يعيش التصوير لل ذبابة الفاكهة العذراء العين
يناير 12, 2015
يقدم هذا البروتوكول طريقة فعالة لتصوير ذبابة الفاكهة الظهارية العصبية الحية للعين العذراء. تعوض هذه الطريقة عن حركة الأنسجة والطوبولوجيا غير المتكافئة ، وتعزز تصور حدود الخلية من خلال استخدام العديد من بروتينات التوصيل الموسومة ب GFP ، وتستخدم جهاز تصوير سهل التجميع.
الهدف العام من هذا الإجراء هو إظهار طريقة فعالة لتوليد أفلام تصوير حية لذبابة الفاكهة لنمو عين حدقة الوثبابية. يتم تحقيق ذلك عن طريق إزالة التجعيد O لحالة التلميذ وتمزيقها على طول الجانب لكشف الظهارة العصبية لعين واحدة. الخطوة الثانية هي تجميع جهاز التصوير وتركيب الخادرة على حبة صغيرة من الفازلين.
يتم الحصول على الأقسام التسلسلية التالية من الظهارة العصبية في منطقة حزام الالتصاق باستخدام مجهر مضان قياسي. الخطوة الأخيرة هي تثبيت اللقطات وإجراء تعديلات على الألوان في برنامج تحرير الصور القياسي. في النهاية ، يتم استخدام تصوير الخلايا الحية للظهارة العصبية ذبابة الفاكهة لتوضيح سلوكيات الخلية التي تتناسب مع هذا النمط.
يعد العرض البصري للعين لهذه الطريقة أمرا بالغ الأهمية لأن تشريح الخادرة جزئيا ثم تركيبها بشكل صحيح في جهاز التصوير قد يكون أمرا صعبا لأن الشرانة هشة إلى حد ما في هذه المرحلة. بالإضافة إلى ذلك ، يعد الاتجاه الصحيح للخادرة والموضع الصحيح لزلة الغطاء فوق ظهارة العين أمرا بالغ الأهمية للتصوير الناجح. يوضح الإجراء مارك هيلرمان من مختبرنا.
لبدء التجربة ، حدد prepuy الأبيض من الأنماط الجينية المتقاطعة مسبقا وضعها في أنابيب طرد مركزي سعة 1.5 ملليلتر. بعد ذلك ، ضع قطعة من الأنسجة بحجم 10 سم مربع مبللة بالماء المقطر في صندوق طرف بلاستيكي نظيف. أدخل أنابيب الطرد المركزي الدقيقة في صندوق الطرف.
سيمنع النسيج المبلل جفاف العذراء ، ثم يحتضن عند 25 درجة مئوية لمدة 17 إلى 25 ساعة. بعد الحضانة ، ضع قطعة من الشريط اللاصق الطازج على الوجهين على طبق تشريح السيجار الأسود. ضع الجانب الظهري للخادرة لأعلى على الشريط وتأكد من توصيل رأس الخادرة بالشريط على الوجهين دون الالتصاق بالمناطق الصدرية والبطنية من الخادرة.
باستخدام الملقط ، ارفع وقم بإزالة التجعيد A بعناية لكشف رأس التلميذ. بعد ذلك ، قم بتمزيق جانب علبة التلميذ. لفضح المنطقة المحيطة بعين واحدة ، قم بإزالة التلميذ برفق من الشريط اللاصق.
قم ببناء إطار صغير ملم 15 ملم مربع من ورق النشاف وقم بعمل ثقب بطول خمسة ملليمترات في المنتصف. اغمر الإطار والماء المقطر وضعه في وسط المجهر. انزلق بحقنة 30 سم مكعب.
اضغط على حلقة موحدة من الفازلين لإحاطة إطار ورق النشاف. بعد ذلك ، أضف حبة صغيرة من الفازلين مباشرة على الشريحة. رتب الخادرة بعناية على جانبها وادعمها بحبة الفازلين.
ضع زلة غطاء أعلى حلقة الفازلين بحيث تلامس الظهارة فوق العين. اضغط برفق على المستحضر لإغلاق زلة الغطاء ضد الفازلين وإنشاء سطح تلامس صغير مسطح بين منطقة عين التلميذ وصورة زلة الغطاء ، وإعداد حدقة العين. باستخدام المجهر الفلوري ، التقط المقاطع التسلسلية من خلال مجال AAL للعين ، الظهارة العصبية في منطقة تقاطع الالتصاق كل سبع دقائق.
استخدم برنامج فك الالتواء المناسب لتقليل الخلفية وتعزيز تباين صور القسم التسلسلي لكل ملف Zack وبرنامج L-A-S-A-F. انتقل إلى لوحة الأدوات. حدد 3D deconvolution وانقر فوق تطبيق.
قم بإنشاء حد أقصى للإسقاط أو صورة MP لكل ملف مكدس معقد. قم بمحاذاة كل صورة MP لتسليط الضوء على سلوكيات الخلية الفردية وتقليل الانحرافات الناتجة عن نمو الكائنات الحية. باستخدام الخوارزميات المضمنة في Photoshop CS five من علامة تبويب الملف في القائمة الرئيسية، افتح البرامج النصية وحدد تحميل الملفات في مكدس.
بعد ذلك ، قم باستيراد ملفات صور MP إلى لوحة طبقات التحميل. تأكد من عدم تحديد خيار محاولة محاذاة الصور المصدر تلقائيا. خلاف ذلك ، قد يتم تشويه بيانات الصورة.
بمجرد تحميل جميع ملفات MP في جزء الطبقات ، تحقق من أن جميع الصور بترتيب زمني وأن أقرب نقطة زمنية موجودة في أعلى الطبقة. قم بتكديسها وسحبها وإفلاتها حتى يتم ترتيبها بشكل صحيح. إذا لزم الأمر، فحدد محاذاة الطبقات التلقائية.
اختر تغيير الموضع وانقر فوق موافق. خارج نطاق التركيز ، يمكن تصحيح مناطق صورة MP الأولية للحصول على مجال شبكية موحد في التركيز. لبدء معالجة الصور ، استخدم وظيفة الاقتصاص في LAS.
يقومSaf يدويا بتقييد الشرائح الأولية والنهائية ، بحيث تمتد فقط على حزام الالتصاق داخل المنطقة الخارجة عن التركيز البؤري في البداية. انقر فوق تطبيق لإنشاء ملف مكدس جديد محسن لهذه المنطقة. بعد ذلك ، قم بإنشاء حد أقصى جديد للإسقاط للمكدس المحسن محليا وتصديره كملف TIF في Photoshop.
افتح البرامج النصية وحدد تحميل الملفات في مكدس. ثم أدخل ملف MP الأولي وملف MP المحسن في لوحة طبقات التحميل. مرة أخرى ، تأكد من عدم تحديد خيار محاولة محاذاة الصور المصدر تلقائيا وحدد موافق.
حدد كلتا الطبقتين واختر طبقات المزج التلقائي لإنتاج مجال شبكية في التركيز بشكل موحد. احفظ هذه الصورة المركبة كملف TIF. استخدم أداة تحويل لتدوير الصور بحيث يتم محاذاة المحور البطني الظهري لشبكية العين مع المحور Y لإطار الفيلم.
استخدم ضبط مستوى الإطارات الفردية لتعزيز التباين بين غشاء الخلية وجسم الخلية. ثم حدد إنشاء إطارات من الطبقات لتحويل الصور إلى فيلم. لاحظ أنه تتم إضافة الطبقات إلى جزء الرسوم المتحركة بترتيب تسلسلي بدءا من أسفل المكدس.
لعكس ترتيب المكدسات، حدد كل الإطارات ثم حدد الإطارات العكسية. حدد وقت تأخير الإطار البالغ 0.8 ثانية لكل إطار واختر QuickTime. قم بتصدير وتحديد تنسيق الفيديو المطلوب.
أخيرا ، ضمن خيارات العرض ، حدد معدل الإطارات للتخصيص وأدخل معدل إطارات 15. ثم انقر فوق العرض. لوحظ تدرج تنموي واضح عبر العين باستخدام هذه التقنية ، مما دفع إلى وصف مفصل لتزيين العين.
أثناء الالتفاف الأولي ، تم تجنيد خليتين كانتخابات تمهيدية ، والتي أحاطت بسرعة بحزم المستقبلات الضوئية المتصلة ببعضها البعض لتشكيل تقاطعات مستقرة. توجد خلايا المواد الداخلية غير المتمايزة في نمط غير منظم حيث يتم لف الانتخابات التمهيدية وإغلاقها. كل حزمة مستقبلات ضوئية حركات الخلايا المحلية المعاد تنظيمها.
الخلايا العنيائية مجمعة في الجانبين الظهري والبطني لكل ورم إعادة ترتيب الخلايا بين الخلايا من صفين في صف واحد. بعد التقاطع بين المنافسة ، تم التقاط المنافسة الثالثة تحت المجهر.
احتلت الخلايا المتنافسة مكانة من الدرجة الثالثة لمدة خمس إلى 10 دقائق قبل النزوح. في النهاية ، أنشأت خلية واحدة مكانة مستقرة من الدرجة الثالثة. أثناء التقليم النهائي ، أدت زيادة موت الخلايا المبرمج إلى تقليل عدد ICS إلى الحد الأدنى المطلوب لتوليد شبكة خلية مادية مدخلة بكفاءة عبر العين المركبة.
بمجرد إتقانها ، يمكن إجراء تصوير معدات الوقاية الشخصية في غضون أربع ساعات إذا تم إجراؤها بشكل صحيح. تستغرق معالجة الصور اللاحقة حوالي ساعة واحدة.
اعرض النص الكامل واحصل على الوصول إلى آلاف الفيديوهات العلمية
نظرة عامة
يقدم هذا البروتوكول طريقة فعالة لتصوير عين شرانق الدروسوفيلا الحية. تعوض الطريقة عن حركة الأنسجة والطوبولوجيا غير المتساوية، مما يعزز رؤية حدود الخلايا من خلال بروتينات التقاطع الموسومة بـ GFP متعددة.
مكونات الدراسة الرئيسية
مجال العلم
- علم الأعصاب
- بيولوجيا التطور
- تقنيات التصوير
الخلفية
- التصوير الحي ضروري لدراسة العمليات التنموية.
- تعمل الدروسوفيلا ككائن نموذجي لدراسات التطور العصبي.
- يجب أن تعالج تقنيات التصوير التحديات مثل حركة الأنسجة.
- البروتينات الموسومة بـ GFP تعزز رؤية الهياكل الخلوية.
هدف الدراسة
- لعرض طريقة لتصوير حي لتطور عين شرانق الدروسوفيلا.
- لتوضيح سلوكيات الخلية خلال نمذجة الظهارة العصبية.
- لتوفير بروتوكول يمكن تكراره بسهولة من قبل الباحثين.
الطرق المستخدمة
- إزالة غشاء O من غلاف الشرانق.
- تجميع جهاز تصوير لتثبيت العينة.
- تثبيت الشرانق على هلام البترول للتصوير.
- اكتساب أقسام متسلسلة باستخدام مجهر فلوري.
النتائج الرئيسية
- تثبيت ناجح للقطات التصوير الحي.
- رؤية محسنة لحدود الخلايا الظهارية العصبية.
- رؤى حول سلوكيات الخلية خلال تطور العين.
- يمكن تكييف البروتوكول لتطبيقات تصوير مختلفة.
الاستنتاجات
- يوفر البروتوكول طريقة موثوقة للتصوير الحي.
- يسمح بملاحظة تفصيلية للعمليات التنموية.
- قد تمتد التطبيقات المستقبلية إلى دراسات تطورية أخرى.
الأسئلة الشائعة
Executive Industry Relevance
Live imaging of the Drosophila pupal eye enables direct observation of cellular dynamics during neuroepithelial patterning, providing a scalable model for de-risking target validation in developmental pathways. The method addresses tissue movement and topological variability, supporting reproducible quantitative analysis of cell behaviors critical for mechanistic studies in early discovery.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Scientific Value: Enables interrogation of therapeutic hypotheses by visualizing cell recruitment, junction formation, and intercalation during eye patterning.
- Operational Value: Stabilizes imaging data to reduce noise from organismal movement, improving consistency in phenotypic readouts.
- Predictive Value: Supports functional target validation by linking molecular perturbations to observable changes in cell boundary dynamics and tissue architecture.
Screening & Assay Development
- Assay Readiness: Generates stabilized maximum projection images suitable for automated analysis of membrane localization and fluorescence intensity.
- Reproducibility: Uses standardized mounting and alignment protocols to minimize technical variance across time points and samples.
- Scalability: Compatible with multi-well adaptation and high-content imaging platforms for compound screening in disease-relevant systems.
Translational & Preclinical Research
- Disease Relevance: Provides a genetically tractable system to model conserved pathways in human neurodevelopment and retinal degeneration.
- Translational Continuity: Bridges discovery-scale imaging with preclinical validation by enabling longitudinal tracking of cellular processes.
- Mechanistic De-risking: Clarifies causal relationships between gene function and tissue morphogenesis, reducing ambiguity in target mechanism.
Pipeline & Workflow Integration
The workflow fits within the discovery biology phase, supporting hypothesis-driven investigation of cellular mechanisms prior to assay development and lead identification stages.
- Discovery Biology: Facilitates direct observation of cell behaviors such as primary cell wrapping and intercalation, enabling pathway clarification and target de-risking.
- Assay Readiness: Produces quantifiable image stacks that can be segmented and analyzed for fluorescence dynamics, supporting assay standardization.
- Analytics: Enables measurement of cell movement, junction stability, and spatial reorganization as quantitative outputs for comparative condition testing.
- Translational Research: Offers a disease-relevant system to validate findings in models of human retinal or epithelial disorders.
- Enterprise Reuse: Establishes a reusable imaging platform adaptable to multiple GFP-tagged targets and genetic backgrounds.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Reduces mechanistic ambiguity by linking genetic perturbations to real-time cellular phenotypes in a living tissue context.
- Operational Value: Enhances reproducibility through standardized specimen mounting, image stabilization, and projection techniques.
- Strategic Value: Improves go/no-go decision confidence by providing direct visual evidence of target engagement in developmental pathways.
- Portfolio Impact: Enables risk-adjusted prioritization of targets based on functional validation in a dynamic, physiological system.
Implementation Considerations
- Requires expertise in Drosophila handling, fluorescence microscopy, and basic image processing.
- Dependent on access to deconvolution software and standard image editing tools for motion correction and contrast enhancement.
- Necessitates cross-team standardization of mounting protocols and time-lapse acquisition settings for reproducible results.
- Adaptation to other tissues may require optimization of dissociation, mounting, and fluorescent labeling strategies.
- Practical limitations include specimen fragility during preparation and the need for environmental control to prevent desiccation.
Biopharma FAQs
Chapters in this video
0:05
Title
1:26
Tissue Preparation
2:44
Mounting and Flourescence Imaging
4:27
Image Processing - Automatic Image Alignment
5:32
Image Processing - Composite Sharpening
6:52
Image Processing - Adjustments and Animation
8:02
Results: Complex Developmental Gradients Pattern the Drosophila Eye
9:32
Conclusion
