تقنيات التجريبية والتصوير لدراسة الهياكل الليفين الجلطة في السليمة والمصابة الولايات

الهدف العام من هذا الإجراء هو فحص الاختلافات المورفولوجية في هياكل الجلطات غير الطبيعية التي تحدث في مرض السكري وفقر الدم المنجلي ، والحالات المرضية لمحاكاة الجلطات السكرية. يتم تحقيق ذلك عن طريق تصوير هياكل الجلطة السكرية عن طريق المجهر متحد البؤر لعينات الدم من مرضى فقر الدم المنجلي. يتم تصوير جلطات الفيبرين التي تحتوي على خلايا الدم الحمراء في الوقت الفعلي.

يمكن بعد ذلك إجراء تحليل الفحص المجهري لتقييم معدلات تحلل الفيبرين على هياكل الجلطة الطبيعية والجليكري. في النهاية ، يمكن استخدام هذا التحليل في الوقت الفعلي لتقييم الاختلافات المورفولوجية التي تحدث في هياكل الجلطات غير الطبيعية استجابة لحالات المرض التي تنشأ فيها. يمكن أن تساعد هذه الطريقة في الإجابة على الأسئلة الرئيسية في مجال تجلط الدم والإرقاء ، مثل كيف تختلف هياكل جلطة الفيبرين في مرضى السكري أو مرض فقر الدم المنجلي.

لتقييم محاكاة الجلطات السكرية عن طريق الفحص المجهري متحد البؤر ، قم أولا بإذابة الفيبرينوجين البشري ، و 10٪ مترافق الفيبرينوجين البشري المسمى بالفلورسنت عند 37 درجة مئوية عندما تترافق المحاليل الدافئة المختلطة مع الفيبرينوجين البشري والفيبرينوجين في محلول كلوريد الصوديوم الجلوكوز واحتضان المحلول المحمي من الضوء في حمام مائي 37 درجة مئوية لمدة 48 ساعة. مع اقتراب نهاية الحضانة ، استخدم مادة لاصقة غير سائلة لتثبيت مادة لاصقة رقيقة على جانبي شريحة مجهر زجاجي لعمل غرفة ، ثم قم بخلط محلول الفيبرينوجين مع عامل درجة حرارة الغرفة 13 والثرومبين إلى حجم نهائي يبلغ 50 ميكرولترا ، وقم بنقل 30 ميكرولترا من محلول الفيبرين على الفور إلى غرفة انزلاق المجهر. الآن ضع زلة غطاء زجاجي مقاس 22 × 22 ملم بسماكة نقطة 15 ملم أعلى المادة اللاصقة وأغلق الجوانب المفتوحة للغرفة بمادة لاصقة شفافة مع الحرص على عدم تفاعل المادة اللاصقة مع الجلطة.

اترك جلطات الفيبرين تتبلمر عند 21 إلى 23 درجة مئوية لمدة ساعتين. ثم احصل على صور مجهرية متحدة البؤر للجلطات باستخدام هدف 40 × وليزر أرجون 488 نانومتر لتقييم الجلطات من مرضى فقر الدم المنجلي. قم أولا بتخفيف عينة خلايا الدم الحمراء بمقدار 1 مليون خلية لكل مليلتر في وسط زراعة الخلايا الخالية من المصل ، وخلط الخلايا بخمسة ميكرولترات من محلول وضع العلامات على الخلايا المناسب عن طريق سحب العينات اللطيف.

بعد 20 دقيقة عند 37 درجة مئوية ، اغسل الخلايا ثلاث مرات في وسط 37 درجة مئوية أثناء وجود الخلايا في جهاز الطرد المركزي ، مزيج محلول الفيبرينوجين المحضر حديثا 13 والثرومبين كما هو موضح للتو. ثم انقل 10 ميكرولترات من خلايا الدم الحمراء المسمى إلى محلول الفيبرين وقم على الفور بتوزيع 30 ميكرولترا من محلول الخلية في غرفة لاصقة. على شريحة المجهر الزجاجي ، اسمح للفيبرين بالبلمرة عند 21 إلى 23 درجة مئوية بعد ساعتين ، واحصل على صور متحدة البؤر للجلطات باستخدام ليزر الإثارة بأطوال موجية تبلغ 488 نانومتر و 633 نانومتر لإثارة خلايا الدم الفيبرينية والحمراء المسماة بالفلورسنت على التوالي.

لتقييم معدلات تحلل الفيبرين وهياكل الجلطات السكرية ، قم أولا بإعداد جلطات جليكوتية كما هو موضح للتو هذه المرة. ومع ذلك ، بعد الاستغناء عن محلول جلطة الفيبرين في الغرفة اللاصقة ، لا تغلق نهايات الغرفة. بدلا من ذلك ، اسمح للجلطات بالبلمرة عند 21 إلى 23 درجة مئوية في حاوية محكمة الغلق تحتوي على 250 مل من الماء لمنع الجفاف.

بعد ساعة ونصف ، احصل على صور للجلطات عن طريق الفحص المجهري متحد البؤر كما هو موضح للتو. ثم قم بإدخال 25 ميكرولترا من البلازمين في الطرف المفتوح للغرفة واسمح للبلازما بالتشتت في جميع أنحاء الجلطة عن طريق العمل الشعري. أخيرا ، افتح ميزات السلسلة الزمنية لبرنامج المجهر متحد البؤر ، وانقر فوق وضع الاستحواذ وحدد السلاسل الزمنية.

ثم حدد عدد الدورات والفاصل الزمني للتسجيل لالتقاط لقطات فيديو في الوقت الفعلي لتحليل الجلطات الناجمة عن البلازمين يكشف تحليل الجلطات الطبيعية والجلطات السكرية أن الجلطات السكرية أكثر كثافة مع مسام أصغر من الجلطات العادية ، مع أو بدون إضافة العامل 13 أثناء بلمرة الجلطة. في الواقع ، في الجلطات السكرية للأمم المتحدة ، هناك تركيز أقل من الفيبرين ، مما يخلق بنية أقل كثافة من تلك التي لوحظت في الجلطات السكرية ، والتي تحتوي على تركيز أعلى من الفيبرين. تحتوي جلطات الفيبرين من مرضى فقر الدم المنجلي على خلايا دم حمراء وتظهر هياكل أكثر كثافة من تلك الموجودة في جلطات الفيبرين الصحية بسبب زيادة تركيز الفيبرينوجين لدى هؤلاء الأفراد.

علاوة على ذلك ، فإن الميل الطبيعي لخلايا الدم الحمراء من مرضى فقر الدم المنجلي لتكوين مجاميع وجنس ، وكتل من خلايا الدم الحمراء التي تتشابك في شبكة الفيبرين ، مما يؤدي إلى تكوين هياكل جلطة شاذة تختلف بشكل ملحوظ في التشكل عن تلك التي لوحظت في المرضى العاديين. أخيرا ، يظهر تحليل معدلات تحلل الفيبرين للجلطات السكرية الطبيعية مقابل الجلطات السكرية ضعفا كبيرا في قدرة الجلطات السكرية المحاكاة على الفيبرين في حالة عدم وجود كمية كافية من البلازمين. سيساعد هذا البحث في تمهيد الطريق للباحثين في مجال تجلط الدم والإرقاء ، خاصة للمرضى الذين يصابون بأمراض مصاحبة نتيجة لمرض فقر الدم المنجلي والسكري.