بعد غسل محفز الموت وتحضين الخلايا بوسط جديد ، يبقى Y-F-P-N-L-S في النواة بينما تستعيد الخلايا مورفولوجيا طبيعية مما يشير إلى أن تدلي الجفون VA الانعكاسي يمكن أن يحدث بعد تنشيط قاعدة المصبوب.

بعد مشاهدة هذا الفيديو ، يجب أن يكون لديك فهم جيد لكيفية استخدام تصوير الخلايا الحية للكشف عن التشريح وعواقبه. في هذا العرض التوضيحي ، نستخدم الإيثانول كمحفز ATO. في الوقت نفسه ، يمكن للخلية عكس عملية موت الخلايا التي تسببها محفزات الموت الأخرى مثل teso DMSO و sporin ضوء الفلورسنت هو منشط للخلايا بحيث يكون من الأهمية بمكان تقليل الليالي التي تسخن عينة أثناء تصوير الخلايا الحية.

تعتمد عملية موت الخلايا المبرمج والاستراحة الليلية على الأنشطة الحساسة لدرجة الحرارة والسينماتيكية. لذلك ، من المهم الحفاظ على الخلايا في نفس درجة الحرارة للتجربة لضمان نتائج قابلة للتكرار.