تميز التركيب الجزيئي للسيارات على محور عصبي نقل البضائع عن طريق "شحن رسم الخرائط" تحليل

العام من رسم خرائط البضائع هو تحديد الكمية النسبية ونوع البروتينات الحركية الجزيئية التي ترتبط بالشحنات الحويصلية وتنقلها وربط هذه التركيبة من المحركات باتجاه حركة البضائع الحية. يتم تحقيق ذلك عن طريق زراعة الخلايا العصبية في الحصين الأولية للفأر أولا في أجهزة الموائع الدقيقة بحيث تنمو المحاور بشكل مستقيم نسبيا وعن طريق تسجيل الحركة الحية داخل الخلايا لبروتينات الشحن المسماة بالفلورسنت في محاور الخلايا العصبية المنقولة بشكل عابر. تتمثل الخطوة الثانية في إصلاح الخلايا العصبية أثناء تصوير البضائع الحية ، وبالتالي تلطيخ المحاور بالأجسام المضادة ضد البروتينات الحركية الجزيئية مثل كينيسين وداينز ، متبوعا بالتصوير المجهري المناعي.

بعد ذلك ، تتم محاذاة صور البضائع والمحركات الثابتة مع مخططات حركة البضائع بمرور الوقت ، والتي تسمى أيضا كرافت من أجل ربط حركة البضائع الحية بالمحركات المرتبطة الملطخة على النحو الذي يحدده تلطيخ الفلورسنت المناعي. تتمثل الخطوة الأخيرة في تحديد مواضع وحدات البكسل الفرعية للبضائع وبروتينات المحرك باستخدام حزمة برامج MATLAB مطورة خصيصا تسمى colocalization الحركية. يوفر هذا البرنامج إحداثيات XY الدقيقة لكل شحنة وموضع محرك ، بالإضافة إلى المقدار النسبي لشدة التألق المرتبطة بالبضائع والمحركات.

في النهاية ، يوفر ارتباط الفحص المجهري الفلوري للشحنات والمحركات الحية والثابتة على مستوى دقة البكسل الفرعية معلومات عن أنواع المحركات المرتبطة بشحنات معينة يعرف بها اتجاه الحركة. لذلك توفر هذه الطريقة نظرة ثاقبة لآلية نقل الإكسون. يمكن تطبيقه على دراسات أخرى تربط الفحص المجهري للحياة بالتلوين المناعي الفلوري ، مثل رابطة البروتينات مع الأنابيب الدقيقة أثناء ديناميكيات البوق الدقيقة أو تجنيد البروتينات أثناء الالتقام

سيساعد العرض المرئي لهذه الطريقة في تنفيذ خطوات تثبيت التصوير وتحليله ، والتي قد يكون من الصعب تعلمها لأنها تتطلب إعدادا متخصصا. يتم تحضير الخلايا العصبية الأولية للحصين الفأر لهذا الإجراء كما هو موضح في نص البروتوكول ويتم تعليقها في نمو البويضات القاعدية العصبية. متوسطة للوحة الخلايا العصبية في جهاز الموائع الدقيقة.

قم بإزالة الوسط من خزان الموائع الدقيقة الأول والأول. ضع 20 ميكرولترا من الخلايا على خزان الموائع الدقيقة واسمح لها بالتدفق من خلالها. ضع الجهاز في حاضنة 37 درجة مئوية مع 5٪ CO2 لمدة 20 دقيقة.

انظر تحت المجهر للتأكد من أن الخلايا قد تلتصق بالزجاج المغطى. أضف القاعدية العصبية ، وهي وسيط نمو لتتصدر جميع الخزانات. أعد الجهاز الذي يحتوي على خلايا إلى الحاضنة بحلول اليوم التاسع.

في الثقافة ، تقوم الخلايا العصبية بتمديد المحاور العصبية عبر القنوات الدقيقة وتكون جاهزة للتعداء للتعبير عن بروتينات الفلورسنت. يتم إجراء التصوير المباشر للخلايا العصبية الأولية للحصين الفأر المنقولة على مجهر ضوئي مضان epi مقلوب ، ومجهز بحاضنة 37 درجة مئوية وغرفة تحكم ثاني أكسيد الكربون. لبدء هذا الإجراء ، حدد هدف الزيت 100.

ضع الزيت على الهدف وقم بتركيب زلة الغطاء مع الخلايا العصبية الحصين المزروعة في جهاز ميكروفلويديك على مرحلة المجهر. لتجنب موت الخلايا العصبية ، اعمل على وجه السرعة للحفاظ على العينات في المجهر لمدة لا تزيد عن ساعة واحدة. ابحث عن محاور الخلايا المنقولة التي تمتد عبر قنوات غرفة الموائع الدقيقة.

سجل عدد القنوات التي تم العثور فيها على المحور العصبي المنقول. احسب عدد القنوات باستخدام عداد الإحصاء اليدوي للتسجيل الأمثل للحركة الحية وتحليل التحديد المشترك اللاحق. اختر المحاور التي تنمو بشكل مسطح نسبيا عبر القنوات بحيث يمكن إجراء تصوير معظم الحويصلات في التركيز.

لتسهيل المحاذاة اللاحقة للصور الثابتة مع مسارات الحركة على طعم chm. قم بمحاذاة الحافة اليمنى للقنوات الصغيرة مع مجال الرؤية أثناء التصوير. من أجل إصلاح الخلايا بنجاح أثناء التصوير المباشر ، من الأفضل تنفيذ الإجراء مع شخصين ، شخص واحد لإضافة المثبت وشخص آخر لضبط التركيز.

من المهم أيضا أن تكون جميع الكواشف جاهزة وفي متناول اليد. باستخدام ماصة نقل بلاستيكية سعة مليلتر واحد. قم بإزالة معظم الوسيط من الخزانين الثاني والثاني Prime Start لتصوير حركة البضائع الحية مع مواصفات الفاصل الزمني الخاصة بديناميكيات نقل البضائع التي يتم تحليلها.

بعد جمع بيانات كافية عن الحركة الحية ، اطلب من شخص واحد ملء الخزانات الثانية واثنين بمثبت التدفئة. تجنب لمس جهاز الموائع الدقيقة لأن هذا سيعطل تركيز التصوير المباشر. اطلب من الشخص الآخر ضبط التركيز أثناء إضافة التثبيت.

بنفس الطريقة ، املأ الخزانات الأول الأول بتثبيت التثبيت ناجحا عند ملاحظة التوقف الفوري للحركة. بعد ذلك ، يتم تلطيخ الخلايا العصبية الثابتة بأجسام مضادة ضد البروتينات الحركية الداخلية ويتم تصويرها كما هو موضح في نص البروتوكول. لبدء رسم خرائط البضائع ، قم بإنشاء كروموغراف لحركة البضائع باستخدام برنامج تحليل الصور.

يوصى باستخدام المكون الإضافي Image J الذي طورته Rich Dorf Insights لإنشاء Kraft باستخدام برنامج الرسومات المتاح تجاريا لمحاذاة صورة التألق المناعي للبضائع يدويا مع الرسم البياني CHM لحركة البضائع ، وتركيب نقطة البضائع على موضع المسارات في الرسم البياني CHM عند نقطة التثبيت بحيث تتوافق كل نقطة شحنة مع مسار معين على الرسم البياني CHM. للحصول على أفضل نتائج المحاذاة ، استخدم شريحة Z التي يتم التركيز عليها بشكل أفضل للشحنة التي تم تعيينها. يمكن استخدام عدة شرائح Z لكل صورة في مكدس Z.

حدد إحداثيات XY واتساع الشدة لكل نقطة فلورية باستخدام خوارزمية ثابتة لتناسب غاوسيان ثنائي الأبعاد لوظيفة انتشار النقطة التي تمثل مصادر النقاط في كل قناة من القنوات الثلاث. للحصول على إحداثيات XY ، تم تطوير حزمة برامج MATLAB مصممة خصيصا تسمى colocalization للمحرك ، والتي تتضمن خوارزمية تركيب Gaussian طورها Yakima DONA وزملاؤها لكل من نقاط الشحن الفردية التي تم تعيينها على المسارات المتنقلة أو الثابتة. في الرسم البياني Kog ، حدد إحداثيات XY واتساع الشدة من نتائج برنامج التموضع الحركي.

استخدم العديد من صور Zack لتعيين المزيد من الشحنات الموجودة في مستويات بؤرية مختلفة. قارن إحداثيات XY الفردية للشحنة المعينة بتلك التي تم الحصول عليها لكل قناة من قنوات المحرك في شريحة Z المقابلة. تحديد وتحديد إحداثيات محرك XY التي تقع داخل دائرة نصف قطرها 300 نانومتر من البضائع للشحنات والمحركات التي تشير داخل نفس المستوى البؤري.

استخدم حزمة برامج تحديد موقع المحرك لتحديد النقاط الموجودة داخل دائرة نصف قطرها 300 نانومتر. تم استخدام رسم خرائط البضائع لربط نقل الحويصلات التي تحمل بروتين البريون الطبيعي الموسوم ببروتين الفلورسنت الأصفر أو Y-F-P-P-R-P-C مع الكميات النسبية من كينيسين ومحركات الدين في المحاور. يوضح هذا الرسم البياني حركة حويصلة F-P-P-R-P-C ويشير الخط المنقط إلى وقت التثبيت أثناء التصوير المباشر.

تتم محاذاة الصور المضانية لحويصلات Y-F-P-P-R-P-C الثابتة بالإضافة إلى صور التألق المناعي المقابلة لسلسلة كينيسين الخفيفة الأولى وتناول الطعام مع كروموغراف. يظهر هذا التوسيع إشارات الفلورسنت المناعي لكل قناة من القنوات الثلاث مع تعيينات وظيفة gian ثنائية الأبعاد. يمثل هذا الرسم البياني القياس الكمي للتحديد المشترك بين حويصلات Y-F-P-P-R-P-C ، وسلسلة كينيسين الخفيفة الأولى وتناول الطعام في الخلايا العصبية من النوع البري وفي الخلايا العصبية التي تفتقر إلى سلسلة KINESIN الثقيلة.

الحصول على الكمية النسبية لسلسلة كينيسين الخفيفة الأولى والعشاء المرتبط بحويصلات Y-F-P-P-R-P-C من السعات الغوسية ويتم رسمها للتدقيق في الارتباطات المحتملة بين الكميات الحركية النسبية واتجاهية الحركة. يشير هذا المثال من الخلايا العصبية البرية إلى أن حويصلات Y-F-P-P-R-P-C ، التي تتحرك أو ثابتة ترتبط إما بسلسلة KINESIN الخفيفة أو العشاء أو كليهما بمجرد إتقان هذه التقنية يمكن إجراؤها في غضون ثلاثة أيام. بالإضافة إلى ما يقرب من 10 أيام من إعداد التصوير قبل الكهرومغناطيسي لأجهزة المملء الدقيقة والخلايا العصبية الأولية ، في غضون ثلاثة أيام ، ستتمكن من إجراء تصوير مباشر للتلطيخ المناعي الفلوري وتحليل البيانات.

بعد مشاهدة هذا الفيديو ، يجب أن يكون لديك فهم جيد لكيفية تسجيل الحركة الحية للشحنات والخلايا العصبية ذات العلامات الفلورية التي نمت في أجهزة الموائع الدقيقة. كيفية إصلاح الخلايا C أثناء التصوير ، وكيفية تحليل التحديد المشترك كدقة بكسل فرعية ، وكيفية ربط تحديد موقع الشحنات والبروتينات الحركية الجزيئية بحركة البضائع.