تنقية انجاس: تسلسل Metagenomes وMetatranscriptomes من مجمع عينات المرتبط الحيوانية

الهدف العام من هذا الإجراء هو جمع ومعالجة العينات المرتبطة بالمضيف المعقد مثل التليف الكيسي والبلغم ، لدراسة المجتمعات الفيروسية والميكروبية باستخدام مناهج النسخ الميتاجينومية والميتا. يتم تحقيق ذلك عن طريق استنشاق الشخص أولا ، 7٪ محلول ملحي مفرط التوتر عبر البخاخات ، ثم جمع عينات البلغم المستحثة على مدى فترة زمنية مدتها 30 دقيقة. بعد ذلك ، يتم تجانس العينة على الفور وتوزيعها بالتساوي في أربعة أنابيب تسمى ميتاجينوم فيروسي ، وميتاجينوم ميكروبي ، ونسخ فوقية ، وبلغم إضافي.

بعد ذلك ، يتم إغلاق أنبوب النسخ الفوقي ، ووضعه أفقيا وتجانس البلغم بسرعة متوسطة لمدة 10 دقائق. أخيرا ، تتم معالجة الحصص الفردية بشكل منفصل لعزل وتنقية الخلايا الفيروسية أو البكتيرية قبل عزل الحمض النووي للدراسات الميتاجينومي. في النهاية ، يتم استخدام الأحماض النووية المعزولة لإعداد مكتبة التسلسل عالي الإنتاجية لإنشاء مكتبات الميتاجينوميات والنسخ الفوقية.

الميزة الرئيسية لهذا الإجراء هي أنه يوفر سير عمل شاملا لمعالجة عينة معقدة مرتبطة بالمضيف لدراسة المجتمعات الفيروسية والبكتيرية على مستوى الحمض النووي والحمض النووي الريبي. يعد العرض المرئي لهذا الإجراء أمرا بالغ الأهمية لأن خطوات المعالجة المسبقة للعينة مهمة لضمان التعامل السليم مع العينة بينما يصعب تعلم خطوات تنقية الخلايا الفيروسية والميكروبية نظرا للتعقيد في الإجراء قبل جمع العينات ، قم بتسمية أربعة أنابيب سعة 15 مليلتر لكل عينة بما يلي ، الأول مع ميتاجينوم فيروسي ، والثاني مثل ميتاجينوم الميكروبات رقم ثلاثة مع النسخ الفوقي والأنبوب رقم أربعة كبلغم إضافي. أضف ملليلترين من حبات السيليكا 0.1 ملم في الأنبوب المسمى النسخ الفوقي ، متبوعا بستة ملليلتر من محلول تحلل الحمض النووي الريبي القائم على إيزوثيوسيانات غينيا ، أو المخزن المؤقت لتحلل GITC.

باتباع إجراء جمع العينات الموضح في بروتوكول النص وباستخدام أكواب عينة ما قبل الخوض ، قم بتقدير حجم العينة عن طريق وزن الكوب بعد جمع العينة وطرح وزن الكوب الفارغ. بالنسبة للوزن المتبقي ، سيكون الجرام الواحد يعادل ملليلتر واحد من العينة. إذا كان حجم العينة أقل من ثمانية ملليلترات ، فأضف الحجم المناسب البالغ 0.02 ميكرومتر مفلتر XPBS واحد ليصل الحجم النهائي إلى ثمانية ملليلترات.

ثم استخدم على الفور حقنة سعة ثلاثة ملليلتر لتجانس العينة حتى لا تبقى كتل مرئية داخل البلغم باستخدام نفس المحقنة ، واسحب على الفور ملليلترين من البلغم وحقنها في أنبوب النسخ الصغير الذي يحتوي على حبات السيليكا ومخزن تحلل GITC. أغلق الغطاء واستخدم طبقة para لإغلاق الغطاء بإحكام لتجنب التسرب ، استخدم دوامة ، سيدي لتجانس البلغم على الفور بسرعة متوسطة لمدة 10 دقائق. باستخدام نفس الحقنة ، يتم نقل ملليلترين من البلغم في كل من الأنابيب المسماة فيرا ميتاجينوم وميتاجينوم الميكروبي ، ونقل البلغم المتبقي من كوب البلغم إلى الأنبوب المسمى البلغم الإضافي.

قم بتخزين جميع الأنابيب عند أربع درجات مئوية أو على الجليد وانقلها إلى المختبر إذا لزم الأمر لتوليد ميتاجينوم فيروسي. بعد إعداد المخازن المؤقتة والحلول. معالجة العينات مسبقا عن طريق إضافة محلول مائي مصحح مفلتر 0.02 ميكرومتر إلى الحجم الإجمالي البالغ ستة ملليلتر.

للمساعدة في إذابة المخاط ، أضف ستة ملليلتر من 6.5 ملليمولار من DTT إلى كل عينة. دوامة بقوة للخلط والحضانة لمدة ساعة واحدة عند 37 درجة مئوية. بعد الدوامة بقوة ، تدور العينات مرة أخرى عند 3056 جي و 10 درجات مئوية لمدة 15 إلى 20 دقيقة.

اجمع كل مادة طافية في أنبوب جديد سعة 15 مل. بعد ذلك ، استخدم مرشحا بحجم 45 ميكرومتر مركب على حقنة لتصفية المواد الطفية في أنابيب جديدة سعة 15 ملليلترا. قم بإزالة 100 ميكرولتر من العينة في أنبوب فوج دقيق ثم قم بإجراء معالجة الكلوروفورم.

استخراج المادة الطافية وإجراء علاج DN واحد. أضف حجما متساويا قدره 4٪ من الفورمالديهايد لإصلاح العينة. للفحص المجهري الفلوري epi ، راجع بروتوكول النص للحصول على نهج تخصيب الجسيمات الفيروسية الشاملة.

بخلاف ذلك ، باستخدام محاليل كلوريد السيزيوم المحضرة حديثا ، قم بإعداد تدرج كلوريد السيزيوم عن طريق تحميل مليلتر واحد من 1.7 جرام لكل مليلتر من محلول كلوريد السيزيوم في كل أنبوب ، متبوعا بمليلتر واحد من 1.5 جرام لكل مليلتر ، ومليلتر واحد من نقطة واحدة 35 جرام لكل مليلتر ، وأخيرا ، مليلتر واحد من 1.2 جرام لكل مليلتر من محلول كلوريد السيزيوم. أخيرا ، قم بتحميل ستة إلى ثمانية ملليلتر من العينة في أنابيب التدرج الفردية. ضع علامة على الطبقات الفردية للإشارة إلى موقع كل كسر.

ثم قم بموازنة كل زوج متعارض من الثنائيات في حدود ملليغرام واحد. قفل كل أنبوب بعناية في دلو الدوران. قم بالتحميل على الدوار وجهاز الطرد المركزي عند 82 و 844 جيجا وأربع درجات مئوية لمدة ساعتين.

بعد الطرد المركزي ، قم بإزالة الأنابيب بعناية من الحامل دون تعطيل تدرجات الكثافة بإبرة قياس 18 متصلة بحقنة سعة ثلاثة ملليلتر. تأكد من أن الطرف المفتوح للإبرة متجه لأعلى. اخترق الأنبوب أسفل طبقة الكثافة 1.5 جرام لكل مليلتر واسحب ببطء ما يقرب من 1.5 ملليلتر من المحلول في المحقنة.

قم بإزالة الإبرة ببطء واترك الجزء المتبقي في الأنبوب بالتنقيط في أنبوب جديد سعة 15 مليلتر من خلال الثقب. قم بتسمية هذا على أنه خصر الجزء العلوي انقل المحلول في المحقنة التي تحتوي على V ps إلى أنبوبين جديدين من أجهزة التدوين الدقيقة. بمجرد تحضير المخازن المؤقتة والمحاليل ، وفقا لبروتوكول النص ، أضف خمسة أحجام من النقطة 22 ميكرومتر مفلترة XPBS واحد لتخفيف كل متجانس تحت غطاء كيميائي ، أضف بيتا MAR capta ethanol إلى حجم 2٪ إلى التركيز النهائي للحجم ، وهز الخليط في درجة حرارة الغرفة لمدة ساعتين بعد الحضانة.

قم بتدوير العينة عند 3056 GS و 10 درجات مئوية لمدة 15 دقيقة. بعد التخلص من المادة الطافية ، استخدم 10 مل من الماء الجزيئي لإعادة تعليق الحبيبات واحتضانها في درجة حرارة الغرفة لمدة 15 دقيقة قبل تكرار الغسيل. بعد الدوران النهائي ، وبمجرد التخلص من SUP natin ، استخدم خمسة ملليلتر من مخزن مؤقت XDNA واحد لإعادة تعليق الحبيبات قبل إضافة 15 ميكرولتر من ds.

واحد لكل مليلتر من العينة يحتضن عند 37 درجة مئوية مع الخلط المتكرر لمدة ساعتين. بعد تدوير العينات والتخلص من snat ، استخدم 10 مل من المخزن المؤقت SE لإعادة تعليق الحبيبات. ثم قم بتدوير العينة وكرر الغسيل.

استخدم ملليلترين من المخزن المؤقت SE لإعادة تعليق الحبيبات ونقل التعليق إلى أنبوبين صغيرين. ثم قم بتدوير الأنابيب عند 16 ، 000 GS في درجة حرارة الغرفة لمدة 15 دقيقة. أخيرا ، بعد إزالة المادة الطافية ، استخدم مجموعة استخراج الحمض النووي الجيني باتباع التعليمات الخاصة بالبكتيريا موجبة الجرام.

لعزل الحمض النووي ، يتم تلخيص النتائج السابقة لتوليد الميتاجينومات الفيروسية هنا. تحتوي الفيروسات على القليل من التسلسلات المشتقة من الإنسان مع عينة واحدة فقط تحتوي على 70٪ من عينة الحمض النووي البشري CCF أربعة A تم حذفها من خطوة الطرد المركزي الفائق لتدرج الكثافة ، ونتيجة لذلك ، احتوت على أكثر من 97٪ من التسلسلات المشتقة من الإنسان. يوضح هذا الشكل صورة فلورية لعينة نموذجية من بلغم التليف الكيسي قبل وبعد الطرد المركزي الفائق لتدرج الكثافة.

لوحظ vlp واضح في غياب الجسيمات الكبيرة بعد فصل تدرج الكثافة الموضح هنا. تم جمع سبع عينات يومية من البلغم من مريض واحد بالتليف الكيسي بدأ المضادات الحيوية عن طريق الفم. بعد اليوم الثالث من التجميع ، تراوح العائد الإجمالي للتحلل المنخفض التوتر المشتق أو HL DNA الذي تم جمعه من كل عينة من 210 نانوغرام إلى أكثر من خمسة ميكروغرامات من مكتبات تسلسل Illumina التي تم إنشاؤها لكل عينة.

أسفرت جميع المكتبات باستثناء واحدة عن أكثر من مليون تسلسل وتم الاحتفاظ بأكثر من 85٪ من التسلسلات عالية الجودة عند المعالجة المسبقة للبيانات. باستخدام برنامج تسلسل الطباعة ، تراوحت الكمية الإجمالية للتسلسلات المشتقة من الإنسان من 14٪ إلى 46٪ كما هو موضح هنا ، فإن الملامح الميكروبية للعينات الفرعية تشبه إلى حد كبير العينات بعد علاجين للتحلل المنخفض التوتر. بالإضافة إلى ذلك ، يزيد التحلل الثاني منخفض التوتر من جزء التسلسلات غير البشرية بنسبة ستة إلى 17٪ داخل الميتاجينوم.

لا تنس أن العمل مع العينات السريرية ومسببات الأمراض المحتملة يمكن أن يكون خطيرا للغاية. يجب دائما استخدام معدات الحماية الشخصية في جميع الأوقات أثناء مناولة العينة. هناك حاجة إلى تقنيات جيدة للبيولوجيا الجزيئية وعلم الأحياء الدقيقة أثناء تنفيذ هذا الإجراء لضمان عدم وجود تلوث.

باتباع هذا الإجراء ، يجب أن تكون قادرا على إجراء دراسات ميتاجينومية فيروسية وميكروبية ، بالإضافة إلى دراسات النسخ الفوقي من عينات معقدة مثل بلغم التليف الكيسي.