Name: plusTipTracker باستخدام برنامج لقياس ديناميكية في أنيبيب القيطم المورق المخاريط النمو (فيديو) | JoVE Journal
Uploaded: 2014-09-07T15:00:00.000+00:00
Duration: 7 min 32 s
Description: اكتشف كيفية تحليل ديناميكية الأنيبيبات الدقيقة في مخاريط نمو أجنة Xenopus باستخدام برنامج plusTipTracker. تتيح هذه الطريقة الكشف والتتبع الآلي السريع لبروتينات +TIP الموسومة بـ EB1-GFP.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

نشكر الدكتور Gaudenz Danuser وأعضاء مختبره على إنشاء برنامج plusTipTracker وعلى المناقشة المفيدة فيما يتعلق باستخدام البرنامج ، ولا سيما Maria Bagonis و Sebastien Besson. نشكر بشكل خاص المركز الإعلامي لكلية بوسطن على مساعدتهم ودعمهم في إنشاء الفيديو وتحريره. كما نشكر أعضاء مختبر لوري على المناقشات المفيدة والنقد البناء ، ونشكر أبيجيل أنطوان على تدقيق المخطوطة. تم تمويل هذا العمل من خلال جائزة المعاهد الوطنية للصحة R00 MH095768 ل LAL.

وتهدف هذا البروتوكول والفيديو لتكون بمثابة رفيق إلى الورقة الأصلية التي تصف مجموعة من البرامج في مزيد من التفاصيل 4، وكذلك التقرير الفني الذي يأتي مع تحميل البرمجيات على الموقع Danuser مختبر. ويتم تشجيع القراء لمراجعة هذه الوثائق بعناية إذا كانت هناك أسئلة إضافية بشأن استخدام البرنامج. 1. قبل تحليل الصور <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> تحويل كل فيلم الوقت الفاصل في سلسلة من TIFF (تنسيق ملفات الصور ذات الكلمات الدلالية) ملفات الصور. إذا كان هناك مخاريط النمو متعددة / الخلايا في فيلم معين، المحصول الأول كل مخروط النمو / خلية لخلق تسلسل الصور الخاصة به. ملاحظة: هذا ليس من الضروري، كما يمكن اختيار مناطق من المصلحة الفردية (ROI) ضمن plusTipTracker. ومع ذلك، باستخدام أبعاد الصورة أصغر يزيد من سرعة المعالجة الحسابية، لذلك يوصى هذه الخطوة إذا كان هناك مساحة فارغة كبير في الصورة. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> حفظ كل سلسلة TIFF في تلقاء نفسهامجلد يسمى &quot;الصور&quot; ضمن مسار التي تم تعيينها MATLAB للوصول (لاحظ أن &quot;الصور&quot; حساس لحالة الأحرف). لإضافة مسار جديد، انتقل إلى الدليل الملفات ذات الصلة في الإطار &quot;المجلد الحالي&quot;، انقر بزر الماوس الأيمن على أيقونة دليل، وحدد &quot;إضافة إلى مسار - مختارة المجلدات والمجلدات الفرعية&quot;. من المهم أن يتم إضافة مجلد البرامج plusTipTracker إلى مسار، كذلك. </li></ol> 2. plusTipGetTracks ملاحظة: الخطوة الأولى في تحليل الصور هي للكشف عن المذنبات-EB1 GFP، ربط المذنبات في المسارات، وتحديد معايير ديناميات أنيبيب. يتم الحصول على هذا مع &quot;plusTipGetTracks&quot; القيادة 4. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> لبدء تحليل، تطبيق مفتوح MATLAB واكتب &quot;plusTipGetTracks&quot; في إطار الأوامر. سيؤدي هذا إلى مربع حوار جديد لتظهر. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> انقر على &quot;إقامة مشروعات جديدة&quot; واختيار واحد (أو موره) من TIFF صورة سلسلة السابقة عن طريق اختيار &quot;الصور&quot; المناسبة مجلد (أو الدلائل التي تحتوي على &quot;صور&quot; المجلدات). عند الانتهاء من هذه الخطوة، دليل الملف (roi_1) سيتم إنشاء (في نفس المجلد الذي يحمل &quot;صور&quot;) التي سوف تحتوي على ملفات البيانات في المستقبل. ملاحظة: &quot;تعيين مشروعات جديدة&quot; خطوة يمكن أن تكتمل في وقت مبكر، خلال جلسة منفصلة. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> سوف تظهر نافذة جديدة: &quot;تحديد المضلع، انقر بزر الماوس الأيمن على النقطة الأخيرة، وانقر على &#39;إنشاء قناع&quot;. انقر على &quot;OK&quot;. وبعد ذلك يتم عرض الصورة الأولى من سلسلة الصورة المحددة. استخدام الماوس للنقر وإنشاء المضلع الذي يشمل مجمل مخروط النمو. انقر نقرا مزدوجا فوق الماوس لإغلاق المضلع. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> مرة واحدة تم إغلاق المضلع، سوف تظهر مربع حوار: &quot;هل تريد تحديد العائد على الاستثمار أخرى؟&quot; إذا كانت الصورة لديه مخروط النمو لتحليل آخر، حدد &quot;نعم&quot;. ق غير ذلكالمنتخب &quot;لا&quot;. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> تحديد المشاريع التي سيتم تحليلها فورا. انقر على &quot;تحديد المشاريع&quot; وحدد المجلد (roi_X) لتحليل. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ستظهر شاشة listSelectGUI. حدد المشروع (ق) من الجانب الأيسر من الشاشة ونقلها إلى الجانب الأيمن من الشاشة. انقر على &quot;OK&quot;. اختيار موقع لحفظ القائمة المشروع ثم انقر فوق &quot;حفظ&quot;. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> حدد &quot;الكشف&quot;، &quot;تتبع&quot;، و &quot;ما بعد المعالجة&quot;. مرة واحدة تم إجراء هذه الاختيارات، فإن الجانب الأيمن من مربع الحوار أصبح شكلي. تكوين كل خيار. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> وتستخدم هذه المعايير لربط الكشف عن المذنبات في المسارات MT. وترد تفاصيل لاختيار هذه المعايير تحكم لتتبع على صفحات 9-10 من التقرير الفني PDF التي ترافق حزمة برامج التحميل؛ قراءة هذا التقرير بعناية إذا واجهت المشاكل. لأغراض تتبع المذنبات EB1-GFP في Xenopلنا المورق مخاريط النمو، واستخدام إعدادات تتبع التالية: ابحث عن أنصاف المدى المدى (بكسل) 5-12، الحد الأدنى للطول المسار الفرعية (إطارات) 3. أقصى طول الفجوة (إطارات) 8؛ ماكس فاكتور انكماش 0.8، ماكس زاوية الأمام 50، ماكس زاوية الخلف 10، تذبذب الشعاع 2.5. وتظهر هذه الإعدادات في الشكل 1. </li></ol> ملاحظة: يتم تعيين انكماش ماكس فاكتور للحد من عدد من &quot;الثغرات المتخلفة&quot; الكشف، إذ أن &quot;الثغرات المتخلفة&quot; ليست مفيدة لتحليل في سياق مخاريط النمو، نظرا للظروف مزدحمة والأخطاء المحتملة في الروابط المسار. بالإضافة إلى ذلك، يتم تعيين كل من زاوية ماكس الأمام وكذلك تذبذب الشعاع عالية نسبيا، والنظام التجاري المتعدد الأطراف مخروط النمو تظهر translocations صغيرة متكررة بالإضافة إلى معدلات النمو والإنكماش، وزيادة هذه إعدادات التحكم تسمح هذه الحركة المتزايدة خلال خطوة الربط. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ملء تجهيز بوست إعدادات تبعا لإعدادات محددة الحصول على الصور المطلوبة. </li></ol> &lt;/ لى&gt; <li style=";text-align:right;direction:rtl"> بمجرد تكوين الإعدادات، انقر على &quot;ابدأ&quot;. سيتم تشغيل البرنامج أيهما إعدادات تم اختيارها. قد يستغرق هذا دقائق إلى ساعات، اعتمادا على عدد من المشاريع المختارة وأحجامها. يعرض إطار الأوامر الوقت المتبقي المقدر لكل وظيفة. عند اكتمال الخطوة plusTipGetTracks، وإطار الأوامر سيتم عرض &quot;انتهى!&quot; ملاحظة: هناك قائمة طويلة من الآن تم احتساب معايير محددة للديناميات MT بواسطة هذا البرنامج (انظر المرجع 4 لمزيد من التفاصيل)، ولكن لتحليل ديناميات MT في مخاريط النمو، المعلمات الأكثر فائدة لدراسة MT هي مسار النمو سرعة (في ميكرون / دقيقة)، عمر مسار النمو (في ثوان)، وطول مسار النمو (في ميكرون). </li></ol> 3. plusTipSeeTracks ملاحظة: الآن وبعد أن المسارات أنيبيب تم تحديدها، فإن وظيفة &quot;plustipSeeTracks&quot; يستخدم لمسار التصور 4. هذه الوظيفةيمكن أن توفر نواتج متعددة لتصور، بما في ذلك الخرائط الديناميكية MT المكانية والأفلام السرعة، ولكن هنا، يكون التركيز فقط على استخدام &quot;الأفلام المسار&quot; لعرض المسارات MT فرضه على الصور مخروط النمو. بينما يمكن plusTipGetTracks تحليل الأفلام متعددة في وقت واحد، يمكن plusTipSeeTracks تحليل فيلم واحد فقط في المرة الواحدة. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> اكتب &quot;plusTipSeeTracks&quot; في إطار الأوامر. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> بعد تحميل مربع الحوار، انقر على &quot;المشروع أختر&quot;. حدد الدليل الأم يحتوي المشروع على تصور وانقر على &quot;تحديد المجلد&quot;. سوف تظهر نافذة جديدة: &quot;حدد المشروع الذي تريد تصور&quot;. اختيار ملف لتصور وانقر على &quot;OK&quot;. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> بعد ذلك، انقر على &quot;حدد المحفوظة العائد على الاستثمار&quot;. انتقل إلى نفس المجلد roi_X بوصفها واحدة المختارة في الخطوة السابقة ثم حدد الملف المسمى &quot;roiYX&quot;. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> انقر على &quot;تحديد دليل إخراج&quot; لتعيين ثهنا سوف MATLAB حفظ الملفات التصور المسار. ملاحظة: نوصي باستخدام نفس المجلد الذي يحتوي على بقية البيانات. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> حدد &quot;جعل المسار فيلم&quot; وسوف تظهر شاشة عرض كل plusTipGetTracks المسارات تحسب من المذنبات TIP +. هذه الخطوة يحفظ سلسلة زمنية تتبع في شكل فيلم، في ملف &quot;allTracks_X_X_X&quot;. هناك خيار لإنقاذ الفيلم باعتباره AVI، وإلا فإن التنسيق الافتراضي هو كملف Quicktime.mov. </li></ol> 4. plusTipGroupAnalysis ملاحظة: يتم استخدام هذه الدالة النهائية لإنشاء مجموعات من الأفلام لتحليل ومقارنة MT المعلمات مسارها. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> اكتب &quot;plusTipGroupAnalysis&quot; في إطار الأوامر. لتحديد المجموعات يدويا للمقارنة، الأول دي حدد &quot;مجموعة السيارات من التسلسل الهرمي&quot;. ثم، انقر على &quot;تحديد المشاريع&quot;. انتقل إلى الدلائل الأصل تحتوي على جميع المجلدات roi_Xلتحليل. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ستظهر شاشة listSelectGUI. تحديد كافة المشاريع التي تدرج في مجموعات من الجانب الأيسر من الشاشة ونقلها إلى الجانب الأيمن من الشاشة. انقر على &quot;OK&quot;. اختيار موقع لحفظ القائمة المشروع ثم انقر فوق &quot;حفظ&quot;. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> سوف تظهر نافذة: &quot;الرجاء تحديد المجموعة الأولى من القائمة&quot;. انقر على &quot;OK&quot;. سوف نافذة listSelectGUI عرض مرة أخرى. هذا الوقت، حدد فقط تلك الملفات التي تتوافق مع المجموعة الأولى التي ينبغي تجميعها معا. انقر على &quot;OK&quot;. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ثم، أدخل اسم المجموعة، وانقر على &quot;OK&quot;. سوف تظهر نافذة: &quot;حدد مجموعة أخرى؟&quot; الإجابة وفقا لذلك وتستمر اختيار المجموعات. سوف تظهر نافذة: &quot;حدد موقعا لحفظ قائمة مجموعتك&quot;. انتقل إلى الموقع وانقر على &quot;حفظ&quot;. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> انقر على &quot;اختر الناتج دليل&quot; لاختيار المجلدات حيث الناتج ستكونالمخزنة. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> تحديد أي نوع من التحليل لإجراء مجموعة - سواء المسارات MT يجب تجميع لكل مجموعة أو لكل خلية التحليل يجب أن يتم تنفيذ. تم تعيينها بالفعل الاختبارات الإحصائية الموصى بها. لتشمل جميع المسارات في التحليل، وعدم اختيار &quot;إزالة المسارات في بداية / نهاية فيلم&quot;. خلاف ذلك، وجود هذا الإطار المحدد يزيل أي مسارات النمو MT التي هي في العملية حيث يبدأ الفيلم أو ينتهي. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> بعد إجراء تحليل اختيار المجموعة، حدد &quot;قارن مجموعات&quot;. </li></ol>

<ol><li>Stepanova, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Visualization+of+microtubule+growth+in+cultured+neurons+via+the+use+of+EB3-GFP+%28end-binding+protein+3-green+fluorescent+protein%29%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+neuroscience+%3A+the+official+journal+of+the+Society+for+Neuroscience%22%5BJournal%5D)">Visualization of microtubule growth in cultured neurons via the use of EB3-GFP (end-binding protein 3-green fluorescent protein).</a> The Journal of neuroscience : the official journal of the Society for Neuroscience. 23, 2655-2664 (2003).</li>
<li>Lee, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+microtubule+plus+end+tracking+protein+Orbit%2FMAST%2FCLASP+acts+downstream+of+the+tyrosine+kinase+Abl+in+mediating+axon+guidance%5BTitle%5D)+AND+%22Neuron%22%5BJournal%5D)">The microtubule plus end tracking protein Orbit/MAST/CLASP acts downstream of the tyrosine kinase Abl in mediating axon guidance.</a> Neuron. , 913-926 (2004).</li>
<li>Purro, S. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Wnt+regulates+axon+behavior+through+changes+in+microtubule+growth+directionality%3A+a+new+role+for+adenomatous+polyposis+coli%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+neuroscience+%3A+the+official+journal+of+the+Society+for+Neuroscience%22%5BJournal%5D)">Wnt regulates axon behavior through changes in microtubule growth directionality: a new role for adenomatous polyposis coli.</a> The Journal of neuroscience : the official journal of the Society for Neuroscience. 28, 8644-8654 (2008).</li>
<li>Applegate, K. T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((plusTipTracker%3A+Quantitative+image+analysis+software+for+the+measurement+of+microtubule+dynamics%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+structural+biology%22%5BJournal%5D)">plusTipTracker: Quantitative image analysis software for the measurement of microtubule dynamics.</a> Journal of structural biology. 176, 168-184 (2011).</li>
<li>Lowery, L. A., Faris, A. E., Stout, A., Van Vactor, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Neural+Explant+Cultures+from+Xenopus+laevis%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+visualized+experiments+%3A+JoVE%22%5BJournal%5D)">Neural Explant Cultures from Xenopus laevis.</a> Journal of visualized experiments : JoVE. (68), e4232(2012).</li>
<li>Long, J. B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Multiparametric+analysis+of+CLASP-interacting+protein+functions+during+interphase+microtubule+dynamics%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+and+cellular+biology%22%5BJournal%5D)">Multiparametric analysis of CLASP-interacting protein functions during interphase microtubule dynamics.</a> Molecular and cellular biology. 33, 1528-1545 (2013).</li>
<li>Myers, K. A., Applegate, K. T., Danuser, G., Fischer, R. S., Waterman, C. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Distinct+ECM+mechanosensing+pathways+regulate+microtubule+dynamics+to+control+endothelial+cell+branching+morphogenesis%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+cell+biology%22%5BJournal%5D)">Distinct ECM mechanosensing pathways regulate microtubule dynamics to control endothelial cell branching morphogenesis.</a> The Journal of cell biology. 192, 321-334 (2011).</li>
<li>Nishimura, Y., Applegate, K., Davidson, M. W., Danuser, G., Waterman, C. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Automated+screening+of+microtubule+growth+dynamics+identifies+MARK2+as+a+regulator+of+leading+edge+microtubules+downstream+of+Rac1+in+migrating+cells%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">Automated screening of microtubule growth dynamics identifies MARK2 as a regulator of leading edge microtubules downstream of Rac1 in migrating cells.</a> PLoS One. 7, e41413(2012).</li>
<li>Akhmanova, A., Steinmetz, M. O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Tracking+the+ends%3A+a+dynamic+protein+network+controls+the+fate+of+microtubule+tips%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+reviews.+Molecular+cell+biology%22%5BJournal%5D)">Tracking the ends: a dynamic protein network controls the fate of microtubule tips.</a> Nature reviews. Molecular cell biology. 9, 309-322 (2008).</li>
<li>Schuyler, S. C., Pellman, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Microtubule+%27plus-end-tracking+proteins%27%3A+The+end+is+just+the+beginning%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Microtubule 'plus-end-tracking proteins': The end is just the beginning.</a> Cell. 105, 421-424 (2001).</li>
<li>Mitchison, T., Kirschner, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Dynamic+instability+of+microtubule+growth%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Dynamic instability of microtubule growth.</a> Nature. 312, 237-242 (1984).</li>
<li>Mimori-Kiyosue, Y., Shiina, N., Tsukita, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+dynamic+behavior+of+the+APC-binding+protein+EB1+on+the+distal+ends+of+microtubules%5BTitle%5D)+AND+%22Current+biology+%3A+CB%22%5BJournal%5D)">The dynamic behavior of the APC-binding protein EB1 on the distal ends of microtubules.</a> Current biology : CB. 10, 865-868 (2000).</li>
<li>Dixit, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Microtubule+plus-end+tracking+by+CLIP-170+requires+EB1%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences+of+the+United+States+of+America%22%5BJournal%5D)">Microtubule plus-end tracking by CLIP-170 requires EB1.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 106, 492-497 (2009).</li>
<li>Li, W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((EB1+promotes+microtubule+dynamics+by+recruiting+Sentin+in+Drosophila+cells%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+cell+biology%22%5BJournal%5D)">EB1 promotes microtubule dynamics by recruiting Sentin in Drosophila cells.</a> The Journal of cell biology. 193, 973-983 (2011).</li>
<li>Maurer, S. P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((EB1+accelerates+two+conformational+transitions+important+for+microtubule+maturation+and+dynamics%5BTitle%5D)+AND+%22Current+biology+%3A+CB%22%5BJournal%5D)">EB1 accelerates two conformational transitions important for microtubule maturation and dynamics.</a> Current biology : CB. 24, 372-384 (2014).</li>
<li>Zanic, M., Widlund, P. O., Hyman, A. A., Howard, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Synergy+between+XMAP215+and+EB1+increases+microtubule+growth+rates+to+physiological+levels%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+cell+biology%22%5BJournal%5D)">Synergy between XMAP215 and EB1 increases microtubule growth rates to physiological levels.</a> Nature cell biology. 15, 688-693 (2013).</li>
<li>Lowery, L. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Growth+cone-specific+functions+of+XMAP215+in+restricting+microtubule+dynamics+and+promoting+axonal+outgrowth%5BTitle%5D)+AND+%22Neural+development%22%5BJournal%5D)">Growth cone-specific functions of XMAP215 in restricting microtubule dynamics and promoting axonal outgrowth.</a> Neural development. 8, 22(2013).</li>
<li>Marx, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Xenopus+cytoplasmic+linker-associated+protein+1+%28XCLASP1%29+promotes+axon+elongation+and+advance+of+pioneer+microtubules%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+biology+of+the+cell%22%5BJournal%5D)">Xenopus cytoplasmic linker-associated protein 1 (XCLASP1) promotes axon elongation and advance of pioneer microtubules.</a> Molecular biology of the cell. 24, 1544-1558 (2013).</li>
</ol>

يعلن المؤلفون أنه ليس لديهم مصالح مالية متنافسة.

يوفر PlusTipTracker واضحة، واجهة المستخدم الرسومية بسرعة وتلقائيا للكشف مرئية تقريبا جميع المذنبات EB1-GFP في زنزانة أو النمو مخروط، ربط المذنبات في المسارات، وحساب المعلمات MT. وذكرت وغيرها من المطبوعات تصميم أنواع مماثلة من البرامج (على سبيل المثال، ماركس وآخرون. تستخدم أيضا التحليل الكمي لديناميات EB1 الموسومة في مخاريط النمو 18). ولكن، وهذا البرنامج يبدو أن تكون فريدة من نوعها في سهولة الوصول، كما يتم تنزيله مجانا من موقع مختبر Danuser، والتي تتخصص في تصميم...

الهدف من هذه الطريقة هو الحصول على المعلومات الكمية المتعلقة أنيبيب (MT)، بالإضافة إلى تتبع نهاية البروتين (+ TIP) ديناميات يعيشون في مخاريط النمو. MT + النصائح هي مجموعة من البروتينات التي لتوطين زائد الغايات من النظام التجاري المتعدد الأطراف 9،10. أنها تؤدي مجموعة من الوظائف لتنظيم المعلمات من عدم الاستقرار الديناميكي MT 11، بما في ذلك معدلات البلمرة، كارثة، والإنقاذ. واحد الطريقة المستخدمة جيدا لتحليل ديناميات MT هو تتبع سلوك EB1 TIP +، الذي يربط خصيصا لتزايد MT زائد 1،12 ينتهي. ومن المعروف EB1 لتجنيد عدة بروتينات أخرى لتزايد MT زائد ينتهي 13،14، ومؤخرا تم تأسيس كعامل MT النضج 15، وتعزيز كلا MT النمو وتردد كارثة 15،16. وقد استخدمت العديد من الدراسات ديناميات MT داخل مخاريط النمو طرق ناحية تتبع لقياس التغيرات في ديناميات EB1-GFP مع مرور الوقت 1-3، وEB1 localizatiإلى MT زائد نهايات يمكن أن تستخدم كعلامة للMT البلمرة. ومن المزايا الرئيسية لدراسة المذنبات EB1-GFP كبديل للنمو MT هي أن ديناميات MT يمكن قياسها حتى في مناطق التداخل MT كبير. في حين أن طريقة المذنبات EB1-GFP تتبع ناحية قدمت معلومات مفيدة إلى MT السلوكيات 1-3، فمن وقتا طويلا ويمكن أن يكون متحيزا. بالإضافة إلى ذلك، كما هي السلوكيات الشاذة النمو مخروط الأرجح نتيجة التحولات الدقيقة في ديناميات هيكل الخلية وتحليلها فقط مجموعة فرعية صغيرة من النظام التجاري المتعدد الأطراف (عادة اللازمة عند اليد تتبع) قد يغيب عن معلومات مهمة. وبالتالي، فإننا قياس المعلمات ديناميات MT العالمية باستخدام حزمة البرامج، plusTipTracker 4، بعد الحصول على عالية الدقة، والصور الحية من المعلمة EB1 في تربيتها مخاريط النمو الجنيني 5. هذا البرنامج، وضعت في مختبر Danuser، وقد استخدم في العديد من الدراسات التي تميز ديناميكية MT في مختلف أنواع الخلايا 6-8. وهو مفتوح المصدر، لنادية إيه، الحزمة استنادا MATLAB التي تشمل الكشف الآلي، وتتبع، والتصور، والتحليل للأفلام من fluorescently المسمى + النصائح. وهناك قائمة طويلة من تحسب معايير محددة للديناميات MT بواسطة هذا البرنامج (انظر المرجع 4 لمزيد من التفاصيل)، ولكن لتحليل ديناميات MT في مخاريط النمو، المعلمات الأكثر فائدة هي MT مسار النمو سرعة (في / ميكرون دقيقة)، مسار النمو عمر (ثانية)، وطول مسار النمو (في ميكرون). البرنامج يمكن تحميلها مباشرة من موقع Danuser مختبر (تحت &quot;البرنامج&quot;). في حين مختبر Danuser تدعم حاليا واجهة تعليقات أحدث ل + تحليل تتبع TIP، والتي يتم تضمينها في حزمة البرمجيات دعا يو المسار 2.0، ستبقى الأصلي، قائمة بذاتها البرمجيات المتاحة. خوارزميات الكامنة بين البرنامجين هي نفسها (على الأقل عام 2014)، مع وجود اختلاف في واجهة وتحليل النواتج. بالنسبة للمستخدم المبتدئ مع قليل MATLAB و / أو تحليل الحسابية جتربةسينعقد، plusTipTracker ديه المزيد من الميزات سهلة الاستخدام، بما في ذلك الآلية مخرجات المعلمة الإحصائية. هنا، نحن تصف الخطوات لتحليل الصور من ديناميات EB1-GFP في تربيتها القيطم المورق مخاريط النمو. تم استخدام هذا البروتوكول في ورقة حديثة دراسة ديناميات MT 17. انظر أيضا لوري وآخرون 2012 5 للحصول على تعليمات مفصلة عن مخاريط النمو زراعة معربا عن EB1-GFP. في حين أن هذه الورقة تركز في المقام الأول على دراسة ديناميات EB1-GFP في مخاريط النمو، نفس البروتوكول يمكن استخدامها لأنواع الخلايا الأخرى 17. لجميع أنواع الخلايا، يجب أن يكون الفاصل الزمني بين الإطارات بين 0.5-2 ثانية لتتبع الأمثل + TIP. فترة زمنية تصل إلى 4 ثواني بين الإطارات هو ممكن، ولكن هذه النتائج زيادة الفاصل الزمني في تتبع أخطاء إضافية.

<table><tbody><tr><td>plusTipTracker البرنامج</td><td>Danuser Lab</td><td><a href="http://lccb.hms.harvard.edu/software.html">http://lccb.hms.harvard.edu/software.html</a></td>قد <td>يتم استضافة هذا البرنامج من قبل موقع ويب آخر في المستقبل. إذا لم يكن الموقع المدرج موجودا ، فابحث عن "Danuser Lab Software" على محرك بحث الويب للعثور على الموقع.</td></tr><tr><td>برنامج MATLAB</td><td>Mathworks</td><td><a href="http://www.mathworks.com/products/matlab/">http://www.mathworks.com/products/matlab/</a></td><td></td></tr></tbody></table>

plustiptracker باستخدام برنامج لقياس ديناميكية في أنيبيب القيطم المورق المخاريط النمو

Using plusTipTracker Software to Measure Microtubule Dynamics in Xenopus laevis Growth Cones

أنيبيب (MT) زائد تتبع نهاية البروتينات (+ نصائح ل) تعريب لتزايد بالإضافة إلى الغايات من النظام التجاري المتعدد الأطراف وتنظيم ديناميات MT 1،2. واحدة من النصائح الأكثر معروفة وتستخدم على نطاق واسع + لتحليل ديناميات MT-ملزم هو نهاية البروتين، EB1، الذي يربط جميع MT زائد نهايات المتزايد، وبالتالي، هو علامة لMT البلمرة 1. وقد استخدمت العديد من الدراسات من السلوك EB1 داخل مخاريط النمو تستغرق وقتا طويلا وبمساعدة الحاسوب متحيزة وطرق ناحية تتبع لتحليل فردي النظام التجاري المتعدد الأطراف 1-3. نهجنا هو قياس المعلمات العالمية لديناميات MT باستخدام حزمة البرامج، plusTipTracker 4، بعد اكتساب عالية الدقة، والصور الحية من المعلمة EB1 في تربيتها مخاريط النمو الجنيني 5. هذا البرنامج هو ومفتوحة المصدر، حزمة سهلة الاستعمال تستند MATLAB الذي يجمع بين الكشف الآلي، وتتبع، والتصور، والتحليل للأفلام من fluorescently المسمى + النصائح. هنا، نقدم بروتوكول لاستخدام plusTipTracker لتحليل + المذنبات TIP fluorescently المسمى في تربيتها القيطم المورق مخاريط النمو. ومع ذلك، يمكن أيضا أن تستخدم هذا البرنامج لوصف ديناميات MT في مختلف أنواع الخلايا 6-8.

باستخدام هذا البرنامج كما هو موضح هنا سيقدم عدة ملفات من المعلومات التي قياس ديناميكية TIP + في الخلايا الحية. وplusTipGetTracks ظيفة يحدد المسارات (باستخدام إعدادات سبيل المثال هو موضح في الشكل 1)، ثم تقدم المعلمات بشأن المسارات TIP +. لعرض المعلومات أن البرنامج قد حصل، انتقل إلى الدليل roi_X الذي تم إنشاؤه في الخطوة 2.2. المجلد "الفذ" يحتوي على "overlayImages"، الذي هو عبارة عن سلسلة من الصور ا...

و، حزمة برمجيات المصدر المفتوح القائمة على MATLAB، plusTipTracker، ويمكن استخدامها لتحليل سلسلة صورة-fluorescently المسمى + نصائح لقياس ديناميات أنيبيب.

plusTipTracker باستخدام برنامج لقياس ديناميكية في أنيبيب القيطم المورق المخاريط النمو

Microtubule (MT) plus-end-tracking proteins (+TIPs) localize to the growing plus-ends of MTs and regulate MT dynamics1,2. One of the most well-known and ...

الهدف من هذا الإجراء هو الحصول على معلومات كمية تتعلق بالأنابيب الدقيقة بالإضافة إلى بروتين التتبع النهائي أو بالإضافة إلى ديناميكيات الطرف ومخاريط النمو الحي باستخدام حزمة البرامج بالإضافة إلى تعقب التطرف. نصف هنا خطوات تحليل صور ديناميكيات EB one GFP ومخاريط نمو XUS lavis المستنبتة ، ولكن يمكن استخدام بروتوكول مماثل لأنواع الخلايا الأخرى بعد الحصول على صور حية عالية الدقة لأقماع النمو الجنينية المسجلة EB one والمخاريط الجنينية المستنبتة. تتمثل الخطوة الأولى في الإجراء في استخدام الأمر بالإضافة إلى النصيحة ، والحصول على مسارات لاكتشاف مذنبات EB واحد GFP ، وربط المذنبات بالمسارات ، وتحديد معلمات ديناميكيات الأنابيب الدقيقة.الخطوة الثانية هي استخدام الأمر بالإضافة إلى مسارات الطرف C لتصور مسارات الأنابيب الدقيقة المتراكبة على صور مخروط النمو. الخطوة الأخيرة هي استخدام تحليل مجموعة الأطراف الإضافية لتحليل ومقارنة معلمات مسار الأنابيب الدقيقة لمجموعات الأفلام. الميزة الرئيسية لهذه التقنية على الطرق الحالية مثل استخدام التتبع اليدوي لتحليل مسارات النصائح الفردية ، هي أن هذه الطريقة تسمح بالكشف السريع والآلي والتتبع والتصور والتحليل.تتمثل الخطوة الأولى في تحليل الصور في اكتشاف مذنبات EB one GFP ، وربط المذنبات بالمسارات وتحديد معلمات ديناميكيات الأنابيب الدقيقة. يتم الحصول على هذا باستخدام الأمر زائد تلميح. احصل على مسارات قبل تحليل الصور.قم بتحويل كل فيلم بفاصل زمني إلى سلسلة من ملفات صور TIFF واحفظ كل سلسلة في مجلد خاص بها يسمى الصور. لاحظ أن الصور حساسة لحالة الأحرف. لبدء التحليل ، افتح تطبيق MATLAB واكتب علامة الجمع للحصول على المسارات في نافذة الأوامر.سيؤدي ذلك إلى ظهور مربع حوار جديد. انقر فوق وقم بإعداد مشاريع جديدة وحدد واحدة أو أكثر من سلسلة صور TIFF السابقة عن طريق تحديد مجلد الصور المناسب. عند الانتهاء من هذه الخطوة، سيتم إنشاء دليل ملف.انقر فوق ، حسنا. بمجرد عرض الصورة الأولى ، استخدم الماوس للنقر فوق مضلع وإنشائه. ثم يشمل مجمل مخروط النمو.انقر نقرا مزدوجا فوق الماوس لإغلاق المضلع. سيظهر مربع حوار إذا كانت الصورة تحتوي على مخروط نمو آخر. للتحليل، حدد نعم.وإلا، حدد لا. الخطوة التالية هي تحديد المشاريع التي سيتم تحليلها على الفور. انقر فوق تحديد المشاريع وحدد المجلد.لتحليل قائمة ، ستظهر شاشة محددة لزجة. حدد المشاريع من الجانب الأيسر من الشاشة وانقلها إلى الجانب الأيمن. انقر فوق ، حسنا.اختر موقعا لحفظ قائمة المشروع وانقر فوق حفظ ، وحدد الكشف والتتبع والمعالجة اللاحقة. بمجرد إجراء هذه التحديدات، سيصبح الجانب الأيمن من مربع الحوار قابلا للتكوين. املأ إعدادات ما بعد المعالجة.اعتمادا على إعدادات الحصول على الصور المحددة المطلوبة ، انقر فوق ابدأ. سيقوم البرنامج بعد ذلك بتشغيل أي خطوات تم إدخالها. تعرض نافذة الأوامر الوقت المقدر المتبقي لكل وظيفة وستشير إلى وقت الانتهاء من تشغيل الخطوة.الآن بعد أن تم تحديد المسارات الأنبوبية الدقيقة ، يتم استخدام الوظيفة بالإضافة إلى مسارات الطرف C لتصور المسار وعرض المسارات الأنبوبية الدقيقة المتراكبة على صور مخروط النمو. يتم الحصول على هذا باستخدام الأمر بالإضافة إلى تلميح C ، اكتب المسارات بالإضافة إلى التيار C في نافذة الأوامر. بعد تحميل مربع الحوار ، انقر فوق تحديد المشروع.حدد الدليل الأصلي الذي يحتوي على المشروع لتصوره وانقر فوق تحديد المجلد. بمجرد ظهور النافذة ، اختر الملف المراد تصوره وانقر فوقه. حسنا ، بعد ذلك ، انقر فوق تحديد عائد استثمار محفوظ ، وانتقل إلى نفس منطقة مجلد الاهتمام مثل تلك المحددة في الخطوة السابقة وحدد الملف المسمى R-O-I-Y-X.انقر فوق تحديد دليل الإخراج لتحديد المكان الذي سيحفظ فيه MATLAB ملفات تصور المسار ثم حدد إنشاء فيلم مسار. ستظهر شاشة تعرض جميع المسارات. بالإضافة إلى نصيحة احصل على مسارات محسوبة من تعليقات الإلماح الزائد.تحفظ الخطوة السلسلة الزمنية للمسار بتنسيق فيلم. تستخدم الوظيفة النهائية لإنشاء مجموعات من الأفلام لتحليل ومقارنة معلمات المسار الأنبوبي الصغير. يتم الحصول على هذا باستخدام الأمر بالإضافة إلى تحليل مجموعة التلميح.بمجرد تشغيل المسارات للحصول على تلميح إضافي لأفلام متعددة ومجموعات فرعية مختلفة من البيانات جاهزة للمقارنة. اكتب تحليل مجموعة تلميحات الجمع في نافذة الأوامر لتحديد المجموعات المراد مقارنتها يدويا أولا قم بإلغاء تحديد المجموعة التلقائية من التدرج الهرمي. ثم انقر فوق تحديد المشاريع.انتقل إلى الدلائل الأصلية التي تحتوي على كافة مجلدات عائد الاستثمار. لتحليل قائمة ، ستظهر نافذة واجهة المستخدم الرسومية. حدد جميع المشاريع التي تريد تضمينها في المجموعات من الجانب الأيسر من الشاشة وانقلها إلى الجانب الأيمن.انقر فوق ، حسنا. ثم اختر موقعا لحفظ قائمة المشاريع وانقر فوق حفظ نافذة ستظهر . انقر فوق.حسنا ، وستظهر نافذة تحديد القائمة اللزجة. مرة أخرى ، حدد فقط الملفات التي تتوافق مع المجموعة الأولى التي يجب تجميعها معا وانقر فوق. حسنًا. أدخل اسم المجموعة وانقر فوق ، حسنا.ستظهر نافذة ، أجب وفقا لذلك واستمر في تحديد المجموعات. ثم اختر موقعا لحفظ قائمة المجموعات وانقر فوق حفظ. انقر فوق تحديد دليل الإخراج لاختيار مكان تخزين مجلدات الإخراج.أخيرا ، حدد نوع تحليل المجموعة الذي تريد إجراؤه. هنا نختار بيانات التجمع من جميع الخلايا والمجموعات. انقر فوق مقارنة المجموعات.تعرض هذه الصورة معلمات ديناميكيات الأنبوب الدقيقة التي تم الحصول عليها من الوظيفة بالإضافة إلى مسارات git الطرف. يوضح هذا الفيلم مسارات الأنابيب الدقيقة التي تم الحصول عليها من الوظيفة بالإضافة إلى مسارات الطرف C. أخيرا ، توضح هذه الصورة معلمات الأنابيب الدقيقة التي تم الحصول عليها من الوظيفة بالإضافة إلى تحليل مجموعة الطرف.باستخدام تطبيق جدول بيانات. يمكن أيضا فحص هذه المعلمات المكتسبة من مجموعات مختلفة من الأفلام كمخططات صندوقية باستخدام برنامج معالجة. بعد مشاهدة هذا الفيديو ، يجب أن يكون لديك فهم جيد لكيفية استخدام بالإضافة إلى تعقب الإكرامية للحصول على معلومات كمية تتعلق بالأنابيب الدقيقة بالإضافة إلى ديناميكيات الأطراف ومخاريط النمو الحية من خلال استخدام الوظائف بالإضافة إلى مسارات جيت الطرفية بالإضافة إلى مسارات الطرف C ، بالإضافة إلى تحليل مجموعة النصيحة.

using-plustiptracker-software-to-measure-microtubule-dynamics-xenopus

Research

JoVE Journal

Biology

علم الأحياء

الأنابيب الدقيقة هي بطبيعتها غير مستقرة البوليمرات، والتبديل ما بين النمو والسمن العشوائية ويصعب السيطرة عليها. نحن هنا تصف البروتوكولات باستخدام الأنابيب الدقيقة مجزأة مع قبعات استقرار photoablatable. يمكن أن تسبب التحلل من الأنابيب الدقيقة مجزأة مع القرار الزماني والمكاني عالية، مما يساعد تحليل الاقتراحات مع نهايات أنيبيب تفكيك.

إعداد مقسمة ميكروتثبول لدراسة الاقتراحات وانطلاقا من تفكيك أنيبيب ينتهي

&lt; p class = 'jove_content'&gt; بروتوكولات لثقافة الخلايا البطانية الوريدية السرية البشرية (HUVEC) ، والتعدي العابر للعلامات ذات العلامات الفلورية لنمو الأنابيب الدقيقة ، وتصوير الخلايا الحية والتحليل الآلي لديناميكيات نمو الأنابيب الدقيقة بين الأطوار.

عالية الدقة التصوير الوقت الفاصل بين وتحليل الآلي للأنيبيب حيوية في المعيشة السري الإنسان خلايا الوريد غشائي

نقدم حل البرمجيات لتتبع شبه الآلي من تركيز البروتين النسبي على طول نتوءات الخلوية الديناميكية.

واجهة المستخدم الرسومية لتتبع بمساعدة برنامج تركيز البروتين في النتوءات الخلوية الديناميكية

نقدم هنا طريقه قويه ومفصله لتحليل ديناميات البولية المجهرية في الخلايا المتزامنة في طليعة باستخدام الخلية الحية الغزل القرص المجهري المجهر ومعالجه الصور المستندة إلى matlab.

قياس ديناميات الأنابيب المجهرية بواسطة المجهر القرص الغزل في المغزل ميتوتيك القطب

وقد تم تقديم بروتوكول لتصوير microtubules الحيوية في الجسم الحي باستخدام البروتين ملزمة نهاية المسمى fluorescently. وصفنا أساليب لتسمية, صورة, وتحليل microtubules الحيوية في الخلايا العصبية الميكروتبول الجانبي الخلفي (PLM) من C. elegans.

في الجسم الحي تقييم ديناميات Microtubule والتوجه في Caenorhabditis elegans الخلايا العصبية

هذا البروتوكول مخصص للتصور microtubule زائد نهاية بواسطة EB3 البروتين transfection لدراسة خصائصها الحيوية في ثقافة الخلايا الأولية. تم تنفيذ البروتوكول على الخلايا الليفية الجلدية الأولية البشرية التي تم الحصول عليها من مرضى مرض هنتنغتون.

Microtubule زائد نهاية ديناميات التصور في نموذج مرض هنتنغتون على أساس الخلايا الليفية الجلد الأساسية البشرية

يهدف هذا البروتوكول إلى قياس المعلمات الديناميكية (النتوءات ، التراجع ، الكشكشة) للنتوءات على حافة الخلايا المنتشرة.

قياس ديناميكيات نتوء حافة الخلية أثناء الانتشار باستخدام المجهر الخلوي الحي

للتقدم، يجب أن تمارس مخاريط النمو قوى جذب ضد البيئة الخارجية. جيل قوى الجر يعتمد على ديناميات أكتين واقتران مخلب. وتصف هذه الدراسة أساليب لتحليل ديناميات أكتين، اقتران مخلب وقوى الجر للتقدم مخروط النمو.

تحليلات أكتين دايناميكز، اقتران مخلب وقوة الجر للنمو مخروط مقدما

هنا ، يتم تقديم فحص إعادة تشكيل مجهري TIRF قائم على المختبر لتحديد ومقارنة ديناميكيات مجموعتين من الأنابيب الدقيقة في وقت واحد. يتم وصف طريقة لعرض النشاط الجماعي للبروتينات المتعددة المرتبطة بالأنابيب الدقيقة في وقت واحد على حزم الأنابيب الدقيقة المتقاطعة والأنابيب الدقيقة المفردة.

التصور المتزامن لديناميكيات الأنابيب الدقيقة المتقاطعة والمفردة في المختبر بواسطة مجهر TIRF

نقدم بروتوكولا لتنفيذ الفحص المجهري لانعكاس التداخل والمجهر الفلوري الداخلي الكلي للتصوير المتزامن للأنابيب الدقيقة الديناميكية والبروتينات المرتبطة بالأنابيب الدقيقة ذات العلامات الفلورية.

انعكاس التداخل المتزامن والمجهر الفلوري للانعكاس الداخلي الكلي لتصوير الأنابيب الدقيقة الديناميكية والبروتينات المرتبطة بها

اكتشف كيفية تحليل ديناميكية الأنيبيبات الدقيقة في مخاريط نمو أجنة Xenopus باستخدام برنامج plusTipTracker. تتيح هذه الطريقة الكشف والتتبع الآلي السريع لبروتينات +TIP الموسومة بـ EB1-GFP.

plusTipTracker باستخدام برنامج لقياس ديناميكية في أنيبيب القيطم المورق المخاريط النمو

استكشف المزيد من الفيديوهات