Name: تحليل خصوصية البروتين ليسين ميثيل عن طريق SPOT الببتيد صفائف (فيديو) | JoVE Journal
Uploaded: 2014-11-29T15:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 48 s
Description: اكتشف تحليل خصوصية بروتين ليسين ميثيل عن طريق صفائف الببتيد SPOT. تُستخدم هذه الطريقة لتحديد الأحماض الأمينية الحرجة في الببتيدات الركيزة وتوضيح الأدوار البيولوجية لإنزيمات PKMT.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

تم دعم هذا العمل من خلال منحة DFG JE 252/7.

<ol><li>Margueron, R., Reinberg, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Chromatin+structure+and+the+inheritance+of+epigenetic+information%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Rev.+Genet%22%5BJournal%5D)">Chromatin structure and the inheritance of epigenetic information.</a> Nat. Rev. Genet. 11, 285-296 (2010).</li>
<li>Dawson, M. A., Kouzarides, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cancer+epigenetics%3A+from+mechanism+to+therapy%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Cancer epigenetics: from mechanism to therapy.</a> Cell. 150, 12-27 (2012).</li>
<li>Helin, K., Dhanak, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Chromatin+proteins+and+modifications+as+drug+targets%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Chromatin proteins and modifications as drug targets.</a> Nature. 502, 480-488 (2013).</li>
<li>Clarke, S. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Protein+methylation+at+the+surface+and+buried+deep%3A+thinking+outside+the+histone+box%5BTitle%5D)+AND+%22Trends+in+Biochemical+Sciences%22%5BJournal%5D)">Protein methylation at the surface and buried deep: thinking outside the histone box.</a> Trends in Biochemical Sciences. 38, 243-252 (2013).</li>
<li>Rathert, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Protein+lysine+methyltransferase+G9a+acts+on+non-histone+targets%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Chemical+Biology%22%5BJournal%5D)">Protein lysine methyltransferase G9a acts on non-histone targets.</a> Nature Chemical Biology. 4, 344-346 (2008).</li>
<li>Hornbeck, P. V., Chabra, I., Kornhauser, J. M., Skrzypek, E., Zhang, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((PhosphoSite%3A+A+bioinformatics+resource+dedicated+to+physiological+protein+phosphorylation%5BTitle%5D)+AND+%22Proteomics%22%5BJournal%5D)">PhosphoSite: A bioinformatics resource dedicated to physiological protein phosphorylation.</a> Proteomics. 4, 1551-1561 (2004).</li>
<li>Reineke, U., Volkmer-Engert, R., Schneider-Mergener, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Applications+of+peptide+arrays+prepared+by+the+SPOT-technology%5BTitle%5D)+AND+%22Current+Opinion+in+Biotechnology%22%5BJournal%5D)">Applications of peptide arrays prepared by the SPOT-technology.</a> Current Opinion in Biotechnology. 12, 59-64 (2001).</li>
<li>Winkler, D. F., Andresen, H., Hilpert, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((SPOT+synthesis+as+a+tool+to+study+protein-protein+interactions%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+Mol.+Biol%22%5BJournal%5D)">SPOT synthesis as a tool to study protein-protein interactions.</a> Methods Mol. Biol. 723, 105-127 (2011).</li>
<li>Leung, G. C., Murphy, J. M., Briant, D., Sicheri, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Characterization+of+kinase+target+phosphorylation+consensus+motifs+using+peptide+SPOT+arrays%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+Mol.+Biol%22%5BJournal%5D)">Characterization of kinase target phosphorylation consensus motifs using peptide SPOT arrays.</a> Methods Mol. Biol. 570, 187-195 (2009).</li>
<li>Frank, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+SPOT-synthesis+technique.+Synthetic+peptide+arrays+on+membrane+supports--principles+and+applications%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+immunological+methods%22%5BJournal%5D)">The SPOT-synthesis technique. Synthetic peptide arrays on membrane supports--principles and applications.</a> Journal of immunological methods. 267, 13-26 (2002).</li>
<li>Hilpert, K., Winkler, D. F., Hancock, R. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Peptide+arrays+on+cellulose+support%3A+SPOT+synthesis%2C+a+time+and+cost+efficient+method+for+synthesis+of+large+numbers+of+peptides+in+a+parallel+and+addressable+fashion%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+protocols%22%5BJournal%5D)">Peptide arrays on cellulose support: SPOT synthesis, a time and cost efficient method for synthesis of large numbers of peptides in a parallel and addressable fashion.</a> Nature protocols. 2, 1333-1349 (2007).</li>
<li>Li, S. S., Wu, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Using+peptide+array+to+identify+binding+motifs+and+interaction+networks+for+modular+domains%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+Mol.+Biol%22%5BJournal%5D)">Using peptide array to identify binding motifs and interaction networks for modular domains.</a> Methods Mol. Biol. 570, 67-76 (2009).</li>
<li>Winkler, D. F., Hilpert, K., Brandt, O., Hancock, R. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Synthesis+of+peptide+arrays+using+SPOT-technology+and+the+CelluSpots-method%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+Mol.+Biol%22%5BJournal%5D)">Synthesis of peptide arrays using SPOT-technology and the CelluSpots-method.</a> Methods Mol. Biol. 570, 157-174 (2009).</li>
<li>Toepert, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Combining+SPOT+synthesis+and+native+peptide+ligation+to+create+large+arrays+of+WW+protein+domains%5BTitle%5D)+AND+%22Angew+Chem.+Int.+Ed.+Engl%22%5BJournal%5D)">Combining SPOT synthesis and native peptide ligation to create large arrays of WW protein domains.</a> Angew Chem. Int. Ed. Engl. 42, 1136-1140 (2003).</li>
<li>Volkmer, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Synthesis+and+application+of+peptide+arrays%3A+quo+vadis+SPOT+technology%5BTitle%5D)+AND+%22Chembiochem+%3A+a+EuropeanJournal+of+Chemical+Biology%22%5BJournal%5D)">Synthesis and application of peptide arrays: quo vadis SPOT technology.</a> Chembiochem : a EuropeanJournal of Chemical Biology. 10, 1431-1442 (2009).</li>
<li>Rathert, P., Zhang, X., Freund, C., Cheng, X., Jeltsch, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Analysis+of+the+substrate+specificity+of+the+Dim-5+histone+lysine+methyltransferase+using+peptide+arrays%5BTitle%5D)+AND+%22Chemistr.%2C+%26+biology%22%5BJournal%5D)">Analysis of the substrate specificity of the Dim-5 histone lysine methyltransferase using peptide arrays.</a> Chemistr., & biology. 15, 5-11 (2008).</li>
<li>Kudithipudi, S., Dhayalan, A., Kebede, A. F., Jeltsch, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+SET8+H4K20+protein+lysine+methyltransferase+has+a+long+recognition+sequence+covering+seven+amino+acid+residues%5BTitle%5D)+AND+%22Biochimie%22%5BJournal%5D)">The SET8 H4K20 protein lysine methyltransferase has a long recognition sequence covering seven amino acid residues.</a> Biochimie. 94, 2212-2218 (2012).</li>
<li>Dhayalan, A., Kudithipudi, S., Rathert, P., Jeltsch, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Specificity+analysis-based+identification+of+new+methylation+targets+of+the+SET7%2F9+protein+lysine+methyltransferase%5BTitle%5D)+AND+%22Chemistr.%2C+%26+Biology%22%5BJournal%5D)">Specificity analysis-based identification of new methylation targets of the SET7/9 protein lysine methyltransferase.</a> Chemistr., & Biology. 18, 111-120 (2011).</li>
<li>Kudithipudi, S., Lungu, C., Rathert, P., Happel, N., Jeltsch, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Substrate+specificity+analysis+and+novel+substrates+of+the+protein+lysine+methyltransferase+NSD1%5BTitle%5D)+AND+%22Chemistr.%2C+%26+Biology%22%5BJournal%5D)">Substrate specificity analysis and novel substrates of the protein lysine methyltransferase NSD1.</a> Chemistr., & Biology. 21, 226-237 (2014).</li>
<li>Obenauer, J. C., Cantley, L. C., Yaffe, M. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Scansite+2.0%3A+Proteome-wide+prediction+of+cell+signaling+interactions+using+short+sequence+motifs%5BTitle%5D)+AND+%22Nucleic+Acids+Research%22%5BJournal%5D)">Scansite 2.0: Proteome-wide prediction of cell signaling interactions using short sequence motifs.</a> Nucleic Acids Research. 31, 3635-3641 (2003).</li>
<li>Takahashi, M., Ueno, A., Mihara, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Peptide+design+based+on+an+antibody+complementarity-determining+region+%28CDR%29%3A+construction+of+porphyrin-binding+peptides+and+their+affinity+maturation+by+a+combinatorial+method%5BTitle%5D)+AND+%22Chemistry%22%5BJournal%5D)">Peptide design based on an antibody complementarity-determining region (CDR): construction of porphyrin-binding peptides and their affinity maturation by a combinatorial method.</a> Chemistry. 6, 3196-3203 (2000).</li>
<li>Kramer, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Spot+synthesis%3A+observations+and+optimizations%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Pept.+Res%22%5BJournal%5D)">Spot synthesis: observations and optimizations.</a> J. Pept. Res. 54, 319-327 (1999).</li>
<li>Stadler, V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Combinatorial+synthesis+of+peptide+arrays+with+a+laser+printer%5BTitle%5D)+AND+%22Angew+Chem.+Int.+Ed.+Engl%22%5BJournal%5D)">Combinatorial synthesis of peptide arrays with a laser printer.</a> Angew Chem. Int. Ed. Engl. 47, 7132-7135 (2008).</li>
<li>Schnack, C., Hengerer, B., Gillardon, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Identification+of+novel+substrates+for+Cdk5+and+new+targets+for+Cdk5+inhibitors+using+high-density+protein+microarrays%5BTitle%5D)+AND+%22Proteomics%22%5BJournal%5D)">Identification of novel substrates for Cdk5 and new targets for Cdk5 inhibitors using high-density protein microarrays.</a> Proteomics. 8, 1980-1986 (2008).</li>
<li>Mah, A. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Substrate+specificity+analysis+of+protein+kinase+complex+Dbf2-Mob1+by+peptide+library+and+proteome+array+screening%5BTitle%5D)+AND+%22BMC+Biochemistry%22%5BJournal%5D)">Substrate specificity analysis of protein kinase complex Dbf2-Mob1 by peptide library and proteome array screening.</a> BMC Biochemistry. 6, 22 (2005).</li>
</ol>

لم يتم الإعلان عن تضارب في المصالح.

التوليف SPOT كما هو موضح هنا هو وسيلة قوية لرسم خريطة مواقع التفاعل البروتين البروتين والتحقيق في التعرف على الركيزة من الببتيد تعديل الانزيمات. ومع ذلك، SPOT التوليف لا يزال لديه بعض العيوب، لأنه على الرغم يتم الإبلاغ عن الببتيدات توليفها من خلال طريقة SPOT أن يكون أكثر من 90٪ نقاء 21 هذا من الصعب تأكيد في كل حالة. ولذلك، النتائج يجب أن تكون مستنسخة عن طريق وسائل أخرى على سبيل المثال باستخدام المجالات البروتين أو مع الببتيدات تنقية تصنيعه بالطرق العادية. وبالإضافة إلى ...

في العقدين الأخيرين، أظهرت عدة تقارير على أهمية التعديلات بعد متعدية (PTM) في التنمية الخلوية والعديد من الأمراض مثل السرطان، ولكن في الآونة الأخيرة البروتين يسين مثيلة قد ظهرت كعامل حيوي PTM آخر. في حين تم العثور على هيستون في البداية مثيلة ليسين ليكون علامة لونين الأساسية، وأظهر العمل في وقت لاحق أيضا يسين مثيلة من عدة بروتينات غير بسيطة 1-4. يتم تحفيز نقل متتابعة من مجموعات الميثيل من S-adenosyl-L-ميثيونين إلى مجموعة-ε الأمينية من بقايا يسين من قبل عائلة من الإنزيمات يسمى البروتين ليسين ميثيل (PKMTs) الذي يحتوي على أكثر من 60 البروتينات في الجينوم البشري. وقد اكتشفت في البداية PKMTs كما هيستون تعديل الانزيمات التي ميثيل بقايا يسين محددة ولكن أظهرت تقارير لاحقة أنها يمكن أيضا ميثيل البروتينات غير بسيطة 5. حتى الآن، تم تحديد ما يقرب من 5،000 مواقع مثيلة ليسين على البروتينات المختلفة 6 </sتصل&gt;، ولكن غالبا ما لا يتم التعرف على الانزيمات المسؤولة عن هذه التعديلات. وأحد أسباب ذلك هو أن خصوصية أكثر PKMTs لم يدرس على نطاق واسع. ولذلك، فإنه يحدث متكرر أن ركائز جديدة للPKMTs يتم اكتشافها. عدم وجود معرفة مفصلة من خصوصية الركيزة من PKMTs يعيق فهم وظيفتها البيولوجية ودورها. لدراسة خصوصية من PKMT بالتفصيل، يجب أن تقاس معدلات مثيلة من العديد من ركائز الببتيد التي تختلف في واحد أو عدد قليل من الأحماض الأمينية ومقارنة، والتي تتم بشكل مثالي باستخدام صفائف الببتيد. استنادا إلى ملامح خصوصية الناتجة عن ذلك، يمكن تحديد ركائز المحتملة للPKMTs التي يمكن مزيد من الدراسة. وتستخدم على نطاق واسع صفائف الببتيد أدوات لتحليل الكيمياء الحيوية من الأجسام المضادة، الببتيد الانزيمات تعديل ورسم خرائط لمواقع التفاعل البروتين البروتين (الضد مستضد، مستقبلات يجند) 7-9. وهناك حاجة إلى عدة مئات من الببتيدات لSUCح التطبيقات. وطرق المختلفة المتاحة لتخليق الببتيد، الببتيد التوليف بينها على الراتنج يستخدم عادة للغاية، ولكن له حدود في الإنتاجية وأنها مكلفة نسبيا. تم حل هذه القضايا مع إدخال طريقة تركيب SPOT فرانك وزملاؤه 10. يسمح للطريقة التوليف SPOT تجميع لعدة مئات من الببتيدات بالتوازي وفي المتوسط ​​أنها غير مكلفة مقارنة توليف الراتنج. الببتيدات توليفها على غشاء السليولوز يمكن استخدام إما مباشرة لمختلف التطبيقات أو الببتيدات يمكن المشقوق من الغشاء واستخدامها كأداة الببتيدات المجانية للفي المقايسات حل أو لإعداد ميكروأرس الببتيد 10-13. SPOT التوليف هو البديل من الببتيد مرحلة التوليف الصلبة، والذي يستخدم غشاء السليلوز كدعم قوي وتوظف القياسية Fmoc الكيمياء 10-13. وبالتالي، فإن تركيب سلاسل الببتيد يبدأ في نهاية-C محطة ويمضي نحونهاية-N محطة على النقيض من التوليف البيولوجي في ريبوسوم. وبين functionalized أغشية السليلوز لإلحاق أول الأحماض الأمينية تنشيط (الشكل 1). وتستند هذه الطريقة SPOT على تسليم متتابعة من الأحماض الأمينية تفعيلها في بقطرة من المذيب إلى مناطق محددة على الغشاء باستخدام نظام pipetting لالآلي. والاستغناء عن قطرة من السائل على غشاء مسامي حيث أنها تشكل بقعة دائرية الرطب، الذي يعمل في وقت لاحق كما مفاعل مفتوحا لتفاعلات كيميائية في التوليف الببتيد. يتم تحديد حجم بقعة على حجم الاستغناء والقدرة الاستيعابية للغشاء، يتم ترتيب مضاعفات مثل هذه البقع كما المصفوفات. حجم التوليف يرتبط حجم البقعة وقدرة التحميل من الغشاء. المسافة بين البقع وكثافة صفائف تدار من قبل متفاوتة الأحجام الفور. غشاء السليلوز لديها العديد من المزايا على النحو المرحلة الصلبة في التوليف الببتيد، أنها غير مكلفة، متسامح إلى كيميائياعتلال الأعصاب الحركية المستخدمة في تركيب الببتيد، مستقرة في المحاليل المائية وسهلة في التعامل معها. وبالإضافة إلى ذلك، طبيعته المحبة للماء يجعلها مناسبة لعدة أنظمة الفحص البيولوجية. يمكن أن يتم تركيب SPOT يدويا أو آليا (ل1000s من الببتيدات) اعتمادا على العدد المطلوب من الببتيدات. ويستخدم مركب SPOT مؤتمتة بالكامل من Intavis (كولن، ألمانيا) لطلباتنا. ويسمح تركيب الببتيدات في كميات مختلفة وطول مختلف. وقد تم تجميع الببتيدات الخطية بانتظام مع 15 إلى 20 الأمينية طول حامض، في الببتيدات إضافة ما يصل إلى 42 من الأحماض الأمينية يمكن أيضا أن تكون خطوة حكيمة التوليف 14،15 إعدادها. ومع ذلك، زيادة عدد الأحماض الأمينية يؤدي إلى تخفيضات في العوائد اقتران الشاملة، مما يؤثر على نوعية من الببتيدات. ونظرا لكمية قليلة من الببتيدات في بقعة، والمنتجات وغالبا ما تكون صعبة لتنقية ونوعية الببتيدات الفردية لا يمكن تقييمها بسهولة. ولذلك، فإن النتائج التي تم الحصول عليها من SPOT peptلا بد من تأكيد صفائف بيئة تطوير متكاملة سواء مع الببتيدات توليفها من قبل الأساليب القياسية في نطاق أوسع، والتي يمكن تنقيتها وتحليلها وفقا للمعايير في التوليف الببتيد أو عن طريق تجميع البروتينات التي تحتوي على سلاسل الببتيد المطلوب. ومع ذلك، وجدنا التوليف SPOT أن تكون موثوق بها للغاية ويؤدي عموما أن يكون استنساخه. لا يقتصر التوليف SPOT لproteinogenic الأحماض الأمينية، والعديد من الأحماض الأمينية تعديل المتاحة تجاريا كما يمكن استخدامها لتخليق، مما يسمح الببتيدات إلى أن يتم تعديل قبل وبعد الانقسام النهائي للمجموعة حماية الجانب السلسلة، وعلاوة على ذلك، فإنه يسمح أيضا إدماج فسفرته، مميثل أو الأسيتيل الأحماض الأمينية 11. مكتبات الببتيد ثبتوا توليفها من خلال طريقة SPOT يمكن استخدامها مباشرة للعديد من المقايسات البيولوجية والبيوكيميائية. نحن العاملين صفائف الببتيد تضم 300-400 الببتيدات للتحقيق في خصوصية ركيزة من PKMTs. لmodifi الأنزيميالموجبة، يتم تحضين صفائف الببتيد مع PKMT منها وصفت [ميثيل 3 H] -AdoMet في العازلة المناسبة. ويتم تحليل الحامض الركيزة منها باتباع نقل الأنزيمية للمجموعات الميثيل المسمى بالإشعاع من AdoMet إلى الركيزة الببتيد عبر تصوير الإشعاع الذاتي (الشكل 3). بواسطة هذا الإجراء، صفائف الببتيد تسمح دراسة مثيلة من ركائز الببتيد مختلفة في نفس الوقت. أحد المزايا المهمة لهذا الأسلوب هو أن جميع الببتيدات وميثليته في المنافسة، هذا إلى أنه خلال المرحلة خطية من حركية مثيلة، ومثيلة النسبي لكل الببتيد يتناسب مع معدل ثابت الحفاز مقسوما على ثابت التفكك (ك القط / K D) من انزيم لالببتيد الركيزة منها. ولذلك، يرتبط مقدار النشاط الإشعاعي إدراجها في كل بقعة مباشرة مع النشاط الأنزيمي نحو الببتيد معين. باستخدامنتائج تجربة مثيلة مجموعة الببتيد، والوضع خصوصية PKMT يمكن تعريف وبناء على هذه الرواية ركائز يمكن أن يستند. صفائف الببتيد تسمح التحقق من صحة كفاءة السريع وتكلفة مثيلة من ركائز جديدة على مستوى الببتيد. لهذا، يتم إعداد المصفوفات التي تحتوي على ركائز جديدة توقع مع الببتيدات المعدلة تحتوي على علاء بدلا من ليز في المواقع المستهدفة وكذلك الببتيدات الإيجابية والسلبية السيطرة. وأخيرا، فإن ركائز الرواية يمكن أن تكون على استعداد كما البروتينات مع المسوخ، والتي يتم تبديل اليس هدف لعلاء ويمكن التأكد من مثيلة في مستوى البروتين. اعتمادا على نتائج، وهذا هو ثم تليها الدراسات البيولوجية معالجة الأدوار المحتملة للمثيلة من ركائز البروتين وصفها حديثا.

<table><tbody><tr><td>الإيثانول ABS التدرج الصف HPLC</td><td>هانيويل</td><td>10299901</td><td>قابل للاشتعال</td></tr> <tr><td>< م > N ، N ثنائي ميثيل فورماميد الببتيد التوليف</td><td>Biosolve</td><td>4193302</td> قابل <td>للاشتعال ،</td></tr><tr><td>بيبيريدين سام & ge ؛ 99٪ لتخليق الببتيد</td><td>روث</td><td>A122.1</td> أوكسيما نقي <td>قابل للاشتعال ، سام ، مسبب للتآكل</td></tr><tr><td>(إيثيل (هيدروكسيسيمينو) سيانوأسيتات)</td> <td>novabiochem</td><td>8510860100</td><td></td></tr> <tr><td>< م > ن ، ن ' < / م > - ثنائي أوبروبيل كاربوديميد بوروم & جي ؛ 98٪ GC</td><td>Fluka</td><td>38370</td> أنهيدريد الخليك <td>قابل للاشتعال ، سام ، مسبب للتآكل</td></tr><tr><td></td><td>روث</td><td>CP28.1</td><td>قابل للاشتعال ، سام ، مسبب</td></tr><tr><td>للتآكل ثلاثي الأيزوبروبيل سيلان 99٪</td> <td>ألدريتش</td><td>233781</td><td>قابل للاشتعال ،</td></tr><tr><td>ثنائي كلورو ميثان سام & ge ؛ 99.9٪</td> <td>روث</td><td>P089.1</td><td>مادة مسرطنة</td></tr> <tr><td>< م > N -Methyl-2-Pyrrolidone</td><td>Roth</td><td>4306.2</td><td></td></tr><tr><td>غشاء السليلوز المشتق</td><td>السام Intavis AG K & ouml ؛ ln</td><td>32.1</td><td></td></tr><tr><td>حمض ثلاثي فلورو أسيتيك</td><td>روث</td><td>P088.2</td><td>سامة ومسببة للتآكل</td></tr><tr><td>برومفينول بلو</td><td>AppliChem</td><td>A3640.0010</td><td></td></tr><tr><td>كربونات الهيدروجين الأمونيوم</td><td>روث</td><td>T871.2</td><td></td></tr><tr><td>كريات كبريتات دوديسيل الصوديوم</td><td>السامة روث</td><td>CN30.3</td><td>مركب متعدد بيب سام وقابل للاشتعال</td></tr><tr><td></td><td>Intavis AG K & ouml ؛ ln</td><td>n.a.HyperfilmTM</td><td></td></tr> <tr><td>فيلم عالي الأداء</td><td>GE Healthcare</td><td>28906837</td><td></td></tr><tr><td>برنامج Phoretix</td><td>TotalLab</td><td>n.a.</td><td></td></tr></tbody></table>

تحليل خصوصية البروتين ليسين ميثيل عن طريق spot الببتيد صفائف

Specificity Analysis of Protein Lysine Methyltransferases Using SPOT Peptide Arrays

يسين مثيلة هو التعديل بعد الترجمة الناشئة وتم التعرف على العديد من هيستون وغير هيستون-البروتينات، حيث أنه يلعب دورا حاسما في تطوير خلية والعديد من الأمراض. وقد تم تحديد مواقع 5،000 مثيلة ليسين تقريبا على البروتينات المختلفة، وهي تحدد من قبل عدد قليل العشرات من ميثيل البروتين ليسين. وهذا يشير إلى أن كل PKMT methylates بروتينات متعددة، ولكن حتى الآن تم التعرف على واحد أو اثنين فقط ركائز للعديد من هذه الإنزيمات. تحليلات لنهج هذه المشكلة، أدخلنا مجموعة الببتيد تستند الركيزة خصوصية PKMTs. صفائف الببتيد هي أدوات قوية لتوصيف خصوصية PKMTs بسبب مثيلة من عدة ركائز مع سلاسل مختلفة يمكن اختبارها على مجموعة واحدة. نحن توليفها صفائف الببتيد على غشاء السليلوز باستخدام المزج Intavis SPOT وتحليلها خصوصية مختلف PKMTs. وبناء على هذه النتائج، بالنسبة للعديد من هذه الإنزيمات، رواية الصورةيمكن تحديد ubstrates. على سبيل المثال، لNSD1 من خلال توظيف صفائف الببتيد، أظهرنا أنه methylates K44 من H4 بدلا من H4K20 ذكرت وبالإضافة H1.5K168 هو الركيزة يفضل بدرجة كبيرة خلال H3K36 المعروفة سابقا. وبالتالي، صفائف الببتيد هي أدوات قوية لتوصيف كيميائيا وPKMTs.

كانت تستخدم صفائف الببتيد بنجاح لتوصيف كيميائيا خصوصية PKMTs، وتم تحديد عدة هيستون رواية وغير هيستون-ركائز من PKMT هذا النهج 5،16-19. تحديد الطيف الركيزة الصحيح لPKMT (أو أي انزيم) هو خطوة ضرورية نحو فهم آليتها الجزيئية والخلوية وظائف. وكمثال على تطبيق الببتيد SPOT طريقة مجموعة مثيلة، نحن تصف نتائج تحليل خصوصية NSD1 PKMT 19. السابق لعملنا، وقد وصفت هذا الانزيم إلى عدة ركائز ميثيل بما في ذلك ...

يمكن استخدام مصفوفات الببتيد المركبة بطريقة SPOT لتحليل خصوصية الركيزة لبروتين ليسين ميثيل ترانسفيراز (PKMTs) ولتحديد طيف الركيزة ل PKMTs لفهم دورها البيولوجي. يصف هذا البروتوكول كيفية تصنيع مصفوفات الببتيد ، وميثيليتها باستخدام PKMTs ، وتحليل النتائج.

تحليل خصوصية البروتين ليسين ميثيل عن طريق SPOT الببتيد صفائف

Lysine methylation is an emerging post-translation modification and it has been identified on several histone and non-histone proteins, where it plays ...

الهدف العام من التجربة التالية هو التحقيق في خصوصية الركيزة لبروتين ليسين ميثيل ترانسفيراز أو PK mts. يتم تحقيق ذلك من خلال تحديد الركيزة الأولية وإعداد مصفوفات الببتيد مع عدة متغيرات من هذه الركيزة التي تحتوي على تبادلات أحماض أمينية مفردة في مواضع مختلفة. كخطوة ثانية ، يتم احتضان مصفوفة الببتيد مع PKMT في وجود متبرع لمجموعة الميثيل المشعة ، مما يسمح بالكشف عن مثيلة الببتيد عن طريق نقل النشاط الإشعاعي إلى بقعة الببتيد المقابلة.بعد ذلك ، تتعرض المصفوفة لفيلم الأشعة السينية ويتم تحليلها كميا من أجل تحديد نشاط المثيلة في كل من الببتيدات. ولتحديد ملف تعريف خصوصية PKMT ، تظهر النتائج الأحماض الأمينية الموجودة في ببتيد الركيزة التي تعتبر ضرورية لمثيلتها بواسطة PKMT. الميزة الرئيسية لهذه التقنية أو الطرق الحالية مثل مثيلة الببتيدات الفردية هي أنه يمكن اختبار عدد من الببتيدات المختلفة في تجربة واحدة بطريقة فعالة من حيث التكلفة.يمكن أن تساعد هذه الطريقة في الإجابة على السؤال الرئيسي في مجال مثيلة البروتين ليم ، مثل مواصفات ركائز جديدة لم تكن معروفة سابقا ل PK mtss. لذلك يمكن أن توفر هذه الطريقة نظرة ثاقبة لخصوصية PK mts. يمكن أيضا تطبيقه على أنظمة أخرى مثل كينازات البروتين ، أو طريقة البروتين الأخرى ، أو الترانسفيراز ، أو إضافته إلى الترانسفيراز.خطرت لي فكرة هذه الطريقة لأول مرة عندما أصبحت على دراية بإمكانية إعداد مصفوفات ببتيد مخصصة كبيرة بتكاليف معقولة باستخدام تخليق بقعة الببتيد لبدء هذا الإجراء ، قم بتصميم تسلسلات الببتيد للتوليف باستخدام برنامج المراقب متعدد اللحوث. أدخل تسلسلات الببتيد كرمز حرف واحد مع كل حرف يحدد الحمض الأميني المحدد بعد هذا الانتفاخ المسبق ، غشاء البقعة الوظيفي للوتد الأميني في النهاية ، ثنائي ميثيل فورماميد أو DMF لمدة 10 دقائق. عند الانتهاء ، ضع الغشاء المبلل على إطار مركب البقعة دون أي فقاعات هواء أو تجاعيد.جفف الغشاء تماما لمدة 10 دقائق على الأقل قبل بدء برنامج التوليف. اغسل الغشاء ثلاث مرات باستخدام 100٪ من الإيثانول لتوليد رابطة الأميد مع المجموعة الأمينية الحرة على الغشاء. قم بتنشيط مجموعة الكربوكسي من الأحماض الأمينية الواردة عن طريق إضافة DIC و ethyl hydroxy amino sino acetate إلى مشتق الأحماض الأمينية.بعد التنشيط ، حدد الأحجام المطلوبة من الأحماض الأمينية المنشطة على الغشاء الوظيفي للوتد الأميني باستخدام الروبوت القابل للبرمجة. كرر الخطوة السابقة ثلاث مرات لضمان اقتران أفضل للحمض الأميني المنشط الأول. بعد احتضان الغشاء لمدة 20 دقيقة ، اغسله باستخدام DMF لإزالة الأحماض الأمينية غير المقترنة بعد التجفيف وسد المجموعات الأمينية الحرة.اغسل الغشاء باستخدام DMF أربع مرات ثم احتضانه بنسبة 20٪ بيبيرين في DMF لمدة 20 دقيقة لإزالة مجموعة حماية FM. بعد غسل الغشاء وتجفيفه ، كرر خطوات الاكتشاف وإزالة F MOC حتى يتم تحقيق طول الببتيد المطلوب. بعد آخر حماية من مجموعة F MOC D ، اغسل الغشاء باستخدام DMF و 100٪ إيثانول.ثم عالج الغشاء ب 0.02٪ بروم فينول أزرق في DMF لمدة خمس دقائق على الأقل حتى يتحول إلى اللون الأزرق تماما. بعد غسل الغشاء وتجفيفه ، أخرجه من المركب وضعه في صندوق مقاوم للمواد الكيميائية. عالجها ب 20 إلى 25 مل من خليط حماية السلسلة الجانبية D ، الذي يتكون من 95٪ حمض ثلاثي كلورو أسيتيك لشق السلسلة الجانبية لحماية مجموعات الحماية والكواشف لحماية السلاسل الجانبية للأحماض الأمينية من التعديل.بعد التأكد من أن خليط الحماية العميقة يغطي الغشاء ، أغلق الصندوق تماما واحتضنه لمدة ساعة إلى ساعتين أثناء رجه برفق بعد الحضانة. اغسل الغشاء ست مرات ب 20 إلى 25 مل من ثنائي كلورو ميثان لمدة دقيقتين لكل منهما. بعد الغسيل مرتين باستخدام 100٪ من الإيثانول ، جفف الغشاء في مكان مجفف طوال الليل.بعد ذلك ، قم باحتضان غشاء مصفوفة الببتيد مسبقا في كيس بلاستيكي مغلق يحتوي على مخزن المثيلة المعني بدون إنزيم ومجموعة الميثيل ذات العلامات المشعة لمدة 10 دقائق ، تخلص من المخزن المؤقت قبل الحضانة واحتضان الغشاء في ثمانية ملليلتر من المخزن المؤقت للمثيلة الذي يحتوي على PKMT المعني لمدة ساعة إلى ساعتين. بعد ذلك ، تخلص من المخزن المؤقت للمثيلة في حاوية نفايات مشعة واغسل مصفوفات الببتيد خمس مرات ب 20 مل من المخزن المؤقت الذي يحتوي على 100 مللي مولار بيكربونات الأمونيوم ، و 1٪ STS لمدة خمس دقائق لإزالة البروتين المرتبط. بعد التخلص من آخر مخزن مؤقت للغسيل في حاوية النفايات المشعة ، احتضن الغشاء لمدة خمس دقائق في 10 ملليلتر من محلول التضخيم.ثم تخلص من محلول التضخيم في حاوية النفايات المشعة للمذيبات العضوية. أغلق مجموعة الببتيد في كيس بلاستيكي وضعها في كاسيت التصوير الشعاعي التلقائي. ضع فيلم التصوير الشعاعي التلقائي على الببتيد في غرفة مظلمة.ثم أغلق الكاسيت بعناية. بعد تعريض الفيلم عند 80 درجة مئوية تحت الصفر ، قم بتطويره لتحليل النتائج. أخيرا ، التقط الصورة عدة مرات بأوقات عرض مختلفة لتجنب تشبع ركائز الببتيد الميثيل بقوة.يظهر هنا مثال على تفاعل مثيلة مصفوفة الببتيد مع NSD واحد. يمثل المحور الأفقي تسلسل الببتيد وفي الاتجاه الرأسي. يشار إلى الأحماض الأمينية المتغيرة المثيلة مع NSD ، ويظهر أحدهم أنه يعمل على وجه التحديد على H three K 36 ويتعرف على ثلاثة إلى أربعة بقايا من الأحماض الأمينية على جانبي توحيد اللايسين المستهدف لتجارب مصفوفة الببتيد الثلاث ل NSD واحد موضح هنا.يظهر حوالي 85٪ من الببتيدات انحرافات معيارية أصغر من زائد أو ناقص 20٪ وأكثر من 97٪ من الببتيدات تظهر انحرافات معيارية أصغر من زائد أو ناقص 30٪ تظهر بيانات عامل التمييز المحسوبة أن NSD الأول يفضل المخلفات العطرية في موضع سالب اثنين. في الموقعين سالب واحد وزائد موقعين ، تفضل المخلفات المضافة للماء. وفي موقع زائد واحد ، هناك تفضيل للأرجينين أو اليسين أو الجلوتامين أو الأسباراجين.يمكن العثور على ركائز الببتيد الجديدة المحتملة من خلال عمليات البحث في قاعدة البيانات للبروتين البشري. تؤكد المثيلة القوية لبعض هذه الببتيدات مع بعض الهوية على أنها ركائز ببتيد NSD واحدة. أثناء محاولة هذا الإجراء ، من المهم أن تتذكر استخدام الركيزة الأولية الأنسب باتباع هذا الإجراء.يمكن إجراء طرق أخرى مثل مثيلة البروتينات المقابلة في المختبر وفي الخلايا من أجل معرفة ما إذا كانت البروتينات مقبولة كركائز ، وكذلك بعد تطورها. مهدت هذه التقنية الطريق للباحثين في مجال ميسيلاسیون ليسين البروتين ، لتحديد خصوصية الركيزة للعديد من PK mts وتحديد العديد من الركائز الجديدة. ساعد هذا في فهم الوظيفة البيولوجية المهمة ل PK mts.لا تنس أنه يمكن تأكيد العمل مع النشاط الإشعاعي والمذيبات العضوية في تخليق الببتيد ، ويجب دائما اتخاذ الاحتياطات المناسبة أثناء تنفيذ هذا الإجراء.

specificity-analysis-protein-lysine-methyltransferases-using-spot

Research

JoVE Journal

Biology

علم الأحياء

التقاط المركبات هي عبارة عن جزيئات صغيرة trifunctional للحد من تعقيد بروتيوم الوظيفية التي عكسها التفاعل جزيء بروتين صغير يليه يشابك - الصور وتنقيتها. نستخدم هنا لقطة مع...

التنميط وغيره من Methyltransferases S - adenosyl - L - الهموسيستين ملزم البروتينات المركبة من قبل التقاط الطيف الكتلي (CCMS)

نحن نقدم طريقة لاستخدام MALDI قياس الطيف الكتلي والاختزالية الكيمياء مثيلة لقياس التغيرات في مثيلة ليسين.

تطبيق MassSQUIRM لقياسات كمية من نشاط Demethylase ليسين

يوضح هذا الفيديو تقنية تطبق تقنية المصفوفات الدقيقة للببتيد لتعريف خصوصية الأجسام المضادة التي تتعرف على التعديلات اللاحقة للترجمة (PTMs) على ببتيدات الهيستون. يتم التعامل مع شريحة المصفوفة الدقيقة التي تحتوي على ببتيدات هيستون مترافقة بالفلوروفور مع مجموعات PTM المعروفة بالأجسام المضادة المستهدفة الخاصة ب PTM. تساعد هذه العملية في تحديد خصوصية الجسم المضاد للهدف وتفاعله المتبادل المحتمل مع PTMs غير المستهدفة.

تقنية المصفوفة الدقيقة للببتيد لتنميط خصوصية الأجسام المضادة

من خلال الجمع بين الأم ويشابك مناعي لونين مع عالية الدقة الطيف الكتلي، نهج ChroP تمكن من تشريح بنية البروتين المركب من التعديلات هيستون، المتغيرات والبروتينات غير histonic التآزر في المجالات ونين متميزة وظيفيا.

النهج ChroP يجمع بين الشذرة والطيف الكتلي لتشريح المناظر الطبيعية البروتيومية الحالة رقم محدد من الكروماتين

فحص مصفوفة الببتيد هو اختبار عالي الإنتاجية لتحديد مواقع تفاعل البروتين والبروتين. يسمح ذلك برسم خرائط للتفاعلات المتعددة للبروتين المستهدف ويمكن أن يكون بمثابة طريقة لتحديد مواقع المثبطات التي تستهدف البروتين. نصف هنا بروتوكولا لفحص وتحليل مصفوفات الببتيد.

تحديد مواقع التفاعل البروتين البروتين عن طريق الببتيد صفائف

تصف هذه المخطوطة طرق لتطبيق تقنية ميكروأري الببتيد على التنميط خصوصية الأجسام المضادة التي تعترف هيستونيس والتعديلات بعد متعدية لها.

تحليل هيستون الأجسام المضادة خصوصية مع ميكروأرس الببتيد

هنا، نقدم بروتوكول لتحديد خصوصية حوزتي في النسيج الخام الماوس مقتطفات استخدام TOF استخدام قياس الطيف الكتلي.

مقتطفات البت في حوزتي خصوصية في الأنسجة الماوس باستخدام TOF الكتلي: التلاعب بدرجة الحموضة تسبب التغييرات النوعية

يصف سير العمل هذا أداء الإثراء الفعال للوقت والتكلفة للتعديلات المتعددة للبروتين بعد الترجمة (PTMs) في وقت واحد للتحليل الكمي العالمي للبروتيوميات. يستخدم البروتوكول تخصيب PTM على مستوى الببتيد مع أجسام مضادة مترافقة متعددة ، يليه تحليل قياس الطيف الكتلي للاستحواذ المستقل عن البيانات للحصول على رؤى بيولوجية في الكلام المتبادل PTM.

إثراء التقارب المتزامن لتعديلات ما بعد الترجمة للقياس الكمي وتوطين الموقع

بروتين أرجينين (R) - مثيلة هو تعديل واسع الانتشار بعد الترجمة ينظم مسارات بيولوجية متعددة. يعد قياس الطيف الكتلي أفضل تقنية لتحديد ملامح R-methyl-proteome عالميا ، عندما يقترن بالنهج الكيميائية الحيوية لتخصيب الببتيد المعدل. يتم وصف سير العمل المصمم لتحديد الثقة العالية لمثيلة R العالمية في الخلايا البشرية هنا.

نهج البروتينات القائم على قياس الطيف الكتلي لتحليل مثيلة البروتين R العالمية وعالية الثقة

توضح هذه المقالة طريقة إعداد عينة تستند إلى تعطيل الحرارة للحفاظ على الببتيدات الذاتية تجنب تدهور بعد الوفاة، تليها الكمية النسبية باستخدام وضع العلامات النظيرية بالإضافة إلى LC-MS.

إعداد العينة والكمية النسبية باستخدام الميثيل الاختزالي للأمينات لدراسات علم البيبتي

يوصف هنا بروتوكول البروتينات التوأم للجسيمات العصبية الليزوزومية لتوصيف البيئة المكروية الليزوزومية الديناميكية في الخلايا العصبية المشتقة من الخلايا الجذعية متعددة القدرات التي يسببها الإنسان. يمكن قياس بروتينات الغشاء الليزوزومي والبروتينات التي تتفاعل مع الليزوزومات (بشكل ثابت أو عابر) بدقة في هذه الطريقة بدقة مكانية ممتازة داخل الخلايا في الخلايا العصبية البشرية الحية.

توصيف تفاعل الليزوزوم العصبي مع البروتينات ذات العلامات القريبة

اكتشف تحليل خصوصية بروتين ليسين ميثيل عن طريق صفائف الببتيد SPOT. تُستخدم هذه الطريقة لتحديد الأحماض الأمينية الحرجة في الببتيدات الركيزة وتوضيح الأدوار البيولوجية لإنزيمات PKMT.

تحليل خصوصية البروتين ليسين ميثيل عن طريق SPOT الببتيد صفائف

استكشف المزيد من الفيديوهات