تحليل خصوصية البروتين ليسين ميثيل عن طريق SPOT الببتيد صفائف

الهدف العام من التجربة التالية هو التحقيق في خصوصية الركيزة لبروتين ليسين ميثيل ترانسفيراز أو PK mts. يتم تحقيق ذلك من خلال تحديد الركيزة الأولية وإعداد مصفوفات الببتيد مع عدة متغيرات من هذه الركيزة التي تحتوي على تبادلات أحماض أمينية مفردة في مواضع مختلفة. كخطوة ثانية ، يتم احتضان مصفوفة الببتيد مع PKMT في وجود متبرع لمجموعة الميثيل المشعة ، مما يسمح بالكشف عن مثيلة الببتيد عن طريق نقل النشاط الإشعاعي إلى بقعة الببتيد المقابلة.

بعد ذلك ، تتعرض المصفوفة لفيلم الأشعة السينية ويتم تحليلها كميا من أجل تحديد نشاط المثيلة في كل من الببتيدات. ولتحديد ملف تعريف خصوصية PKMT ، تظهر النتائج الأحماض الأمينية الموجودة في ببتيد الركيزة التي تعتبر ضرورية لمثيلتها بواسطة PKMT. الميزة الرئيسية لهذه التقنية أو الطرق الحالية مثل مثيلة الببتيدات الفردية هي أنه يمكن اختبار عدد من الببتيدات المختلفة في تجربة واحدة بطريقة فعالة من حيث التكلفة.

يمكن أن تساعد هذه الطريقة في الإجابة على السؤال الرئيسي في مجال مثيلة البروتين ليم ، مثل مواصفات ركائز جديدة لم تكن معروفة سابقا ل PK mtss. لذلك يمكن أن توفر هذه الطريقة نظرة ثاقبة لخصوصية PK mts. يمكن أيضا تطبيقه على أنظمة أخرى مثل كينازات البروتين ، أو طريقة البروتين الأخرى ، أو الترانسفيراز ، أو إضافته إلى الترانسفيراز.

خطرت لي فكرة هذه الطريقة لأول مرة عندما أصبحت على دراية بإمكانية إعداد مصفوفات ببتيد مخصصة كبيرة بتكاليف معقولة باستخدام تخليق بقعة الببتيد لبدء هذا الإجراء ، قم بتصميم تسلسلات الببتيد للتوليف باستخدام برنامج المراقب متعدد اللحوث. أدخل تسلسلات الببتيد كرمز حرف واحد مع كل حرف يحدد الحمض الأميني المحدد بعد هذا الانتفاخ المسبق ، غشاء البقعة الوظيفي للوتد الأميني في النهاية ، ثنائي ميثيل فورماميد أو DMF لمدة 10 دقائق. عند الانتهاء ، ضع الغشاء المبلل على إطار مركب البقعة دون أي فقاعات هواء أو تجاعيد.

جفف الغشاء تماما لمدة 10 دقائق على الأقل قبل بدء برنامج التوليف. اغسل الغشاء ثلاث مرات باستخدام 100٪ من الإيثانول لتوليد رابطة الأميد مع المجموعة الأمينية الحرة على الغشاء. قم بتنشيط مجموعة الكربوكسي من الأحماض الأمينية الواردة عن طريق إضافة DIC و ethyl hydroxy amino sino acetate إلى مشتق الأحماض الأمينية.

بعد التنشيط ، حدد الأحجام المطلوبة من الأحماض الأمينية المنشطة على الغشاء الوظيفي للوتد الأميني باستخدام الروبوت القابل للبرمجة. كرر الخطوة السابقة ثلاث مرات لضمان اقتران أفضل للحمض الأميني المنشط الأول. بعد احتضان الغشاء لمدة 20 دقيقة ، اغسله باستخدام DMF لإزالة الأحماض الأمينية غير المقترنة بعد التجفيف وسد المجموعات الأمينية الحرة.

اغسل الغشاء باستخدام DMF أربع مرات ثم احتضانه بنسبة 20٪ بيبيرين في DMF لمدة 20 دقيقة لإزالة مجموعة حماية FM. بعد غسل الغشاء وتجفيفه ، كرر خطوات الاكتشاف وإزالة F MOC حتى يتم تحقيق طول الببتيد المطلوب. بعد آخر حماية من مجموعة F MOC D ، اغسل الغشاء باستخدام DMF و 100٪ إيثانول.

ثم عالج الغشاء ب 0.02٪ بروم فينول أزرق في DMF لمدة خمس دقائق على الأقل حتى يتحول إلى اللون الأزرق تماما. بعد غسل الغشاء وتجفيفه ، أخرجه من المركب وضعه في صندوق مقاوم للمواد الكيميائية. عالجها ب 20 إلى 25 مل من خليط حماية السلسلة الجانبية D ، الذي يتكون من 95٪ حمض ثلاثي كلورو أسيتيك لشق السلسلة الجانبية لحماية مجموعات الحماية والكواشف لحماية السلاسل الجانبية للأحماض الأمينية من التعديل.

بعد التأكد من أن خليط الحماية العميقة يغطي الغشاء ، أغلق الصندوق تماما واحتضنه لمدة ساعة إلى ساعتين أثناء رجه برفق بعد الحضانة. اغسل الغشاء ست مرات ب 20 إلى 25 مل من ثنائي كلورو ميثان لمدة دقيقتين لكل منهما. بعد الغسيل مرتين باستخدام 100٪ من الإيثانول ، جفف الغشاء في مكان مجفف طوال الليل.

بعد ذلك ، قم باحتضان غشاء مصفوفة الببتيد مسبقا في كيس بلاستيكي مغلق يحتوي على مخزن المثيلة المعني بدون إنزيم ومجموعة الميثيل ذات العلامات المشعة لمدة 10 دقائق ، تخلص من المخزن المؤقت قبل الحضانة واحتضان الغشاء في ثمانية ملليلتر من المخزن المؤقت للمثيلة الذي يحتوي على PKMT المعني لمدة ساعة إلى ساعتين. بعد ذلك ، تخلص من المخزن المؤقت للمثيلة في حاوية نفايات مشعة واغسل مصفوفات الببتيد خمس مرات ب 20 مل من المخزن المؤقت الذي يحتوي على 100 مللي مولار بيكربونات الأمونيوم ، و 1٪ STS لمدة خمس دقائق لإزالة البروتين المرتبط. بعد التخلص من آخر مخزن مؤقت للغسيل في حاوية النفايات المشعة ، احتضن الغشاء لمدة خمس دقائق في 10 ملليلتر من محلول التضخيم.

ثم تخلص من محلول التضخيم في حاوية النفايات المشعة للمذيبات العضوية. أغلق مجموعة الببتيد في كيس بلاستيكي وضعها في كاسيت التصوير الشعاعي التلقائي. ضع فيلم التصوير الشعاعي التلقائي على الببتيد في غرفة مظلمة.

ثم أغلق الكاسيت بعناية. بعد تعريض الفيلم عند 80 درجة مئوية تحت الصفر ، قم بتطويره لتحليل النتائج. أخيرا ، التقط الصورة عدة مرات بأوقات عرض مختلفة لتجنب تشبع ركائز الببتيد الميثيل بقوة.

هنا مثال على تفاعل مثيلة مصفوفة الببتيد مع NSD واحد. يمثل المحور الأفقي تسلسل الببتيد وفي الاتجاه الرأسي. يشار إلى الأحماض الأمينية المتغيرة المثيلة مع NSD ، ويظهر أحدهم أنه يعمل على وجه التحديد على H three K 36 ويتعرف على ثلاثة إلى أربعة بقايا من الأحماض الأمينية على جانبي توحيد اللايسين المستهدف لتجارب مصفوفة الببتيد الثلاث ل NSD واحد موضح هنا.

يظهر حوالي 85٪ من الببتيدات انحرافات معيارية أصغر من زائد أو ناقص 20٪ وأكثر من 97٪ من الببتيدات تظهر انحرافات معيارية أصغر من زائد أو ناقص 30٪ تظهر بيانات عامل التمييز المحسوبة أن NSD الأول يفضل المخلفات العطرية في موضع سالب اثنين. في الموقعين سالب واحد وزائد موقعين ، تفضل المخلفات المضافة للماء. وفي موقع زائد واحد ، هناك تفضيل للأرجينين أو اليسين أو الجلوتامين أو الأسباراجين.

يمكن العثور على ركائز الببتيد الجديدة المحتملة من خلال عمليات البحث في قاعدة البيانات للبروتين البشري. تؤكد المثيلة القوية لبعض هذه الببتيدات مع بعض الهوية على أنها ركائز ببتيد NSD واحدة. أثناء محاولة هذا الإجراء ، من المهم أن تتذكر استخدام الركيزة الأولية الأنسب باتباع هذا الإجراء.

يمكن إجراء طرق أخرى مثل مثيلة البروتينات المقابلة في المختبر وفي الخلايا من أجل معرفة ما إذا كانت البروتينات مقبولة كركائز ، وكذلك بعد تطورها. مهدت هذه التقنية الطريق للباحثين في مجال ميسيلاسیون ليسين البروتين ، لتحديد خصوصية الركيزة للعديد من PK mts وتحديد العديد من الركائز الجديدة. ساعد هذا في فهم الوظيفة البيولوجية المهمة ل PK mts.

لا تنس أنه يمكن تأكيد العمل مع النشاط الإشعاعي والمذيبات العضوية في تخليق الببتيد ، ويجب دائما اتخاذ الاحتياطات المناسبة أثناء تنفيذ هذا الإجراء.