كشف وتحليل الحمض النووي من التلف في العضلات الهيكلية ماوس في الموقع استخدام أسلوب TUNEL

الهدف العام من هذا الإجراء هو الكشف عن فواصل الحمض النووي وموت الخلايا في C الثاني. يتم تحقيق ذلك عن طريق أقسام الأنسجة المنفذة الأولى للسماح لكواشف النفق بدخول نواة الخلية. بعد ذلك ، يتم استخدام إنزيم TDT لربط DTPs تساهميا بثلاثة نهايات أولية من فواصل الحمض النووي في هذه الخلايا.

ثم يتم تمييز DUTP بمسبار الفلورسنت. في النهاية ، يتم قياس الإشارة الموجبة للنفق في أقسام الأنسجة التي تعكس التكرار النسبي لفواصل الحمض النووي في الخلايا. الميزة الرئيسية لهذه التقنية على الطرق الحالية مثل النشاف الجنوبي أو الكيمياء المناعية ، هي أنها سريعة نسبيا ومحددة وتوفر طريقة للتخلص من الضوضاء والتألق الذاتي.

ابدأ بتثبيت الأطراف الخلفية المعزولة في 4٪ بارا فورمالديهايد في PBS في أنبوب سعة 15 مليلتر ، مما يسمح للتثبيت بالعمل لمدة أربع إلى 24 ساعة على الأكثر عند أربع درجات مئوية. هناك حاجة إلى ساعتين فقط إذا كانت الأنسجة جنينية. ومع ذلك ، بعد التثبيت ، استبدل المحلول بنسبة 10٪ سكروز لحماية الأنسجة بالتبريد واحتضانها طوال الليل عند أربع درجات مئوية.

في اليوم التالي ، قم بتغيير المحلول إلى سكروز معقم مفلتر بنسبة 30٪ واستمر في الحضانة طوال الليل أو حتى تغرق الأطراف الخلفية في قاع الأنبوب. عند التضمين ، من المهم أن تكون الأطراف الخلفية مغمورة تماما في وسط التضمين. يمكن وضع قوالب التضمين مباشرة على الثلج الجاف أو في isop pentane على الثلج الجاف لتجميد الوسط.

عند التشريح بالتبريد. قطع الكتل أقسام النقل التي يبلغ سمكها 10 ميكرون أو أرق ، ولن يتم اختراق الأقسام السميكة بواسطة كواشف وضع العلامات على النفق. اجمع هذه الأقسام الرقيقة على شرائح زجاجية مطلية بالجيلاتين أو الرابطة المتجهة في درجة حرارة الغرفة.

بسرعة كبيرة ، انقل الشرائح إلى الثلج الجاف للتخزين. قم أولا بإذابة شريحة من قسم المناديل المجمدة إلى درجة حرارة الغرفة واتركها تجف لمدة 16 إلى 64 ساعة. بمجرد أن تصبح الشريحة في درجة حرارة الغرفة ، أعد ترطيب القسم في وعاء توصيل مملوء ببرنامج تلفزيوني لمدة 10 دقائق.

كرر خطوة إعادة الجفاف هذه مرة واحدة ، ثم جفف الشريحة بعناية بمنديل مختبري دون إزعاج قسم الأنسجة لترشيد القسم ، ضع الشريحة في غرفة الرطوبة والماصة 50 ميكرولترا من الكواشف التجارية ذات قاعدة الصابونين غير المحللة للبروتين على القسم. لا تضع الماصة مباشرة على الأقسام لأنها يمكن أن تنفصل أو تتلف. ثم ضع قطعة صغيرة من الفيلم فوق القسم لنشر الكاشف.

إذا تشكلت فقاعات، أعد تطبيق الفقرة فيلم. دع الشريحة تحتضن لمدة ساعة بعد ساعة. قم بإزالة الكواشف باستخدام غسلتين لمدة خمس دقائق في PBS واتركها حتى تجف بعناية.

بجانب فواصل الحمض النووي الملصقة بواسطة TDT ، استخدم مجموعة متوفرة تجاريا. أولا ، قم بعمل مخزن مؤقت XTDT واحد وماصة فوق القسم. ثم احتضان الشريحة لمدة خمس دقائق في غرفة الترطيب.

ثانيا ، قم بعمل مزيج وضع العلامات على TDT وفقا لتعليمات المجموعة أو شريحة تحكم إيجابية. أضف الحمض النووي إلى مزيج وضع العلامات على TDT. للحصول على شريحة تحكم سلبية ، احذف إنزيم TDT من المزيج.

الآن باستخدام مسحة ، قم بإزالة أكبر قدر ممكن من المخزن المؤقت من الشريحة وقم بتثبيتها على مزيج الملصقات. يجب أن يكفي 50 ميكرولتر. مرة أخرى ، انشر المحلول مع الطفيلي دون صنع فقاعات.

دع الشريحة تحتضن في الغرفة لمدة ساعة الآن عند 37 درجة مئوية. ثالثا ، قم بعمل المخزن المؤقت x stop وفقا لتعليمات المجموعة. بعد إزالة مزيج الملصقات بمنديل المختبر ، أضف ما بين اثنين و 300 ميكرولتر من مزيج التوقف لتغطية القسم بالكامل.

ثم احتضان الشريحة لمدة خمس دقائق في الغرفة. لا يتم استخدام أي فيلم para في هذه الخطوة. لإزالة المخزن المؤقت للتوقف ، استخدم غسلتين لمدة دقيقتين في PBS.

الآن ماصة 50 ميكرولتر من محلول وضع العلامات على الفلورسين المحضر حديثا. على الشريحة ، ضع perfil واحتضن لمدة 20 دقيقة في الغرفة ، ولكن الآن في الظلام. قم بإزالة محلول الملصقات بغسل واحد لمدة دقيقتين في PBS أثناء الغسيل ، قم بتخفيف بعض الخطافات.

3 3 ، 2 ، 5 8 إلى ميكروغرام واحد لكل مليلتر في PBS. بعد الغسيل ، قم بتغطية الأقسام في واحد إلى 200 ميكرولتر من محلول الخطافات المخفف. ثم احتضن الشريحة لمدة خمس دقائق ، محمية من الضوء لإزالة الخطافات للبقع ، استخدم ثلاث غسلات لمدة خمس دقائق في PBS.

ثم جفف الشريحة بعناية بمنديل معمل وقم بتطبيق زلة غطاء للتصوير. قم بتصوير القسم باستخدام مرشحات DPI و fitzy و Texas الحمراء لفصل بقع الخطافات وبقع النفق وإشارات التألق الذاتي إلى ثلاث قنوات ألوان زائفة في صورة واحدة. توحيد والحفاظ على نفس إعدادات التصوير بين جميع الشرائح بحيث يمكن مقارنتها بسهولة.

لا تستخدم أي إعدادات تعريض ضوئي أو اكتساب تلقائية للرجوع إليها التشريحية. استخدم صورة ساحقة ساطعة لقسم طرف خلفي مجاور ملطخ ب h و e في برنامج تحليل الصور. قم بإيقاف تشغيل قناة النفق.

ثم تتبع الخطوط العريضة لمنطقة العضلات يدويا ليتم قياسها كميا باستخدام القنوات الأخرى. قم بتحويل المنطقة التي تم تتبعها إلى قناع. ثم أعد تشغيل قناة النفق واضبط الحد الأدنى للشدة لاستبعاد إشارة الفلورسنت الذاتي.

استخدم نفس حد الحد في جميع الأقسام التي تم تحليلها في الدراسة. بعد ذلك ، قم بتحويل وحدات بكسل العتبة إلى قناع. في كل صورة، اجمع بين قناع منطقة العضلات وقناع النفق الحدودي.

هذا يجعل تمثيل إشارة النفق داخل منطقة العضلات المتتبعة. الآن قم بتحديد كمية القناع المركب لتحديد عدد الكائنات الموجبة للنفق ومساحة البكسل الإجمالية لإشارة النفق داخل العضلات. استخدم هذه القيم للتحليل الإحصائي.

تظهر الأجسام الموجبة للنفق ذات التكبير المنخفض على شكل شظايا ساطعة غير منتظمة في العضلات الهيكلية. ومع ذلك ، عند التكبير العالي ، يجب ملاحظة بعض الأجسام الإيجابية للنفق ذات التشكل المبرمج الكلاسيكي إذا كان نوع موت الخلية ينطوي على موت الخلايا المبرمج هذا. يجب أن يظهر التحكم الإيجابي مع الحمض النووي D المضاف إشارة إيجابية وفيرة للنفق موزعة بشكل موحد عبر جميع الأنسجة.

في القسم. يجب أن يكون للتحكم السلبي بدون إنزيم TDT خلفية منخفضة الكثافة ويظهر التألق الذاتي فقط. باستخدام البروتوكول الموصوف ، وجد أن كرات الدم الحمراء في العظام والخلايا البطانية ساهمت في إشارة الفلورسنت الذاتي في أقسام الأطراف العالية المعدة.

كانت الإشارة الإيجابية للنفق الحقيقي أكثر كثافة. يمكن عزله عن إشارة الفلورسنت الذاتي باستخدام عتبة شدة البكسل. كان هناك خيار آخر لعزل إشارة النفق وهو طرح قناة التألق الذاتي الحمراء رقميا من قناة النفق.

باستخدام هذه التقنية ، موت خلايا العضلات الهيكلية. في نموذج فأر من SMA تم تقييمه ، كشف وضع العلامات النفقية عن خلايا موت الخلايا المبرمج في الفئران SMA البالغة من العمر خمسة أيام أكثر من الضوابط. من خلال تحديد تلطيخ النفق ، تبين أن هذه الملاحظة ذات دلالة إحصائية لمجموعات عضلية متعددة داخل الطرف الخلفي.

بمجرد إتقانها ، يمكن إجراء تقنية النفق في حوالي أربع ساعات لتوليد نتائج كمية موثوقة.