تشكيل مستعمرة الفحص لينة آجار

الهدف العام من هذا الإجراء هو تحديد النمو المستقل للارتساء الخلوي. يتم تحقيق ذلك عن طريق طلاء طبقة من الأجار أولا على لوحة زراعة الخلية والسماح لها بالتصلب. الخطوة الثانية هي وضع خليط من الخلايا في أجار فوق طبقة الأجار السابقة.

بعد ذلك ، يسمح للخلايا بتكوين مستعمرات على مدى بضعة أسابيع. الخطوة الأخيرة هي تلطيخ المستعمرات للتصور والقياس الكمي. في النهاية ، يتم استخدام مقايسة تكوين مستعمرة الأجار الناعمة لإظهار نمو أنكوراج المستقل كمؤشر على التحول الخلوي.

الميزة الرئيسية لهذه التقنية على الطرق الأخرى ، مثل المقايسة الجينية Clon ، هي أن مقايسة تكوين مستعمرة الأجار الناعمة تتطلب من الخلايا تكوين مستعمرات بطريقة Anchorage المستقلة. ابدأ الإجراء بوضع ملصقات على كل بئر من مزرعة الأنسجة المعالجة. ستة ألواح بئر مناسبة لكل خط خلية أو حالة يتم فحصها.

بعد ذلك ، قم بإعداد اثنين من وسط زراعة Xcel عن طريق إذابة جرام واحد من وسط المسحوق و 0.2 جرام من بيكربونات الصوديوم في الماء منزوع الأيونات إلى حجم نهائي قدره 50 ملليلترا. مرر هذا الوسيط من خلال مرشح 0.2 ميكرون. أضف مكونات إضافية مطلوبة للثقافة الطبيعية لخط الخلية محل الاهتمام.

على سبيل المثال ، قم بزراعة خط خلية CMT 1 67 في وسط RPMI 1640 مكملا بمحلول 10٪ FBS و 1٪ بنسلين ستربتومايسين. دافئ متوسط إلى 37 درجة مئوية في حمام الماء الساخن قبل الاستخدام. الآن قم بإعداد وسيط ثقافة Xcel.

ثم قم بإعداد 1٪ أجار نبيل بإضافة جرام واحد من أجار نوبل إلى 100 مل من الماء منزوع الأيونات. بعد ذلك ، قم بإعداد 0.6٪ أجار نبيل بإضافة 0.6 جرام من أجار نبيل إلى 100 مل من الماء منزوع الأيونات. بعد ذلك الأوتوكلاف مخاليط أجار النبيلة.

بعد ذلك ، قم بعمل مليغرام واحد لكل مليلتر من محلول مخزون كلوريد النيترو الأزرق رباعي الأوليوم في XPBS واحد لغرض تلطيخ المستعمرات. في هذا الإجراء ، قم بتسخين زجاجة 1٪ من أجار نوبل في الميكروويف لمدة دقيقة إلى دقيقتين أثناء التسخين في الميكروويف. راقب المحلول عن كثب لتجنب الغليان.

ثم استمر في التسخين والخلط بشكل متقطع حتى يذوب الأجار تماما ويصبح المحلول صافيا. بعد ذلك ، ضع محلول الأجار المذاب ووسط الاستزراع المسبق في دلو ثلج مملوء ب 42 درجة مئوية. ماء الصنبور.

بالإضافة إلى ذلك ، ضع أنبوبا مخروطي سعة 50 مليلتر في حامل أنبوب في دلو الثلج بالماء الساخن. بعد ذلك ، انقل الدلو إلى غطاء مزرعة الخلية. ثم أضف ستة ملليلتر من وسط الاستزراع وستة ملليلتر من محلول أجار النبيل 1٪ إلى الأنبوب المخروطي سعة 50 مل.

الماصة لأعلى ولأسفل عدة مرات للخلط. العمل بوتيرة سريعة سيمنع التصلب المبكر للأجار الناعم. بعد ذلك ، ارسم ما يقرب من 5.5 مل من الخليط باستخدام ماصة مصلية سعة خمسة ملليلتر.

اسمح لفقاعات الهواء بالارتفاع إلى أعلى عمود الماصة. ثم ضع 1.5 مل من الخليط في كل بئر وتجنب ترسب أي فقاعات هواء. غطي الطبق واتركي خليط الأجار يتجمد في غطاء مزرعة الخلية في درجة حرارة الغرفة لمدة 30 دقيقة.

أولا ، قم بحصاد الخلايا بواسطة التربسين وتخفيفها من واحد إلى خمسة في الثقافة ، متوسطة في أنبوب مخروطي سعة 15 مل. عد الخلايا واحسب عدد الخلايا اللازمة لكل بئر لإعداد تعليق الخلية النهائي في هذا الوقت. بعد ذلك ، قم بإذابة محلول أجار 0.6٪ في الميكروويف.

ضعه في دلو ثلج يحتوي على ماء ساخن مع أنبوب مخروطي سعة 50 مليلتر في حامل أنبوب وتعليق الخلية النهائي. ثم انقل دلو الثلج مع 0.6٪ أجار ذائب إلى غطاء مزرعة الخلية للخطوات اللاحقة. لتحضير حجم إجمالي قدره 12 مل من تعليق الخلية لستة ألواح آبار ، ماصة أولى ستة ملليلتر من تعليق الخلية في الأنبوب المخروطي سعة 50 مل.

ثم أضف ستة ملليلتر من 0.6٪ أجار إلى الأنبوب. احتفظ بالخليط عند 42 درجة مئوية لتجنب التصلب المبكر ولزيادة بقاء الخلية. بعد ذلك ، قم بماصة الخليط بسرعة ، مرتين إلى ثلاث مرات لتوزيع الخلايا.

اسحب 5.5 مل من الخليط باستخدام ماصة مصلية سعة خمسة ملليلتر واترك أي فقاعات هواء ترتفع إلى أعلى عمود الماصة. ثم ضع 1.5 مل من الخليط في كل منها. حسنا ، اترك خليط أجار الخلية يتجمد في درجة حرارة الغرفة في غطاء مزرعة الخلية لمدة 30 دقيقة قبل وضعه في حاضنة زراعة الخلايا المرطبة بدرجة حرارة 37 درجة مئوية.

أضف 100 ميكرولتر من وسط النمو فوق الطبقة العليا من الأجار مرتين في الأسبوع لمنع الجفاف والسماح بحوالي 21 يوما لتكوين مستعمرة مناسبة. لتلطيخ الخلايا ، أضف 200 ميكرولتر من محلول كلوريد النيترو الأزرق رباعي الأوليوم إلى كل بئر واحتضان اللوحة طوال الليل عند 37 درجة مئوية. بمجرد تلطيخ المستعمرات ، التقط صورا للآبار باستخدام جهاز التصوير واحسب المستعمرات باستخدام برنامج تحليل الصور.

يظهر هنا مقايسة تكوين مستعمرة الأجار الناعمة للناقل الذي يعبر عن خلايا CMT 1 67 LNCX LPC X و CMT 1 67 LL ذهب سبعة تسعة مجعد فوق الخلايا المعبرة. المتجه الذي يعبر عن خلايا CMT 1 67 L و CXL PC X و CMT 1 67 LL ذهب سبعة أ و مجعد. تم طلاء تسع خلايا أكثر من الزائدة في مقايسة تشكيل مستعمرة أجار ناعمة CMT 1 67 LL ذهبت سبع خلايا مجعدة أظهرت تسع خلايا انخفاضا ملحوظا في تكوين المستعمرة بعد تطورها.

مهدت هذه التقنية الطريق للباحثين في مجال أبحاث السرطان لاستكشاف التحول الخلوي في المختبر. بعد مشاهدة هذا الفيديو ، يجب أن يكون لديك فهم جيد لكيفية تقييم الخلايا للنمو المستقل في Anchorage.