استنساخ فرعي زائد الإدراج (SPI) - رواية الطريقة Recombineering عن البناء السريع للجين استهداف ناقلات

الهدف العام من التجربة التالية هو بناء نواقل استهداف الجينات باستخدام الاستنساخ الفرعي بالإضافة إلى الإدخال. يتم تحقيق ذلك عن طريق تحويل الظهر الذي يحتوي على الإشريكية القولونية مع إعادة تجميع البلازميد. تتضمن الخطوة الثانية توليد أشرطة إدخال الفوسفورة غير المتماثلة ، والاستنساخ الفرعي للبلازميدات عن طريق تفاعل البوليميراز المتسلسل.

بعد إضافة الأرابينوز ، يتم التعبير عن البروتينات المعاد تجميع GBAA ويتم تثقيب كاسيت الإدراج المعدل النهائي وبلازميد الاستنساخ الفرعي. يتم أسير تسلسل الحمض النووي المطلوب في نفس الوقت من الخلف ويتم تعديله باستخدام كاسيت الإدخال في بلازميد الاستنساخ الفرعي. الميزة الرئيسية لهذه التقنية للطرق الحالية مثل إعادة التركيب القياسية ، هي أنه يمكن إجراء بناء ناقل استهداف الجينات في تفاعل واحد.

للبدء في تصميم oligos لشريط الإدراج وتصميم البلازميد للاستنساخ الفرعي ، يحتوي كل oligo بحيث يحتوي على 180 ذراعا متماثلا للزوج الأساسي يحيط بالموقع المستهدف الجيني و 20 زوجا أساسيا ، وهو تسلسل فتيلة محدد لشريط الإدراج أو بلازميد الاستنساخ الفرعي. بعد ذلك ، حدد اتجاه إدراج الحمض النووي الجيني للاستنساخ الخلفي باستخدام أداة قائمة على الويب مثل استنساخ ديسيبل. حدد اتجاه النسخ المتماثل من أو ES عن طريق التحقق من خريطة العمود الفقري للبلازميد الخلفي المستخدم في الظهر.

بناء المكتبة ، أضف اثنين من الروابط الطرفية الفوسفو الثماني ، وبالتالي فإن الطرف الخمسة الأولي للأوليغو المقابل لاتجاه النسخ المتماثل على الاستنساخ الخلفي. بعد ذلك ، أضف تعديلا خمسة فوسفات أوليا إلى oligo العكسي. قم أولا بطعن طرف ماصة معقمة في ثقافة الأجار الخلفية وتلقيح 5.0 مل من مرق المادين.

قم بزراعة المزرعة عند 37 درجة مئوية لمدة خمس ساعات مع الاهتزاز عند 200 دورة في الدقيقة. بعد ذلك ، قم بالبرد ، ومحلول الجلسرين بنسبة 10٪ ، وأجهزة الطرد المركزي الدقيقة ، والأنابيب والتثقيب الكهربائي ، والكوفيتات على مبرد الثلج ، وأجهزة الطرد المركزي الكبيرة المبردة ، وأجهزة الطرد المركزي الدقيقة إلى أربع درجات مئوية. بعد الحضانة ، حدد الكثافة البصرية للثقافة باستخدام مقياس الطيف الضوئي.

قياس الامتصاص. عند 600 نانومتر. قم بإعداد الخلايا المختصة بالكهرباء عند الوصول إلى قراءة OD 600 من 0.3 إلى 0.8.

عندما تكون الثقافة جاهزة ، قم بتدوير الخلايا في أنبوب طرد مركزي سعة 50 مل. اغسل الخلايا بملليلتر واحد من الجلسرين المبرد بنسبة 10٪ وقم بتدويرها مرة أخرى. قم بتنفيذ خطوات الغسيل هذه ما مجموعه ثلاث مرات.

أعد تعليق الخلايا بحجم إجمالي يبلغ 50 ميكرولترا وأضف 10 إلى 200 نانوجرام من البلازميد المعاد تجميعه. احصل على تعليق خلية واحدة عن طريق سحب العينات لأعلى ولأسفل عدة مرات ، ثم انقل الخلايا إلى التثقيب الكهربائي قبل البرد. فيتي. بعد ذلك ، ضع vete في جهاز التثقيب الكهربائي وقم بتشغيل الخلايا الكهربائية على الفور لاستعادة الخلايا في مليلتر واحد من LB ونقل الخلايا إلى أنبوب طرد مركزي سعة 50 مل.

قم بزراعة ثقافة الظهر عند 30 درجة مئوية لمدة ساعتين مع الاهتزاز عند 200 دورة في الدقيقة. بعد هذا الوقت ، أضف تسعة ملليلتر من LB إلى الثقافة المستردة. تنمو بين عشية وضحاها عند 30 درجة مئوية مع الاهتزاز عند 200 دورة في الدقيقة لدمج أذرع التماثل في كاسيت الإدراج وبلازميد الاستنساخ الفرعي.

قم بإجراء تفاعل البوليميراز المتسلسل باستخدام oligos المعدلة منذ فترة طويلة المعدة مسبقا. بدلا من ذلك ، قم بخطية قالب البلازميد باستخدام إنزيم تقييد ، اختر إنزيما يقطع خارج منطقة تضخيم تفاعل البوليميراز المتسلسل ويتم تنشيطه بالحرارة. قم بإعداد PCR باستخدام نظام بوليميراز الحمض النووي عالي الدقة.

قم بإعداد مزيج PCR الرئيسي وإجراء التدوير الحراري وفقا لأفضل الممارسات. بعد التفاعل ، قم بتحليل منتجات تفاعل البوليميراز المتسلسل بواسطة الرحلان الكهربائي للهلام AROS. قم بتحميل واحد إلى خمسة ميكرولتر من كل PCR على جل 1٪ aros.

بعد ذلك ، قم بتنقية منتجات PCR باستخدام مجموعة تنقية PCR. قم بقياس الحمض النووي المضخم PCR مقابل مجموعة معروفة من معايير الحمض النووي أو باستخدام مقياس الطيف الضوئي NanoDrop. بعد الحضانة بين عشية وضحاها ، قم بتخفيف ثقافة GBAA الخلفية 50 ضعفا وقم بإعداد ثقافة منفصلة للتحكم السلبي.

قم بزراعة المزارع المخففة عند 30 درجة مئوية مع الرج عند 200 دورة في الدقيقة لمدة ساعة و 50 دقيقة. بعد ذلك ، قم بتبريد جميع المواد والمعدات المعاد تجميعها إلى أربع درجات مئوية كما هو موضح سابقا. قم بإعداد محلول وزن 10٪ لكل حجم من OSE وتعقيم الفلتر من خلال مرشح حقنة 0.2 ميكرون.

عندما يصل OD للثقافة الخلفية إلى المستوى المطلوب ، استمر في تحفيز البروتينات المعاد تجميعها. أضف 200 ميكرولتر من محلول 10٪ عربي إلى 10 ملليلتر من المزرعة الخلفية لتحقيق تركيز نهائي من aose بنسبة 0.2٪ قم بتضمين مزرعة غير مستحثة لاستخدامها كعنصر تحكم سلبي. انقل الثقافات إلى حاضنة اهتزاز 37 درجة مئوية وحث التعبير الأحمر لمدة 45 دقيقة مع الاهتزاز عند 230 دورة في الدقيقة.

قم بتدوير الخلايا واغسلها باستخدام 10٪ جلسرين ثلاث مرات كما هو موضح سابقا عند 600 إلى 1000 نانوجرام. يتضمن كل من كاسيت الإدراج وبلازميد الاستنساخ الفرعي لتفاعل إعادة التجميع متجه فقط ونتجه بالإضافة إلى عنصر تحكم في الإدخال الفردي للتحقق من كفاءة إعادة التركيب وسلامة المتجه. بعد ذلك ، احصل على تعليق خلية واحدة وقم بتشغيل الخلايا كهربائيا كما هو موضح سابقا.

السماح بالاسترداد في وسائط LB عند 37 درجة مئوية لمدة ساعة واحدة للبلازميدات متعددة النسخ أو في 10 أرطال عند 37 درجة مئوية لمدة ثلاث ساعات للنواقل الخلفية. أكمل التخفيفات المختلفة مع الثقافة المستردة في الاختيار المزدوج. أجار من فضلك وتنمو عند 37 درجة مئوية لمدة 16 ساعة.

عندما تصبح جاهزا ، اختر المستعمرات إلى خمسة ملليلتر من LB الذي يحتوي على المضاد الحيوي الانتقائي وتنمو بين عشية وضحاها عند 37 درجة مئوية. بعد ذلك ، استخدم مجموعة تنقية العمود لإعداد الحمض النووي الإعدادي المصغر ، وإدخال إنزيم التقييد المناسب ثم تحديد المستنسخة التي تحتوي على أحجام الشظايا المتوقعة عن طريق الرحلان الكهربائي للهلام. أخيرا ، قم بإجراء تسلسل الحمض النووي عبر أذرع التماثل وشريط الإدخال للتحقق من أخطاء التمثيل الضوئي أولي.

في هذا المثال ، أظهر تحليل هضم التقييد ل P two RX واحد إدراج EYFP يحتوي على نسخ النمط المتوقع الذي يشير إلى أنها تحتوي على متجه knockin المجمع بشكل صحيح. يوضح هذا التخطيطي مفهوم التشذيب الثنائي. أكد استخدام الاستنساخ الفرعي بالإضافة إلى تحليل الإدراج لمنتجات تفاعل البوليميراز المتسلسل أن الكاسيت قد تم دمجها بشكل صحيح.

بالإضافة إلى ذلك ، عندما تم تحليل المستنسخة الخلفية الإيجابية بعد إضافة إنزيم التقييد المناسب ، تم الحصول على النمط المتوقع. تحليل هضم تقييد ل 12 R SR قال اثنان من استنساخ SBI أظهر تجميع المتجه الصحيح في غالبية المؤتلفات. بعد مشاهدة هذا الفيديو ، يجب أن يكون لديك فهم جيد لكيفية بناء نواقل استهداف الجينات بسرعة باستخدام الاستنساخ الفرعي بالإضافة إلى الإدخال.