استخدام MALDI-TOF الطيف الكتلي وقاعدة بيانات مخصصة لتوصيف البكتيريا الأصلية إلى فريد كهف البيئة (Kartchner الكهوف، AZ، ​​الولايات المتحدة الأمريكية)

الهدف العام من هذا الإجراء هو تطوير وتطبيق وإظهار إجراء مفصل لتحديد البكتيريا المستندة إلى المكتبة باستخدام MALDI لقياس الطيف الكتلي. يتم تحقيق ذلك عن طريق اكتساب أطياف كتلة البكتيريا أولا باستخدام مطياف كتلة مالوف. في هذه الدراسة ، يتم جمع أطياف الكتلة المكونة من 15 بكتيريا معزولة من بيئة كاوية ، وشكل القمم الناتجة أو الأنماط المميزة أو بصمات الأصابع للبكتيريا التي تم تحليلها.

ثم يتم استيراد هذه الأطياف الكتلية إلى برنامج ويتم إنشاء قاعدة بيانات نموذجية. بعد ذلك ، تتم معالجة أطياف الكتلة المرجعية في قاعدة بيانات النموذج وتحليلها باستخدام تحليل الكتلة ومطابقة الذروة والتحليل الإحصائي. أخيرا ، يتم جمع الأطياف الكتلية للبكتيريا المشفرة العمياء ، والتي يتم اختيارها عشوائيا من هذه البكتيريا ال 15 مرة أخرى ومقارنتها بالأطياف المرجعية في قاعدة بيانات النموذج لنتائج التحديد أنه يمكن تحديد البكتيريا بشكل صحيح إما بناء على معاملات التشابه أو المؤشرات الحيوية المحتملة وفئات الذروة.

ابدأ هذا الإجراء بترسيب ميكرولتر واحد من مستخلص البروتين الذي لا يحتوي على خلايا قابلة للحياة على لوحة مستهدفة من الفولاذ المقاوم للصدأ واتركه حتى يجف. ثم قم بتراكب مستخلص البروتين المجفف بميكرولتر واحد من محلول المصفوفة واتركه حتى يجف. ثم قم بإيداع ميكرولتر واحد من معيار CBR على اللوحة المستهدفة بعد أن يجف ، وقم بتراكب CBR بميكرولتر واحد من محلول المصفوفة واتركه حتى يجف.

أخيرا ، قم بإيداع ميكرولترين من محلول المصفوفة على اللوحة المستهدفة كعنصر تحكم سلبي. استخدم مطياف الكتلة المتعدد والمجهز بليزر النيتروجين ويعمل باستخدام برنامج التحكم المرن Bruker. اجمع كل طيف كتلي في الوضع الخطي الموجب عن طريق تراكم 500 طلقة ليزر بزيادات 100 طلقة.

اضبط مصدر الأيونات على جهد واحد على 20 ، والكيلو فولت مصدر الأيونات ، والجهد الكهربائي إلى 18.15 كيلو فولت ، والجهد الكهربائي للعدسة إلى 9.05 كيلو فولت. هذه المعلمات خاصة بالأداة وقد تتطلب تحسينا. اضبط نطاق الكتلة على الشحن لتقييم الطيف الآلي من اثنين إلى 20 كيلودلتون لكل شحنة.

ثم قم بتعيين الحد الأدنى للدقة عند 100. حدد خوارزمية اكتشاف ذروة OID. اضبط عتبة نسبة الإشارة إلى الضوضاء عند اثنين ، وعتبة الحد الأدنى للشدة عند 100.

أخيرا ، قم بتعيين ذروة التراكم على 500 لتصميم قاعدة البيانات. قم بإنشاء قاعدة بيانات جديدة في الأرقام الحيوية 7.1 باستخدام معالج قاعدة البيانات الجديد. ثم قم بإنشاء نوع تجربة طيف مثل maldi، باستخدام الأوامر الموجودة في لوحة أنواع التجارب.

بعد ذلك ، قم بإنشاء المستويات باستخدام لوحة تصميم قاعدة البيانات ، وانتقل إلى قائمة قاعدة البيانات وأضف مستويات جديدة باستخدام الأمر إضافة مستوى جديد هنا. إنشاء مستوى الأنواع ومستوى التكرار البيولوجي والمستوى التقني. لاستيراد أطياف الكتلة الخام.

أولا ، قم بتصدير أطياف الكتلة الأولية كملفات نصية باستخدام التحليل المرن عن طريق التنقل في قائمة الملفات والنقر فوق الأمر تصدير الطيف الكتلي. ثم قم باستيراد أطياف الكتلة الخام إلى قاعدة البيانات على مستوى التكرارات التقنية. المعالجة المسبقة لأطياف الكتلة الخام عن طريق الاستيراد وإعادة التشكيل باستخدام خوارزمية التركيب التربيعي.

ثم قم بإجراء طرح أساسي باستخدام قرص دحرجة بحجم 50 نقطة لحساب الضوضاء باستخدام تحويل المويجة المستمر أو CWT. قم بتنعيم الأطياف باستخدام نافذة Kaiser بحجم نافذة 20 نقطة وبيتا من 10 نقاط. ثم قم بإجراء طرح أساسي ثان باستخدام قرص دحرجة بحجم 200 نقطة.

أخيرا ، اكتشف القمم باستخدام CWT مع نسبة إشارة إلى ضوضاء لا تقل عن 10 بعد المعالجة المسبقة للأنماط المميزة الآمنة لكل طيف كتلي ، مثل قوائم الذروة ، التي تحتوي على أحجام الذروة ، وشدة الذروة ، ونسبة الإشارة إلى الضوضاء. في المرحلة التالية، قم بإنشاء أطياف كتلة مركبة من الأطياف المعالجة مسبقا باستخدام الأمر الملخص في قائمة التحليل. اختر النسخ المتماثل البيولوجي كمستوى مستهدف. هنا.

اجمع بين أطياف الكتلة المكونة من 10 مكررات تقنية لنفس المستعمرة لإنتاج طيف كتلي مركب لتلك المستعمرة ، مما ينتج عنه ثلاثة أطياف كتلية مركبة لتلك العزل على مستوى التكرار البيولوجي. أخيرا ، لخص الطيف المركب الثلاثة لإنشاء طيف مركب واحد لهذا المعزول على مستوى الأنواع. لإجراء تحليل نظام المجموعة القائم على التشابه والقياس متعدد الأبعاد، قم بإنشاء مجموعات بالألوان.

أولا ، حدد أطياف الكتلة المركبة البيولوجية الثلاثة وانقر فوق أمر إنشاء مجموعة جديدة من التحديد في قائمة المجموعة لإنشاء مجموعة للعزل المقابل. ثم صمم لونا يستخدم تلقائيا لهذه الأطياف الكتلية الثلاثة. قم بإجراء تحليل نظام المجموعة عن طريق التنقل في قائمة التجميع والنقر فوق الأمر حساب تحليل نظام المجموعة.

في إعدادات المقارنة، الصفحة الأولى، حدد ارتباط بيرسون واترك المعلمات الأخرى كإعداد افتراضي. في الصفحة الثانية ، حدد طريقة مجموعة الأزواج غير المرجحة مع المتوسط الحسابي. ثم انقر فوق إنهاء.

احصل على مخطط قياس متعدد الأبعاد باستخدام أمر القياس متعدد الأبعاد في قائمة الإحصائيات لإجراء مطابقة الذروة. انقر فوق نوع الطيف maldi في لوحة التجارب. ثم حدد التخطيط.

تظهر الصورة ، يتم عرض قمم الأطياف الفردية. ثم قم بإجراء مطابقة الذروة باستخدام الأمر do peak matching في قائمة الأطياف لتحديد فئات الذروة التي تقوم بإجراء تجميع ثنائي الاتجاه بالنقر فوق مصفوفة الإحصائيات. تعدين. يتم تمثيل شدة القمم المطابقة لفئات الذروة كخريطة حرارية لتحديد البكتيريا باستخدام الطريقة القائمة على معامل التشابه ، وإنشاء مقارنة وإنشاء رسم بياني بناء على أطياف الكتلة على مستوى التكرار الفني كما تم إجراؤه لتحليل الكتلة ، وحفظ الرسم البياني لمقارنة التشابه.

حدد طيفا كتليا غير معروف وانقر فوق التحليل. تحديد الإدخالات المحددة. يظهر مربع حوار التعريف.

حدد نوع المصنف المستند إلى المقارنة، وانقر فوق التالي. في الصفحة التالية، اختر الجرام المحفوظ كمقارنة مرجعية، ثم انقر فوق التالي. اختر التشابه الأساسي كطريقة تحديد ومرة أخرى ، انقر فوق التالي ، واختر الحد الأقصى للتشابه كطريقة تسجيل التسجيل.

اكتب قيم الحد المناسبة وقيم الحد الأدنى للفرق لكل معلمة، ثم انقر فوق التالي. بمجرد اكتمال العمليات الحسابية، تظهر نافذة التعريف في لوحة النتائج. يتم سرد أعضاء قاعدة البيانات الذين يتطابقون بشكل أفضل مع المجهول.

يظهر الرسم البياني المستند إلى تحليل التجميع تشابها بين كل عزلة في قاعدة البيانات. تحتوي مجموعة البيانات على أطياف من 15 نوعا مختلفا مع ثلاثة أطياف مركبة لكل نوع. يمكن أن يساعد التحليل العنقودي ثنائي الاتجاه الباحثين على تحديد المؤشرات الحيوية المحتملة لنوع أو سلالات داخل الأنواع.

هنا ، يتم تمثيل كثافة الذروة بالألوان ، والأخضر يعني كثافة منخفضة ، والأحمر يعني كثافة عالية. أخيرا ، بناء على هذا التحليل ، يمكن مقارنة الطيف الكتلي للمجهول بالجرام ويتم تحقيق تحديد قائم على معامل التشابه.