Name: كشف وتحليل الحمض النووي من التلف في العضلات الهيكلية ماوس في الموقع استخدام أسلوب TUNEL (فيديو) | JoVE Journal
Uploaded: 2014-12-16T14:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 54 s
Description: اكتشف طريقة TUNEL لكشف تلف الحمض النووي في عضلات الفأر الهيكلية. تتيح هذه التقنية السريعة والمحددة قياس موت الخلايا بدقة عالية مقارنة بالطرق التقليدية.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

تم دعم هذا العمل من خلال منحة NIH-NINDS RO1-NS065895 ومنحة NIH-NINDS 5-F31-NS076250-02. 
نشكر مرفق مجهر JHU SOM على استخدام جهاز التبريد.

ملاحظة: تم تنفيذ جميع الإجراءات الحيوانية وصفها في هذا البروتوكول وفقا للتوصيات الواردة في دليل لرعاية واستخدام الحيوانات المختبرية من المعاهد الوطنية للصحة 26. وتمت الموافقة على البروتوكول (MO13M391) من قبل لجنة جامعة رعاية الحيوان واستخدام جونز هوبكنز. 1. حديثي الولادة ماوس النحر، تشريح، والتثبيت <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> التضحية ماوس الأطفال حديثي الولادة عن طريق CO 2 الاستنشاق. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> قطع على الفور من على hindlimb فوق الركبة. حتى اليوم ما بعد الولادة حوالي 7، وعظام الساق هي لينة بما يكفي لقطع طريق مع مقص مختبر كبيرة أو شفرة حادة وقسم في وقت لاحق على ناظم البرد. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ضع hindlimb في 10 مل من الجليد الباردة بارافورمالدهيد 4٪ في الفوسفات مخزنة المالحة (PBS) في أنبوب 15 مل. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> الغمر إصلاح hindlimb في امتصاص العرق ل4-24 ساعة في 4 درجات مئوية. الأنسجة الجنينية تتطلب عدة ساعات فقطالصورة للتثبيت. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> تجنب تثبيت أطول من 24 ساعة، وهذا قد يقلل TUNEL كفاءة الفحص. </li></ol></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> Cryoprotect في hindlimb عن طريق غمر في محلول السكروز. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> تغيير بارافورمالدهيد إلى 10٪ سكروز في برنامج تلفزيوني في نفس أنبوب 15 مل، واحتضان بين عشية وضحاها في 4 درجات مئوية. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> التغيير إلى 30٪ سكروز في برنامج تلفزيوني، واحتضان بين عشية وضحاها في 4 درجات مئوية أو حتى المصارف hindlimb إلى أسفل الأنبوب. الأنسجة قد يكون غادر في 30٪ سكروز لفترة أطول، شريطة أن يكون السكروز كانت عقيمة-تصفيتها. </li></ol></li></ol> 2. الأنسجة التضمين <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ملء المسمى تضمين العفن في منتصف الطريق مع تضمين المتوسطة. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> وضع hindlimb على أعلى من المتوسط ​​التضمين، مع الجانب قطع أقرب وقت ممكن لجدار واحد من العفن. بمناسبة توجه hindlimb في الخارج من القالب. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> تضمين عدة hindlimbs وقطع في نفس الكتلة. ومع ذلك، فمن المهم التأكد من أن كل هينموجهة dlimbs في كتلة موازية لبعضها البعض للحصول على الأقسام في مطابقة المستويات على طول محور من أطرافهم. </li></ol></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> تغطية hindlimbs مع تضمين المتوسطة. إذا hindlimbs SHIFT أثناء صب المتوسطة، وإعادة توجيه، منهم بالملقط حادة ذات الرؤوس أو المسواك. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> يسمح تضمين المتوسطة التسلل إلى الأنسجة في درجة حرارة الغرفة لمدة 15 دقيقة على الأقل. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> مكان قوالب مباشرة على الثلج الجاف أو في isopentane على الثلج الجاف لتجميد تضمين المتوسطة. تأكد للحفاظ على مستوى قوالب في جميع الأوقات وتجنب التحول من الأنسجة المضمنة. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> الحفاظ قوالب المجمدة في -80 درجة مئوية لتصبح جاهزة لقطع، لمدة تصل إلى عدة أشهر. </li></ol> 3. Cryosectioning جزءا لا يتجزأ من أطرافه <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ضبط درجة الحرارة الغرفة ناظم البرد إلى -20 ° C، درجة حرارة الجسم إلى -18 ° C. ضبط درجة حرارة الكائن أسفل عند الضرورة. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> تتوازن كتلة الأنسجة داخل غرفة ناظم البرد لمدة 30 دقيقة على الأقل. درجة الحرارة كتلة الصحيحةerature هو أمر حاسم لقسم الجودة. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> قطع المقاطع العرضية في سمك 10 ميكرون أو أقل. لن يتم اختراقها أقسام سمكا بالكامل من قبل الكواشف TUNEL. استخدام لوحة مكافحة لفة، شفرات، وزاوية شفرة (عادة 5 °) الموصى بها لناظم البرد. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> جمع المقاطع على gelatin- أو الشرائح الزجاجية المغلفة vectabond في درجة حرارة الغرفة. وضع على الفور في مربع الشريحة على الثلج الجاف. الاحتفاظ مربع الشريحة في وعاء منفصل مع الثلج الجاف وضعت بالقرب من ناظم البرد في متناول الذراع. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> قطع الأجزاء المتسلسلة عرضية من خلال محور طويل من أطرافه، وتخطي 100-200 ميكرون. جمع لا يقل عن 3 أقسام المجاورة في كل مستوى التسلسلي. </li></ol></li></ol> 4. TUNEL الفحص على أقسام Hindlimb باستخدام أدوات المتاحة تجاريا (جميع الخطوات في درجة حرارة الغرفة ما لم يذكر) <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ذوبان الجليد الشرائح مع أقسام لدرجة حرارة الغرفة، وبين عشية وضحاها الجاف أو خلال عطلة نهاية الاسبوع. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ترطيب أقسام كتبها immersinز الشرائح في برنامج تلفزيوني لمدة 2 × 10 دقيقة في جرة Coplin. الجافة مع مختبر مسح، وإزالة أكبر قدر من السائل حول القسم ممكن. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> أقسام Permeabilize <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> استخدام إما غير بروتين، كاشف القائم على سابونين تجاري أو 0.5٪ Tween20 و 0.05٪ تريتون X100 في برنامج تلفزيوني. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ضع الشريحة في غرفة الرطوبة. غرفة الرطوبة البسيطة هي مربع ماصة فارغة مع غطاء محكم، مع يضاف الماء ما يكفي لتغطية الجزء السفلي من مربع. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ماصة كاشف كافية على الشريحة لتغطية القسم (50 ميكرولتر كافية لأطرافه الماوس حديثي الولادة). لا ماصة مباشرة على الباب، والتحريض المتكرر قد يؤدي القسم لرفع قبالة الشريحة. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> باستخدام ملقط حادة ذات الرؤوس، ضع مستطيل صغير من parafilm على رأس القسم لنشر قطرة من الكاشف وتغطي كامل القسم. إذا تشكل أي فقاعات تحت بارافيلم، ورفع بلطف تشغيله، الجافة، وتطبيق. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> احتضان الشرائح مع permeabilization كاشف لمدة 1 ساعة في غرفة الرطوبة مغطاة. إذا بدأت أقسام لرفع الخروج من الشرائح، وربما يتم تخفيض الوقت permeabilization إلى 30 دقيقة. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> غسل الشرائح في برنامج تلفزيوني في Coplin جرة 2 × 5 دقائق. يجب المستطيلات بارافيلم تطفو إلى الأعلى، ويمكن بعد ذلك إزالتها والتخلص منها. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> باستخدام مختبر قضاء، وتجفيف الكثير من السائل حول أقسام ممكن. </li></ol></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> TDT بوساطة الحمض النووي كسر الوسم <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> اتبع الإرشادات عدة لجعل 1X TDT عازلة وضع العلامات، وماصة المخزن ما يكفي من وضع العلامات على الشريحة لتغطية قسم الأنسجة (50 ميكرولتر كافية لأطرافه الماوس حديثي الولادة). احتضان في غرفة الرطوبة لمدة 5 دقائق. بدلا من ذلك، تزج الشريحة في TDT عازلة وضع العلامات في جرة coplin. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> اتبع الإرشادات عدة لجعل TDT وضع العلامات المزيج. وتشمل هذه المجموعة الكوبالت والمغنيسيوم والمنغنيز والكاتيونات. والموجبة المنغنيز يعمل بشكل جيد على مجموعة متنوعة من الأنسجة، بما في ذلك العضلات والهيكل العظمي، TISS الجهاز العصبيUES والكبد والجلد والعظام. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> للتحكم إيجابية، إضافة الدناز (المسمى &quot;نوكلياز&quot; في المجموعة) إلى وضع العلامات مزيج TDT. بدلا من ذلك، قبل علاج قسم مراقبة الإيجابي مع الدناز العازلة في نوكلياز لمدة 1 ساعة عند 37 درجة مئوية، وفقا لتعليمات الطقم. حافظ على حل الدناز وأقسام المعالجة الدناز بعيدا عن أقسام تجريبية أخرى لمنع انتقال التلوث. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> لسيطرة سلبية، حذف TDT انزيم من مزيج العلامات. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> استخدام مختبر محو لإزالة أكبر قدر من TDT عازلة وضع العلامات من الشريحة ممكن. ماصة TDT وضع العلامات مزيج على الشريحة (50 ميكرولتر لكل قسم)، وتغطي مع مستطيل جديد من parafilm، واحتضان في غرفة الرطوبة عند 37 درجة مئوية لمدة 1 ساعة. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> اتبع الإرشادات عدة لجعل عازلة توقف 1X. استخدام مختبر مسح لإزالة TDT وضع العلامات مزيج من الشرائح، وإضافة 200-300 عازلة توقف ميكرولتر لتغطية قسم الأنسجة، واحتضان في غرفة الرطوبة لمدة 5 دقائق. آل<html> ternatively، تزج الشريحة في المخزن توقف في جرة Coplin. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> غسل دقيقة الشريحة 2 × 2 في برنامج تلفزيوني. استخدام مختبر محو لإزالة PBS قدر من الشريحة ممكن. </li></ol></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> وضع العلامات الفلورية <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> اتبع الإرشادات عدة لإعداد حل التوسيم فلوريسئين لتسمية dNTPs في فواصل DNA. حل ماصة على الشريحة (50 ميكرولتر لكل قسم)، وتغطي مع مستطيل جديد من parafilm، واحتضان في غرفة الرطوبة لمدة 20 دقيقة. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> غسل الشريحة لمدة 2 دقيقة في برنامج تلفزيوني في جرة Coplin. استخدام مختبر محو لإزالة PBS أكبر قدر ممكن من الشريحة. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> تمييع هويشت 33258 صمة عار النووية إلى 1 ميكروغرام / مل في برنامج تلفزيوني وماصة على الشريحة (100-200 ميكرولتر كافية لتغطية القسم). احتضان في غرفة الرطوبة لمدة 5 دقائق. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> غسل 3X لمدة 5 دقائق في برنامج تلفزيوني. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ساترة مع antifade مضان وسائل الإعلام تصاعد وختم حواف مع طلاء الأظافر. </li></ol></li></ol>jove_title &quot;&gt; 5. اقتناء الصور الرقمية <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> الحصول على الصور باستخدام المجهر الفلورسنت التقليدية مع دابي، FITC، والمرشحات تكساس الأحمر (أو ما يعادلها). استخدام الهدف التكبير العالي (20X 40X أو) للتحقق من أن العلامات كانت ناجحة وكانت وصفت نوى (سليمة أو مجزأة). والهدف 10X كافية لتحديد الكميات من نقاط وTUNEL إيجابية. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> جمع الصور من تلطيخ هويشت، TUNEL تلطيخ، وإشارة autofluorescent كما ثلاث قنوات كاذبة اللون منفصلة مجتمعة في صورة واحدة. إذا كانت التسمية fluorophore TUNEL خضراء، إشارة الصورة autofluorescent في مرشح أحمر، والعكس بالعكس. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> منع جميع إعدادات التصوير يعادل بين الشرائح لالعتبة والكميات اللاحقة. لكل مرشح، وأوقات محددة مسبقا والتعرض قياسية، ربح، وbinning (أي binning هو أفضل)؛ لا تستخدم إعدادات التعرض أو كسب التلقائي. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> استخدام التجربة والخطأ للعثور على التعرض وزيادة الإعدادات التي سوف أفضل التقاط مجموعة من intensities عبر كافة الشرائح الملون. ضمان أنه لا توجد بكسل المشبعة في الصور المكتسبة، وهذه الإرادة التحيز الكميات. </li></ol></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> التقاط صور لمجموعة العضلات كامل من الفائدة. وهذا قد يتطلب عدة صور إلى أن &quot;مخيط&quot; معا. </li></ol> تحليل 6. صورة <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> استخدام المتاحة تجاريا برامج تحليل الصور لتحليل الصور الرقمية من النفق تلطيخ. ويظهر التحليل باستخدام البرمجيات التجارية هنا. بدلا من ذلك، برنامج يماغيج خالية من NIH يمكن استخدامها لتحليل TUNEL تلطيخ. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> وصمة عار قسم مجاور لقسم الملطخة TUNEL مع الهيماتوكسيلين ويوزين (H &amp; E) واتخاذ القسم كامل الصورة الرقمية مع المجهر brightfield التقليدية. استخدام هذا H &amp; E الصورة في تركيبة مع أطلس التشريح 5،18،19 لتتبع الهياكل التشريحية ليكون كميا. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> مع تحول قناة TUNEL قبالة، يدويا تتبع الخطوط العريضة للمنطقة ليكون كميا، وذلك باستخدامهويشت وقنوات تألق ذاتي للاسترشاد بها. تحويل المنطقة تتبع إلى قناع (مجموعة من بكسل اختيار ينسق ليتم تحليلها). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> بدوره على قناة TUNEL. باستخدام شدة العتبة وظيفة في برنامج تحليل الصور، تعيين عتبة أدنى لاستبعاد كل إشارة تألق ذاتي. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> تطبيق الإعدادات عتبة نفسها لجميع الصور في مجموعة الدراسة. تحويل التحديدات thresholded إلى أقنعة. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> لكل صورة، والجمع بين القناع منطقة العضلات وقناع TUNEL. سوف قناع تركيبة جديدة تمثل إشارة TUNEL داخل منطقة العضلات تتبع فقط. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> أداء قناع الكميات على القناع تركيبة لتحديد عدد الكائنات وجوه مجال إشارة TUNEL داخل منطقة العضلات تتبعها. تنفيذ هذا باستخدام وظيفة الجسيمات محلل في يماغيج. </li></ol>

<ol><li>Ansari, B., Coates, P. J., Greenstein, B. D., Hall, P. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+situ+end-labelling+detects+DNA+strand+breaks+in+apoptosis+and+other+physiological+and+pathological+states%5BTitle%5D)+AND+%22%22%5BJournal%5D)">In situ end-labelling detects DNA strand breaks in apoptosis and other physiological and pathological states.</a> 170 (1), 1-8 (1993).</li>
<li>Ben-Izhak, O., Laster, Z., Akrish, S., Cohen, G., Nagler, R. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((TUNEL+as+a+tumor+marker+of+tongue+cancer%5BTitle%5D)+AND+%22Anticancer+Res%22%5BJournal%5D)">TUNEL as a tumor marker of tongue cancer.</a> Anticancer Res. 28 (5B), 2981-2986 (2008).</li>
<li>Colecchia, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Detection+of+apoptosis+by+the+TUNEL+technique+in+clinically+localised+prostatic+cancer+before+and+after+combined+endocrine+therapy%5BTitle%5D)+AND+%22%22%5BJournal%5D)">Detection of apoptosis by the TUNEL technique in clinically localised prostatic cancer before and after combined endocrine therapy.</a> 50 (5), 384-388 (1997).</li>
<li>Collins, A. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+comet+assay+for+DNA+damage+and+repair%3A+principles%2C+applications%2C+and+limitations%5BTitle%5D)+AND+%22Mol.+Biotechnol%22%5BJournal%5D)">The comet assay for DNA damage and repair: principles, applications, and limitations.</a> Mol. Biotechnol. 26 (3), 249-261 (2004).</li>
<li>Delaurier, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+Mouse+Limb+Anatomy+Atlas%3A+an+interactive+3D+tool+for+studying+embryonic+limb+patterning%5BTitle%5D)+AND+%22%22%5BJournal%5D)">The Mouse Limb Anatomy Atlas: an interactive 3D tool for studying embryonic limb patterning.</a> 8, 83(2008).</li>
<li>Torres, C., Munell, F., Ferrer, I., Reventos, J., Macaya, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Identification+of+necrotic+cell+death+by+the+TUNEL+assay+in+the+hypoxic-ischemic+neonatal+rat+brain%5BTitle%5D)+AND+%22Neurosci.+Lett%22%5BJournal%5D)">Identification of necrotic cell death by the TUNEL assay in the hypoxic-ischemic neonatal rat brain.</a> Neurosci. Lett. 230 (1), 1-4 (1997).</li>
<li>Didenko, V. V. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aDidenko%2C+VV+%22In+Situ+Detection+of+DNA+Damage+%3A+Methods+and+Protocols%22">In Situ Detection of DNA Damage : Methods and Protocols</a>. , Humana Press. 978-970 (2002).</li>
<li>Edelman, J. C., Edelman, P. M., Kniggee, K. M., Schwartz, I. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Isolation+of+skeletal+muscle+nuclei%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Isolation of skeletal muscle nuclei.</a> J. Cell Biol. 27 (2), 365-378 (1965).</li>
<li>Facchinetti, A., Tessarollo, L., Mazzocchi, M., Kingston, R., Collavo, D., Biasi, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((An+improved+method+for+the+detection+of+DNA+fragmentation%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Immunol.+Methods%22%5BJournal%5D)">An improved method for the detection of DNA fragmentation.</a> J. Immunol. Methods. 136 (1), 125-131 (1991).</li>
<li>Fayzullina, S., Martin, L. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Skeletal+muscle+DNA+damage+precedes+spinal+motor+neuron+DNA+damage+in+a+mouse+model+of+spinal+muscular+atrophy+%28SMA%29%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS.One%22%5BJournal%5D)">Skeletal muscle DNA damage precedes spinal motor neuron DNA damage in a mouse model of spinal muscular atrophy (SMA).</a> PLoS.One. 9 (3), e93329(2014).</li>
<li>Ferrer, I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Naturally+occurring+cell+death+in+the+developing+cerebral+cortex+of+the+rat.+Evidence+of+apoptosis-associated+internucleosomal+DNA+fragmentation%5BTitle%5D)+AND+%22Neurosci.+Lett%22%5BJournal%5D)">Naturally occurring cell death in the developing cerebral cortex of the rat. Evidence of apoptosis-associated internucleosomal DNA fragmentation.</a> Neurosci. Lett. 182 (1), 77-79 (1994).</li>
<li>Gavrieli, Y., Sherman, Y., Ben-Sasson, S. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Identification+of+programmed+cell+death+in+situ+via+specific+labeling+of+nuclear+DNA+fragmentation%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Identification of programmed cell death in situ via specific labeling of nuclear DNA fragmentation.</a> J. Cell Biol. 119 (3), 493-501 (1992).</li>
<li>Gown, A. M., Willingham, M. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Improved+detection+of+apoptotic+cells+in+archival+paraffin+sections%3A+immunohistochemistry+using+antibodies+to+cleaved+caspase+3%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Histochem.+Cytochem%22%5BJournal%5D)">Improved detection of apoptotic cells in archival paraffin sections: immunohistochemistry using antibodies to cleaved caspase 3.</a> J. Histochem. Cytochem. 50 (4), 449-454 (2002).</li>
<li>Hara, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Neuronal+apoptosis+studied+by+a+sequential+TUNEL+technique%3A+a+method+for+tract-tracing%5BTitle%5D)+AND+%22Brain+Res.+Brain+Res.+Protoc%22%5BJournal%5D)">Neuronal apoptosis studied by a sequential TUNEL technique: a method for tract-tracing.</a> Brain Res. Brain Res. Protoc. 4 (2), 140-146 (1999).</li>
<li>Harn, H. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Apoptosis+occurs+more+frequently+in+intraductal+carcinoma+than+in+infiltrating+duct+carcinoma+of+human+breast+cancer+and+correlates+with+altered+p53+expression%3A+detected+by+terminal-deoxynucleotidyl-transferase-mediated+dUTP-FITC+nick+end+labelling+%28TUNEL%29%5BTitle%5D)+AND+%22Histopathology%22%5BJournal%5D)">Apoptosis occurs more frequently in intraductal carcinoma than in infiltrating duct carcinoma of human breast cancer and correlates with altered p53 expression: detected by terminal-deoxynucleotidyl-transferase-mediated dUTP-FITC nick end labelling (TUNEL).</a> Histopathology. 31 (6), 534-539 (1997).</li>
<li>Hsieh-Li, H. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+mouse+model+for+spinal+muscular+atrophy%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Genet%22%5BJournal%5D)">A mouse model for spinal muscular atrophy.</a> Nat. Genet. 24 (1), 66-70 (2000).</li>
<li>Huerta, S., Goulet, E. J., Huerta-Yepez, S., Livingston, E. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Screening+and+detection+of+apoptosis%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Surg.+Res%22%5BJournal%5D)">Screening and detection of apoptosis.</a> J. Surg. Res. 139 (1), 143-156 (2007).</li>
<li>Iwaki, T., Yamashita, H., Hayakawa, T. A color atlas of sectional anatomy of the mouse. 1, 1st edn, Braintree Scientific. Japan. (2001).</li>
<li>Kaufman, M. H. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aKaufman%2C+MH+%22The+atlas+of+mouse+development%22">The atlas of mouse development</a>. , 1st edn, Academic Press. London. (1992).</li>
<li>Koppen, G., Angelis, K. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Repair+of+X-ray+induced+DNA+damage+measured+by+the+comet+assay+in+roots+of+Vicia+faba%5BTitle%5D)+AND+%22Environ.+Mol.+Mutagen%22%5BJournal%5D)">Repair of X-ray induced DNA damage measured by the comet assay in roots of Vicia faba.</a> Environ. Mol. Mutagen. 32 (2), 281-285 (1998).</li>
<li>Kuehl, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Isolation+of+skeletal+muscle+nuclei%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Isolation of skeletal muscle nuclei.</a> Methods Cell Biol. 15, 79-88 (1977).</li>
<li>Kuo, L. J., Yang, L. X. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Gamma-H2AX+-+a+novel+biomarker+for+DNA+double-strand+breaks%5BTitle%5D)+AND+%22In+Vivo%22%5BJournal%5D)">Gamma-H2AX - a novel biomarker for DNA double-strand breaks.</a> In Vivo. 22 (3), 305-309 (2008).</li>
<li>Labat-Moleur, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((TUNEL+apoptotic+cell+detection+in+tissue+sections%3A+critical+evaluation+and+improvement%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Histochem.+Cytochem%22%5BJournal%5D)">TUNEL apoptotic cell detection in tissue sections: critical evaluation and improvement.</a> J. Histochem. Cytochem. 46 (3), 327-334 (1998).</li>
<li>Modak, S. P., Bollum, F. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Detection+and+measurement+of+single-strand+breaks+in+nuclear+DNA+in+fixed+lens+sections%5BTitle%5D)+AND+%22Exp.+Cell+Res%22%5BJournal%5D)">Detection and measurement of single-strand breaks in nuclear DNA in fixed lens sections.</a> Exp. Cell Res. 75 (2), 307-313 (1972).</li>
<li>Naruse, I., Keino, H., Kawarada, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Antibody+against+single-stranded+DNA+detects+both+programmed+cell+death+and+drug-induced+apoptosis%5BTitle%5D)+AND+%22Histochemistry%22%5BJournal%5D)">Antibody against single-stranded DNA detects both programmed cell death and drug-induced apoptosis.</a> Histochemistry. 101 (1), 73-78 (1994).</li>
<li>National Research Council (US) Committee for the Update of the Guide for the Care and Use of Laboratory Animals. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=%22Guide+for+the+Care+and+Use+of+Laboratory+Animals%22">Guide for the Care and Use of Laboratory Animals</a>. , 8th edn, National Research Council. Washington, D.C.. (2011).</li>
<li>Negoescu, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+situ+apoptotic+cell+labeling+by+the+TUNEL+method%3A+improvement+and+evaluation+on+cell+preparations%29%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Histochem.+Cytochem%22%5BJournal%5D)">In situ apoptotic cell labeling by the TUNEL method: improvement and evaluation on cell preparations).</a> J. Histochem. Cytochem. 44 (9), 959-968 (1996).</li>
<li>Ostling, O., Johanson, K. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Microelectrophoretic+study+of+radiation-induced+DNA+damages+in+individual+mammalian+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Biochem.+Biophys.+Res.+Commun%22%5BJournal%5D)">Microelectrophoretic study of radiation-induced DNA damages in individual mammalian cells.</a> Biochem. Biophys. Res. Commun. 123 (1), 291-298 (1984).</li>
<li>Phanithi, P. B., Yoshida, Y., Santana, A., Su, M., Kawamura, S., Yasui, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mild+hypothermia+mitigates+post-ischemic+neuronal+death+following+focal+cerebral+ischemia+in+rat+brain%3A+immunohistochemical+study+of+Fas%2C+caspase-3+and+TUNEL%5BTitle%5D)+AND+%22Neuropathology%22%5BJournal%5D)">Mild hypothermia mitigates post-ischemic neuronal death following focal cerebral ischemia in rat brain: immunohistochemical study of Fas, caspase-3 and TUNEL.</a> Neuropathology. 20 (4), 273-282 (2000).</li>
<li>Portera-Cailliau, C., Price, D. L., Martin, L. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Excitotoxic+neuronal+death+in+the+immature+brain+is+an+apoptosis-necrosis+morphological+continuum%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Comp+Neurol%22%5BJournal%5D)">Excitotoxic neuronal death in the immature brain is an apoptosis-necrosis morphological continuum.</a> J. Comp Neurol. 378 (1), 70-87 (1997).</li>
<li>Portera-Cailliau, C., Price, D. L., Martin, L. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Non-NMDA+and+NMDA+receptor-mediated+excitotoxic+neuronal+deaths+in+adult+brain+are+morphologically+distinct%3A+further+evidence+for+an+apoptosis-necrosis+continuum%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Comp+Neurol%22%5BJournal%5D)">Non-NMDA and NMDA receptor-mediated excitotoxic neuronal deaths in adult brain are morphologically distinct: further evidence for an apoptosis-necrosis continuum.</a> J. Comp Neurol. 378 (1), 88-104 (1997).</li>
<li>Ravi, D., Ramadas, K., Mathew, B. S., Nalinakumari, K. R., Nair, M. K., Pillai, M. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((De+novo+programmed+cell+death+in+oral+cancer%5BTitle%5D)+AND+%22Histopathology%22%5BJournal%5D)">De novo programmed cell death in oral cancer.</a> Histopathology. 34 (3), 241-249 (1999).</li>
<li>Sakaki, T., Kohmura, E., Kishiguchi, T., Yuguchi, T., Yamashita, T., Hayakawa, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Loss+and+apoptosis+of+smooth+muscle+cells+in+intracranial+aneurysms.+Studies+with+in+situ+DNA+end+labeling+and+antibody+against+single-stranded+DNA%5BTitle%5D)+AND+%22Acta+Neurochir.%28Wien%29%22%5BJournal%5D)">Loss and apoptosis of smooth muscle cells in intracranial aneurysms. Studies with in situ DNA end labeling and antibody against single-stranded DNA.</a> Acta Neurochir.(Wien). 139 (5), 469-474 (1997).</li>
<li>Shi, S. R., Cote, R. J., Taylor, C. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Antigen+retrieval+immunohistochemistry%3A+past%2C+present%2C+and+future%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Histochem.+Cytochem%22%5BJournal%5D)">Antigen retrieval immunohistochemistry: past, present, and future.</a> J. Histochem. Cytochem. 45 (3), 327-343 (1997).</li>
<li>Shi, S. R., Imam, S. A., Young, L., Cote, R. J., Taylor, C. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Antigen+retrieval+immunohistochemistry+under+the+influence+of+pH+using+monoclonal+antibodies%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Histochem.+Cytochem%22%5BJournal%5D)">Antigen retrieval immunohistochemistry under the influence of pH using monoclonal antibodies.</a> J. Histochem. Cytochem. 43 (2), 193-201 (1995).</li>
<li>Singh, N. P., McCoy, M. T., Tice, R. R., Schneider, E. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+simple+technique+for+quantitation+of+low+levels+of+DNA+damage+in+individual+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Exp.+Cell+Res%22%5BJournal%5D)">A simple technique for quantitation of low levels of DNA damage in individual cells.</a> Exp. Cell Res. 175 (1), 184-191 (1988).</li>
<li>Sirvent, J. J., Aguilar, M. C., Olona, M., Pelegri, A., Blazquez, S., Gutierrez, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Prognostic+value+of+apoptosis+in+breast+cancer+pT1-pT2%29.+A+TUNEL%2C+p53%2C+bcl-2%2C+bag-1+and+Bax+immunohistochemical+study%5BTitle%5D)+AND+%22Histol.Histopathol%22%5BJournal%5D)">Prognostic value of apoptosis in breast cancer pT1-pT2). A TUNEL, p53, bcl-2, bag-1 and Bax immunohistochemical study.</a> Histol.Histopathol. 19 (3), 759-770 (2004).</li>
<li>Skyrlas, A., Hantschke, M., Passa, V., Gaitanis, G., Malamou-Mitsi, V., Bassukas, I. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Expression+of+apoptosis-inducing+factor+%28AIF%29+in+keratoacanthomas+and+squamous+cell+carcinomas+of+the+skin%5BTitle%5D)+AND+%22Exp.+Dermatol%22%5BJournal%5D)">Expression of apoptosis-inducing factor (AIF) in keratoacanthomas and squamous cell carcinomas of the skin.</a> Exp. Dermatol. 20 (8), 674-676 (2011).</li>
<li>Smith, M. D., Weedon, H., Papangelis, V., Walker, J., Roberts-Thomson, P. J., Ahern, M. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Apoptosis+in+the+rheumatoid+arthritis+synovial+membrane%3A+modulation+by+disease-modifying+anti-rheumatic+drug+treatment%5BTitle%5D)+AND+%22Rheumatology.%28Oxford%29%22%5BJournal%5D)">Apoptosis in the rheumatoid arthritis synovial membrane: modulation by disease-modifying anti-rheumatic drug treatment.</a> Rheumatology.(Oxford). 49 (5), 862-875 (2010).</li>
<li>Stadelmann, C., Lassmann, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Detection+of+apoptosis+in+tissue+sections%29%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Tissue+Res%22%5BJournal%5D)">Detection of apoptosis in tissue sections).</a> Cell Tissue Res. 301 (1), 19-31 (2000).</li>
<li>Schans, G. P., van Loon, A. A., Groenendijk, R. H., Baan, R. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Detection+of+DNA+damage+in+cells+exposed+to+ionizing+radiation+by+use+of+anti-single-stranded+DNA+monoclonal+antibody%5BTitle%5D)+AND+%22Int.+J.+Radiat.+Biol%22%5BJournal%5D)">Detection of DNA damage in cells exposed to ionizing radiation by use of anti-single-stranded DNA monoclonal antibody.</a> Int. J. Radiat. Biol. 55 (5), 747-760 (1989).</li>
<li>Watanabe, I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Detection+of+apoptotic+cells+in+human+colorectal+cancer+by+two+different+in+situ+methods%3A+antibody+against+single-stranded+DNA+and+terminal+deoxynucleotidyl+transferase-mediated+dUTP-biotin+nick+end-labeling+%28TUNEL%29+methods%5BTitle%5D)+AND+%22Jpn.+J.+Cancer+Res%22%5BJournal%5D)">Detection of apoptotic cells in human colorectal cancer by two different in situ methods: antibody against single-stranded DNA and terminal deoxynucleotidyl transferase-mediated dUTP-biotin nick end-labeling (TUNEL) methods.</a> Jpn. J. Cancer Res. 90 (2), 188-193 (1999).</li>
<li>Watanabe, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Apoptosis+signal-regulating+kinase+1+is+involved+not+only+in+apoptosis+but+also+in+non-apoptotic+cardiomyocyte+death%5BTitle%5D)+AND+%22Biochem.+Biophys.+Res.+Commun%22%5BJournal%5D)">Apoptosis signal-regulating kinase 1 is involved not only in apoptosis but also in non-apoptotic cardiomyocyte death.</a> Biochem. Biophys. Res. Commun. 333 (2), 562-567 (2005).</li>
<li>Yaoita, H., Ogawa, K., Maehara, K., Maruyama, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Attenuation+of+ischemia%2Freperfusion+injury+in+rats+by+a+caspase+inhibitor%5BTitle%5D)+AND+%22Circulation%22%5BJournal%5D)">Attenuation of ischemia/reperfusion injury in rats by a caspase inhibitor.</a> Circulation. 97 (3), 276-281 (1998).</li>
</ol>

ليس لدى المؤلفين ما يكشفون عنه.

وهناك طريقة لكشف وتحليل كمي DNA المرتبط ضرر الخلايا في الماوس العضلات والهيكل العظمي وصفها. ويشمل الإجراء الحصاد الأنسجة، TUNEL تلطيخ، واقتناء الصور الرقمية، وتحليل الصور. هناك حاجة إلى إمدادات وأدوات النسيجية المشتركة، وTUNEL عدة التجارية الخاصة أمر ضروري. بنود المعدات الكبيرة الأساسية اللازمة لناظم البرد، المجهر epifluorescent مع القدرة الصورة الرقمية، ونظام الكمبيوتر لتحليل الصور. وينبغي أن يكون المجرب علم الم...

محطة deoxynucleotidyl ترانسفيراز (TDT) dUTP وضع العلامات نهاية نيك (TUNEL) هو عملية استخدام انزيم TDT إرفاق dUTP إلى 3 &#39;ينتهي من مزدوجة ومفردة الذين تقطعت بهم السبل DNA يكسر 12،23. وذكرت وطريقة TUNEL للكشف عن الخلايا والحمض النووي الضرر لأول مرة منذ أكثر من 20 عاما من قبل Gavrieli وآخرون. 1،12،24. ومنذ ذلك الحين تم تقييمها والأمثل في الأعمال التحضيرية الأنسجة المختلفة 7،23،27،40. وقد استخدم TUNEL لدراسة موت الخلايا الناجم عن نقص التروية من الخلايا العصبية 6،14،29 والعضلية 43،44، excitotoxic المواد موت الخلايا العصبية 30،31، وكما العلامات البيولوجية في علاج التهاب المفاصل 39. كما تم استخدامه كعامل النذير وعلامة الخلايا السرطانية في مختلف السرطانات البشرية 2،3،15،32،37،38،42. وتوجد طرق بديلة لالحمض النووي من التلف والكشف عن موت الخلايا، ولكن لديهم التحديات التقنية والمحاذير. النشاف الجنوبي يمكن أن تستخدم لquantifذ الحمض النووي من التلف في الأنسجة لست] كاملة 7،9-11، ولكن هذه الطريقة لا توفر الدقة المستوى الخلوي ويصعب قياسها كميا. الفحص المذنب هو طريقة خلية القاعدة البديل الذي يتطلب استخراج نواة من خلايا الحفاظ 4،20،28،36. على الرغم من أن الفحص المذنب يعمل بشكل جيد على خلايا معزولة مثقف، هو أكثر صعوبة لإعداد نواة سليمة من أنسجة العضلات والهيكل العظمي 8،21. كما هو الحال مع اللطخة الجنوبية، ومقايسة المذنب لا يقدم معلومات الخلية من نوع محددة من كله جناسة الأنسجة العضلية. وثمة بديل آخر لطريقة TUNEL هو المناعية باستخدام أجسام مضادة ضد احد الذين تقطعت بهم السبل DNA 25،33،41 أو ضد البروتينات التي تشارك في الحمض النووي ردا الضرر وموت الخلايا مسارات (مثل البروتين p53، H2AX، وcaspases) 13،17،22،40. مثل هذه الأساليب القائمة على الأجسام المضادة تتطلب توصيف دقيق للالأجسام المضادة والأجسام المضادة خصوصية ممتازة لانتاج نسبة عالية الإشارة إلى الخلفية. حتى عندما المواصفاتالأجسام المضادة IFIC موجودة، وأنها قد تتطلب تمسخ من البروتين الهدف من خلال إجراءات استرجاع مستضد 34،35. ونحن نناقش هنا، استرجاع مستضد في نتائج الأنسجة العضلية في تألق ذاتي عالية بشكل غير مقبول. وخلافا للطرق البديلة، TUNEL يحقق DNA الضرر الكشف مع إشارة عالية وخلفية منخفضة، والنوعية الممتازة التي يمكن اختبارها مع ضوابط بسيطة الإيجابية والسلبية، اختراق الأنسجة الجيدة التي لا تتطلب استرجاع مستضد، والدقة المستوى الخلوي. وبالإضافة إلى ذلك، فإن الطريقة TUNEL يستغرق حوالي 4 ساعات لإكمال، في حين أن الطرق البديلة تتطلب عادة حضانات بين عشية وضحاها. نقوم بدراسة الهيكل العظمي موت الخلايا العضلية في نموذج الفأر من ضمور العضلات الشوكي (SMA) 10 التي تم إنشاؤها بواسطة هسيه لى وزملاؤه 16. لتحديد الخلايا أفكارك في العضلات، قمنا بتطوير طريقة التحضير الأنسجة، وتلطيخ، والكميات التي تعمل بقوة عبر skele مختلفةمجموعات العضلات التل على مختلف النقاط الزمنية التنموية في الفئران. ونحن نستخدم المتاحة تجاريا عدة TUNEL وضع العلامات ومتاحة تجاريا البرمجيات تحليل الصور. وعلينا أيضا أن تستخدم بنجاح الفحص TUNEL في تركيبة مع تلوين مناعي في الحبل الشوكي 10. الأساليب المذكورة هنا هي مفيدة للمحققين الذين يريدون لتقييم أمراض الأنسجة، وآليات المرض، وآليات الشيخوخة، والتنموية (قبل وبعد الولادة) موت الخلايا في العضلات والهيكل العظمي. تقنية TUNEL مفيدة بشكل خاص للدراسات الحمض النووي من التلف وإصلاح وموت الخلايا في نظم نموذج حيث لا يوجد سوى مجموعة فرعية من الخلايا هي قرار مستوى المتضررين والخلوية ضروري. هذا الفيديو يصف تشريح، معالجة الأنسجة، باجتزاء، ووضع العلامات TUNEL القائم على مضان من الماوس العضلات والهيكل العظمي. ويصف التقرير أيضا وسيلة لشبه الآلي إشارة الكميات TUNEL.

<table><tbody><tr><td>4٪ بارافورمالدهيد في محلول ملحي مخزن بالفوسفات</td><td>علوم المجهر الإلكتروني</td><td>19202</td><td>بالنسبة للإجراءات الموضحة هنا ، تم تحضير محلول 4٪ طازجا من المسحوق. يمكن استخدام بارافورمالدهايد من أي مورد. يجب تخزين محلول الفورمالديهايد المحضر في درجة حرارة 4 درجات ؛ C ويجب عدم استخدامه بعد تاريخ انتهاء صلاحيته (حتى عدة أشهر). بارافورمالدهيد مادة مسرطنة وسم عن طريق الاستنشاق وملامسة الجلد. يرجى اتباع الاحتياطات المحددة في MSDS عند التعامل مع بارافورمالدهايد.</td></tr><tr><td>السكروز</td><td>سيجما</td><td>S0389</td><td>يستخدم لحماية الأنسجة بالتبريد قبل التجميد. يمكن استخدام السكروز من أي مورد.</td></tr><tr><td>O.C.T. مركب</td><td>الأنسجة - Tek</td><td>4583</td><td>وسيط التضمين للتقطيع بالتبريد.</td></tr><tr><td>تم استخدام Cryostat</td><td>Leica</td><td>CM 3050S</td><td>A Leica CM3050S cryostat للمستحضرات الموضحة هنا. أي ناظم ناتج البرد قادر على قطع 10 مو ؛ يمكن استخدام أقسام م.</td></tr>يمكن <tr>استخدام <td>شرائح زجاجية ، 25 × 75 × 1 مم</td><td>فيشر</td><td>12-552-3</td><td>شرائح من أي مورد.</td></tr>يستخدم <tr><td>الجيلاتين</td><td>Sigma</td><td>G-9391</td><td>الجيلاتين لتعزيز التصاق قسم الأنسجة بالشرائح الزجاجية. لطلاء الشرائح الزجاجية بالجيلاتين ، قم بإذابة 2.75 جم من الجيلاتين و 0.275 جم من شب الكروم في 500 مل من الماء المقطر ، دافئا إلى 60 درجة ؛ ج ، اغمس الشرائح لعدة ثوان ، واتركها تجف. يمكن استخدام الجيلاتين من أي مورد. بدلا من ذلك ، يمكن شراء شرائح مغلفة بالجيلاتين.</td></tr><tr><td>كبريتات البوتاسيوم الكروم (III) دوديكاهيدرات (شب الكروم)</td>يضاف <td>Sigma</td><td>243361</td> شب <td>الكروم إلى محلول الجيلاتين لتعزيز التصاق الأنسجة على الشرائح الزجاجية. إنه مادة مسرطنة محتملة وسم عن طريق الاستنشاق وملامسة الجلد. يرجى اتباع الاحتياطات المحددة في MSDS عند التعامل مع شب الكروم.</td></tr><tr><td>كاشف التصاق الأنسجة Vectabond</td><td>Vector Labs</td><td>SP-1800</td><td>ركيزة اختيارية لتحسين التصاق الأنسجة بالشرائح الزجاجية ؛ يمكن استخدام الشرائح المطلية بالجيلاتين بدلا من ذلك.</td></tr><tr><td>Tween20</td><td>Sigma</td><td>P9416</td><td>منظف يستخدم لاختراق الأنسجة. يمكن استخدام Tween20 من أي مورد.</td></tr><tr><td>Triton X100</td><td>Sigma</td><td>T8787</td><td>منظف يستخدم لاختراق الأنسجة. يمكن استخدام Triton X100 من أي مورد.</td></tr><tr><td>طقم الكشف عن موت الخلايا المبرمج TACS 2 TdT in الموقع مجموعة الكشف عن موت الخلايا المبرمج</td><td>Trevigen</td><td>4812-30-K</td><td>مجموعة تجارية لوضع العلامات على TUNEL القائمة على الفلورة.</td></tr><tr><td>DNase / nuclease</td><td>Trevigen</td><td>4812-30-K</td> <td>(مضمن مع المجموعة)</td></tr> <tr><td>DNase / nuclease</td> buffer <td>Trevigen</td><td>4812-30-K</td> <td>(مرفق مع المجموعة)</td></tr> <tr><td>10x محلول ملحي مخزن بالفوسفات (PBS) ، درجة الحموضة 7.4</td><td>Amresco</td><td>780</td><td>اصنع 1x PBS للغسيل والتخفيفات. يمكن استخدام PBS من أي مورد.</td></tr><tr><td>مياه خالية من DNase</td><td>جودة بيولوجية</td><td>351-029-131</td><td>يمكن استخدام المياه من أي مورد.</td></tr><tr><td>Hoechst 33258</td><td>Sigma</td><td>94403</td><td>صبغة نووية. يمكن استخدام أي صبغة نووية فلورية زرقاء. كصبغة ملزمة للحمض النووي ، فإن Hoechst مادة مسرطنة مشتبه بها ويجب التعامل معها بمعدات واقية لتقليل ملامسة الجلد.</td></tr><tr><td>يمكن استخدام Parafilm M</td><td>Multiple</td><td>807</td><td>أي فيلم آخر كاره للماء أو زلة غطاء. متوفر من موردين متعددين.</td></tr>يمكن <tr><td></td><td></td> استخدام <td>أي مجهر فلوري مزود بكاميرا رقمية</td> <td>قادر على التقاط التألق الأحمر والأخضر والأزرق رقميا في قنوات منفصلة.</td></tr>يمكن <tr>استخدام <td>وسائط Vectashield المضادة للتلاشي</td><td>Vector Labs</td><td>H-1000</td><td>Antifade Media من أي مورد.</td></tr>يمكن <tr>استخدام <td>أغطية زجاجية ، سمك رقم 1</td><td>مختبرات أبحاث الدماغ</td><td>2222-1</td><td>زلات غطاء من أي مورد. أصغر حجم 22 × 22 مم يكفي لأقسام أرجل الفأر حديثي الولادة.</td></tr><tr><td>طلاء الأظافر</td><td>تيد بيلا</td><td>114-8</td><td>يستخدم لإغلاق أغطية. يمكن استخدام طلاء الأظافر من أي مورد (بما في ذلك تجار التجزئة العاديين). تجنب استخدام طلاء الأظافر مع اللون أو الإضافات التي قد تعكس الضوء أثناء التصوير الفلوري.</td></tr></tbody></table>

كشف وتحليل الحمض النووي من التلف في العضلات الهيكلية ماوس في الموقع استخدام أسلوب tunel

Detection and Analysis of DNA Damage in Mouse Skeletal Muscle In Situ Using the TUNEL Method

ديوكسي نيوكليوتيديل ترانسفيراز (TdT) ديوكسي أوريدين ثلاثي الفوسفات (dUTP) وسم نهاية النيك (TUNEL) هي طريقة استخدام إنزيم TdT لإرفاق شكل موسوم من dUTP تساهميا بنهايات 3 'من فواصل الحمض النووي المزدوجة والمفردة الشريطة في الخلايا. إنها طريقة موثوقة ومفيدة للكشف عن تلف الحمض النووي وموت الخلايا في الموقع. يصف هذا الفيديو تشريح ومعالجة الأنسجة والتقسيم ووضع العلامات على TUNEL القائم على التألق لعضلة الهيكل العظمي للفأر. كما يصف طريقة القياس الكمي لإشارة TUNEL شبه الآلية. تؤثر ميزات الأنسجة الطبيعية المتأصلة وظروف معالجة الأنسجة على قدرة إنزيم TdT على تسمية الحمض النووي بكفاءة. قد تضيف معالجة الأنسجة أيضا تألقا ذاتيا غير مرغوب فيه يتداخل مع اكتشاف إشارة TUNEL. لذلك ، من المهم تحديد طرق معالجة الأنسجة ووضع العلامات TUNEL تجريبيا والتي ستؤدي إلى نسبة الإشارة إلى الضوضاء المثلى للقياس الكمي اللاحق. يوفر الاختبار القائم على التألق الموصوف هنا طريقة لاستبعاد إشارة الفلورسنت الذاتي عن طريق طرح القناة الرقمية. يعد اختبار TUNEL ، المستخدم مع تقنيات معالجة الأنسجة والضوابط المناسبة ، طريقة كمية سريعة نسبيا وقابلة للتكرار للكشف عن موت الخلايا المبرمج في الأنسجة. يمكن استخدامه لتأكيد تلف الحمض النووي وموت الخلايا المبرمج كآليات مرضية ، ولتحديد أنواع الخلايا المصابة ، وتقييم فعالية العلاجات العلاجية في الجسم الحي.

مع تلطيخ ناجحة، يجب أن تكون-TUNEL إيجابي إشارة مشرق بما فيه الكفاية لعزل من تألق ذاتي من خلال وضع عتبات كثافة. الأجسام TUNEL إيجابية في التكبير المنخفض قد تظهر أجزاء غير منتظمة كما مشرق في العضلات والهيكل العظمي (الشكل 1A). ومع ذلك، في أعلى التكبير، وبعض الكائنات TUNEL الإيجابي مع التشكل أفكارك الكلاسيكي ينبغي أن تراعى، إذا كان نوع موت الخلايا المعنية هو موت الخلايا المبرمج (الشكل 1B). مراقبة إيجابية (المضافة الدناز) يجب أن تظهر وفيرة-TUNEL إيجابي...

يصف هذا الفيديو التشريح ومعالجة الأنسجة والتقسيم ووضع العلامات على TUNEL المستند إلى التألق لعضلة الهيكل العظمي للفأر. كما يصف طريقة للتحليل شبه الآلي لوضع العلامات على TUNEL.

كشف وتحليل الحمض النووي من التلف في العضلات الهيكلية ماوس في الموقع استخدام أسلوب TUNEL

Terminal deoxynucleotidyl transferase (TdT) deoxyuridine triphosphate (dUTP) nick end labeling (TUNEL) is the method of using the TdT enzyme to covalently ...

الهدف العام من هذا الإجراء هو الكشف عن فواصل الحمض النووي وموت الخلايا في C الثاني. يتم تحقيق ذلك عن طريق أقسام الأنسجة المنفذة الأولى للسماح لكواشف النفق بدخول نواة الخلية. بعد ذلك ، يتم استخدام إنزيم TDT لربط DTPs تساهميا بثلاثة نهايات أولية من فواصل الحمض النووي في هذه الخلايا.ثم يتم تمييز DUTP بمسبار الفلورسنت. في النهاية ، يتم قياس الإشارة الموجبة للنفق في أقسام الأنسجة التي تعكس التكرار النسبي لفواصل الحمض النووي في الخلايا. الميزة الرئيسية لهذه التقنية على الطرق الحالية مثل النشاف الجنوبي أو الكيمياء المناعية ، هي أنها سريعة نسبيا ومحددة وتوفر طريقة للتخلص من الضوضاء والتألق الذاتي.ابدأ بتثبيت الأطراف الخلفية المعزولة في 4٪ بارا فورمالديهايد في PBS في أنبوب سعة 15 مليلتر ، مما يسمح للتثبيت بالعمل لمدة أربع إلى 24 ساعة على الأكثر عند أربع درجات مئوية. هناك حاجة إلى ساعتين فقط إذا كانت الأنسجة جنينية. ومع ذلك ، بعد التثبيت ، استبدل المحلول بنسبة 10٪ سكروز لحماية الأنسجة بالتبريد واحتضانها طوال الليل عند أربع درجات مئوية.في اليوم التالي ، قم بتغيير المحلول إلى سكروز معقم مفلتر بنسبة 30٪ واستمر في الحضانة طوال الليل أو حتى تغرق الأطراف الخلفية في قاع الأنبوب. عند التضمين ، من المهم أن تكون الأطراف الخلفية مغمورة تماما في وسط التضمين. يمكن وضع قوالب التضمين مباشرة على الثلج الجاف أو في isop pentane على الثلج الجاف لتجميد الوسط.عند التشريح بالتبريد. قطع الكتل أقسام النقل التي يبلغ سمكها 10 ميكرون أو أرق ، ولن يتم اختراق الأقسام السميكة بواسطة كواشف وضع العلامات على النفق. اجمع هذه الأقسام الرقيقة على شرائح زجاجية مطلية بالجيلاتين أو الرابطة المتجهة في درجة حرارة الغرفة.بسرعة كبيرة ، انقل الشرائح إلى الثلج الجاف للتخزين. قم أولا بإذابة شريحة من قسم المناديل المجمدة إلى درجة حرارة الغرفة واتركها تجف لمدة 16 إلى 64 ساعة. بمجرد أن تصبح الشريحة في درجة حرارة الغرفة ، أعد ترطيب القسم في وعاء توصيل مملوء ببرنامج تلفزيوني لمدة 10 دقائق.كرر خطوة إعادة الجفاف هذه مرة واحدة ، ثم جفف الشريحة بعناية بمنديل مختبري دون إزعاج قسم الأنسجة لترشيد القسم ، ضع الشريحة في غرفة الرطوبة والماصة 50 ميكرولترا من الكواشف التجارية ذات قاعدة الصابونين غير المحللة للبروتين على القسم. لا تضع الماصة مباشرة على الأقسام لأنها يمكن أن تنفصل أو تتلف. ثم ضع قطعة صغيرة من الفيلم فوق القسم لنشر الكاشف.إذا تشكلت فقاعات، أعد تطبيق الفقرة فيلم. دع الشريحة تحتضن لمدة ساعة بعد ساعة. قم بإزالة الكواشف باستخدام غسلتين لمدة خمس دقائق في PBS واتركها حتى تجف بعناية.بجانب فواصل الحمض النووي الملصقة بواسطة TDT ، استخدم مجموعة متوفرة تجاريا. أولا ، قم بعمل مخزن مؤقت XTDT واحد وماصة فوق القسم. ثم احتضان الشريحة لمدة خمس دقائق في غرفة الترطيب.ثانيا ، قم بعمل مزيج وضع العلامات على TDT وفقا لتعليمات المجموعة أو شريحة تحكم إيجابية. أضف الحمض النووي إلى مزيج وضع العلامات على TDT. للحصول على شريحة تحكم سلبية ، احذف إنزيم TDT من المزيج.الآن باستخدام مسحة ، قم بإزالة أكبر قدر ممكن من المخزن المؤقت من الشريحة وقم بتثبيتها على مزيج الملصقات. يجب أن يكفي 50 ميكرولتر. مرة أخرى ، انشر المحلول مع الطفيلي دون صنع فقاعات.دع الشريحة تحتضن في الغرفة لمدة ساعة الآن عند 37 درجة مئوية. ثالثا ، قم بعمل المخزن المؤقت x stop وفقا لتعليمات المجموعة. بعد إزالة مزيج الملصقات بمنديل المختبر ، أضف ما بين اثنين و 300 ميكرولتر من مزيج التوقف لتغطية القسم بالكامل.ثم احتضان الشريحة لمدة خمس دقائق في الغرفة. لا يتم استخدام أي فيلم para في هذه الخطوة. لإزالة المخزن المؤقت للتوقف ، استخدم غسلتين لمدة دقيقتين في PBS.الآن ماصة 50 ميكرولتر من محلول وضع العلامات على الفلورسين المحضر حديثا. على الشريحة ، ضع perfil واحتضن لمدة 20 دقيقة في الغرفة ، ولكن الآن في الظلام. قم بإزالة محلول الملصقات بغسل واحد لمدة دقيقتين في PBS أثناء الغسيل ، قم بتخفيف بعض الخطافات.3 3 ، 2 ، 5 8 إلى ميكروغرام واحد لكل مليلتر في PBS. بعد الغسيل ، قم بتغطية الأقسام في واحد إلى 200 ميكرولتر من محلول الخطافات المخفف. ثم احتضن الشريحة لمدة خمس دقائق ، محمية من الضوء لإزالة الخطافات للبقع ، استخدم ثلاث غسلات لمدة خمس دقائق في PBS.ثم جفف الشريحة بعناية بمنديل معمل وقم بتطبيق زلة غطاء للتصوير. قم بتصوير القسم باستخدام مرشحات DPI و fitzy و Texas الحمراء لفصل بقع الخطافات وبقع النفق وإشارات التألق الذاتي إلى ثلاث قنوات ألوان زائفة في صورة واحدة. توحيد والحفاظ على نفس إعدادات التصوير بين جميع الشرائح بحيث يمكن مقارنتها بسهولة.لا تستخدم أي إعدادات تعريض ضوئي أو اكتساب تلقائية للرجوع إليها التشريحية. استخدم صورة ساحقة ساطعة لقسم طرف خلفي مجاور ملطخ ب h و e في برنامج تحليل الصور. قم بإيقاف تشغيل قناة النفق.ثم تتبع الخطوط العريضة لمنطقة العضلات يدويا ليتم قياسها كميا باستخدام القنوات الأخرى. قم بتحويل المنطقة التي تم تتبعها إلى قناع. ثم أعد تشغيل قناة النفق واضبط الحد الأدنى للشدة لاستبعاد إشارة الفلورسنت الذاتي.استخدم نفس حد الحد في جميع الأقسام التي تم تحليلها في الدراسة. بعد ذلك ، قم بتحويل وحدات بكسل العتبة إلى قناع. في كل صورة، اجمع بين قناع منطقة العضلات وقناع النفق الحدودي.هذا يجعل تمثيل إشارة النفق داخل منطقة العضلات المتتبعة. الآن قم بتحديد كمية القناع المركب لتحديد عدد الكائنات الموجبة للنفق ومساحة البكسل الإجمالية لإشارة النفق داخل العضلات. استخدم هذه القيم للتحليل الإحصائي.قد تظهر الأجسام الموجبة للنفق ذات التكبير المنخفض على شكل شظايا ساطعة غير منتظمة في العضلات الهيكلية. ومع ذلك ، عند التكبير العالي ، يجب ملاحظة بعض الأجسام الإيجابية للنفق ذات التشكل المبرمج الكلاسيكي إذا كان نوع موت الخلية ينطوي على موت الخلايا المبرمج هذا. يجب أن يظهر التحكم الإيجابي مع الحمض النووي D المضاف إشارة إيجابية وفيرة للنفق موزعة بشكل موحد عبر جميع الأنسجة.في القسم. يجب أن يكون للتحكم السلبي بدون إنزيم TDT خلفية منخفضة الكثافة ويظهر التألق الذاتي فقط. باستخدام البروتوكول الموصوف ، وجد أن كرات الدم الحمراء في العظام والخلايا البطانية ساهمت في إشارة الفلورسنت الذاتي في أقسام الأطراف العالية المعدة.كانت الإشارة الإيجابية للنفق الحقيقي أكثر كثافة. يمكن عزله عن إشارة الفلورسنت الذاتي باستخدام عتبة شدة البكسل. كان هناك خيار آخر لعزل إشارة النفق وهو طرح قناة التألق الذاتي الحمراء رقميا من قناة النفق.باستخدام هذه التقنية ، موت خلايا العضلات الهيكلية. في نموذج فأر من SMA تم تقييمه ، كشف وضع العلامات النفقية عن خلايا موت الخلايا المبرمج في الفئران SMA البالغة من العمر خمسة أيام أكثر من الضوابط. من خلال تحديد تلطيخ النفق ، تبين أن هذه الملاحظة ذات دلالة إحصائية لمجموعات عضلية متعددة داخل الطرف الخلفي.بمجرد إتقانها ، يمكن إجراء تقنية النفق في حوالي أربع ساعات لتوليد نتائج كمية موثوقة.

detection-analysis-dna-damage-mouse-skeletal-muscle-situ-using-tunel

Research

JoVE Journal

Biology

علم الأحياء

الموصوفة هنا البروتوكولات المستخدمة لتصور عملية ديناميكية من MG53 بوساطة غشاء الخلية إصلاح في الحيوانات كلها وعلى المستوى الخلوي. ويمكن تطبيق هذه الأساليب لتحقيق في بيولوجيا الخلايا من إعادة عزل غشاء البلازما والطب التجديدي.

MG53 تصور بوساطة غشاء الخلية عن طريق إصلاح في الجسم الحي و في المختبر أنظمة

في هذا الفيديو، يتم إجراء اختبار TUNEL للكشف عن وجود خلايا موت الخلايا المبرمج في العينة. تتضمن الدراسة استخدام بوليميراز الحمض النووي الخاص - ديوكسي نيوكليوتيديل ترانسفيراز الطرفي - الذي يحفز إضافة dUTPs المسمى إلى الطرف 3 من الحمض النووي المجزأ ، والذي يمكن ملاحظته وتحديده تحت المجهر الفلوري.

وضع العلامات الطرفية dUTP Nick بوساطة النقل الطرفي - اختبار TUNEL: طريقة في الموقع للكشف عن تجزئة الحمض النووي في الخلايا المبرمج

&lt; p class = 'jove_content'&gt; يمكن للتصوير الطيفي الإلكتروني تصوير وتمييز الحمض النووي عن البروتين بدقة نانومتر. يمكن دمجه مع نظام miniSOG ، القادر على تسمية البروتينات الموسومة على وجه التحديد في عينات المجهر الإلكتروني الناقل. نوضح استخدام هذه التقنيات باستخدام بؤر إصلاح كسر مزدوجة الخيط كمثال.

تصور miniSOG معلم البروتينات إصلاح الحمض النووي في الجمع مع الكترون طيفية تصوير (ESI)

يتم جمع متتالية المقاطع البرد لتمكين التطبيقات النسيجية والإثراء من الحمض النووي الريبي لقياس التعبير الجيني باستخدام المناطق المجاورة من ماوس واحدة العضلات والهيكل العظمي. يتم الحصول على جودة عالية RNA 20-30 ملغ من cryosections والقياسات المجمعة تتم مقارنة مباشرة عبر تطبيقات.

Cryosectioning المناطق المتاخمة من العضلات الهيكلية واحدة فأرة للالتعبير الجيني والتحليلات النسيجية

هنا نقدم بروتوكول مفصلاً للكشف عن كل مسن والخلايا الجذعية pluripotent في العضلات الهيكلية عند الإصابة أثناء حمل في فيفو إعادة برمجة. هذا الأسلوب مناسبة لتقييم دور الشيخوخة الخلوية أثناء تجديد الأنسجة وإعادة برمجة في فيفو.

تقييم الضرر الناجم عن الشيخوخة و في فيفو إعادة برمجة في العضلات الهيكلية

وصف هنا هو بروتوكول للمناعة المباشرة من ألياف العضلية الميتة في العضلات. الخلايا الميتة هي نفاذيه للبروتينات المصل ، بما في ذلك الغلوبولين المناعي G (مفتش). الكشف عن امتصاص مفتش من قبل myofibers يسمح لتحديد والتقدير الكمي من ألياف العضلية التي تخضع لنخر بغض المثل عن حاله العضلات.

المناعية انحطاط Myofiber في العضلات الخزعات

هنا، نقترح طريقة للحصول بكفاءة على ألياف العضلات واحدة في المراحل التنموية المبكرة بعد الولادة من homozygous متحولة لامين Δ 8-11 نموذج الماوس، وهو نموذج شديد جدا لالتد وضمور العضلات Emery-Dreifuss (EDMD).

عزلة وثقافة ميفيبر واحدة من نموذج مورين من ضمور العضلات إيمري-دريفوس في وقت مبكر بعد الولادة

يعد تحويل الحمض النووي البلازميدي بالكهرباء إلى العضلات الهيكلية طريقة قابلة للتطبيق لتعديل التعبير الجيني دون المساس بانقباض العضلات لدى الفئران.

كهربية الحمض النووي البلازميد في العضلات الهيكلية للفأر

يعد الحفاظ على سلامة جينوم البويضة أمرا ضروريا لضمان الإخلاص الجيني في الجنين الناتج. هنا ، نقدم بروتوكولا دقيقا للكشف عن فواصل الحمض النووي المزدوجة في الخلايا الجرثومية الأنثوية للثدييات.

الكشف عن فواصل الحمض النووي المزدوجة التي تقطعت بها السبل في بويضات الفئران

يتيح البروتوكول المقدم هنا تحديد وتحليل الأبعاد العالية للخلايا الجذعية والسلفية العضلية عن طريق قياس الكتلة الخلوية أحادية الخلية وتنقيتها بواسطة FACS لإجراء دراسات متعمقة لوظيفتها. يمكن تطبيق هذا النهج لدراسة ديناميكيات التجديد في نماذج المرض واختبار فعالية التدخلات الدوائية.

تحديد وتحليل السلف العضلي في الجسم الحي أثناء إصابة العضلات الهيكلية الحادة عن طريق قياس الكتلة الخلوية أحادية الخلية عالية الأبعاد

حقن موضعية لصبغة ميتوكوندريا نهاية ميتوكوندريا خلية شوان في الجسم الحي للمجهر الكونفوكلي. تستخدم هذه الطريقة إثبات المفهوم الذي تم إثباته في أنسجة العضلات الهيكلية من فئران ذات عضلات سليمة أو مريضة لتوفير تصور ميتوكوندريا بدقة عالية.

طرق القياس الميداني لشكل الميتوكوندريا في خلايا العضلات والشوان الطرفية للفئران

اكتشف طريقة TUNEL لكشف تلف الحمض النووي في عضلات الفأر الهيكلية. تتيح هذه التقنية السريعة والمحددة قياس موت الخلايا بدقة عالية مقارنة بالطرق التقليدية.

كشف وتحليل الحمض النووي من التلف في العضلات الهيكلية ماوس في الموقع استخدام أسلوب TUNEL

استكشف المزيد من الفيديوهات