اشتقاق كفاءة خلايا الظهارة الصبغية الشبكية من الخلايا الجذعية

الهدف العام من هذا الإجراء هو اشتقاق ظهارة صبغة الشبكية عالية الجودة ، أو RPE من الخلايا الجذعية. يتم تحقيق ذلك عن طريق زراعة الخلايا الجذعية متعددة القدرات المحفزة لأول مرة للطلاقة. في الخطوة الثانية ، يتم تغيير الوسائط لتوجيه الخلايا إلى مصائر RPE.

بعد ذلك ، يتم عزل خلايا RPE عن الخلايا المتمايزة الأخرى في الطبق ، ثم يتم توسيع الثقافات حتى يتم الحصول على أعداد كافية من الخلايا. في النهاية ، يمكن استخدام التصبغ الداكن والأشكال المرصوفة بالحصى للثقافات للتأكد من أن خلايا RPE تصل إلى التمايز النهائي. الميزة الرئيسية لهذه التقنية على الطرق الحالية مثل التمايز التلقائي ، هي أن إضافة عوامل محددة تسرع التمايز والوقت وتزيد من عائد RPE.

حتى الآن ، تم علاج الآلاف من القوارض باستخدام خلايا RPE ، المشتقة من مجموعة متنوعة من الأمراض التنكسية في الشبكية IPSA. ومع ذلك ، إذا قمنا بترجمة هذا بكفاءة وفعالية إلى علاج البشر في العيادات بهذه الأمراض ، فمن الضروري للغاية أن نطور بروتوكولات راسخة قابلة للتكرار ، والتي ستزودنا بجودة عالية وأعداد كبيرة من مبيعات RPE و IPS العرض المرئي لهذه الطريقة ضروري حيث يمكن لشخص واحد فقط العمل في المجهر تحت الغطاء في أي وقت ، مما يجعل خطوة العزل صعبة التصور. سيقوم ميتشل برينس ، فني أبحاث من مختبري ، بعرض البروتوكول المرتبط بجوانب الثقافة الرقمية للإجراء لتوجيه التمايز في ثقافة RPE المشتقة من الخلايا الجذعية ، خط الفائدة للخلايا الجذعية على طبقة من خلايا التغذية الجنينية للفأر في ضعفين في 10 إلى الخلايا الست لكل بئر من ستة ألواح آبار ، اسمح للمستعمرات بالوصول إلى طلاقة COF ثم التبديل إلى الوجبات اليومية مع التمايز.

متوسط مكمل بالنيكوتيناميد. بعد ثلاثة أسابيع ، ابدأ في إضافة نشط في أو IDE واحد إلى الوجبات لتعزيز تمايز RPE. بعد أسبوعين ، عد إلى وسط التمايز والنيكوتيناميد وحده مع التوقف عن الرضاعة اليومية.

بمجرد أن تتوقف مؤشرات الأس الهيدروجيني في الوسط عن التحول إلى اللون الأصفر في اليوم التالي للرضاعة ، أعد المزرعة إلى الحاضنة حتى تظهر ثقوب الخلايا المصطبغة كبيرة بما يكفي لقطعها وإزالتها. لعزل الثقوب المصطبغة في الطبقة التالية ، فإن آبار صفيحة 24 بئرا مع مصفوفة خالية من xeno تحاكي بيئة الخلية الطبيعية. بعد ذلك ، املأ أكبر عدد ممكن من الآبار من لوحة 24 بئر بوسائط التمايز حسب الحاجة.

وفي غطاء مزرعة الخلايا ، استخدم منظار تشريح ومشرط لتقطيع كل ثقب مصطبغ في الجزء السفلي من اللوحة الأصلية إلى قطعتين إلى ست قطع والاستيلاء على الأجزاء المصطبغة بملقط حاد ثم نقل قطعة إلى قطعتين مصطبغتين إلى كل منهما.24. حسنا ، احتضن اللوحة عند 37 درجة مئوية و 5٪ ثاني أكسيد الكربون لمدة ثلاثة إلى خمسة أيام حتى تلتصق الخلايا. ثم ابدأ في تغيير الوسائط ثلاث مرات في الأسبوع.

قم بتوسيع الخلايا لمدة ثلاثة إلى أربعة أسابيع في وسط التمايز. الاستمرار في تغذية الخلايا ثلاث مرات في الأسبوع حتى تمر. يضيف RPE 200 ميكرولتر من محلول تفكك الخلايا غير التربسين الدافئ عند 37 درجة مئوية لفصل الخلايا.

بعد خمس إلى ثماني دقائق ، أوقف التفاعل باستخدام وسائط تمايز جديدة ثم أعد تعليق المزارع في معلقات أحادية الخلية باستخدام ماصة سعة 200 ميكرولتر ، وتجميع المستعمرات مع عدد قليل من الخلايا. بعد ذلك ، انقل المستعمرات المنفصلة إلى أنابيب سعة 15 مليلتر وقم بتدوير الخلايا. يقوم Resus بتعليق الكريات في ثلاثة ملليلتر من وسائط التمايز ، ونقل كل منها المستعمرات إلى كل بئر من صفيحة مصفوفة مشفرة بستة آبار تحتوي على ثلاثة ملليلتر إضافي من وسائط التمايز لكل بئر.

ثم قم بتوسيع الخلايا لمدة أسبوع إلى أسبوعين حتى تصبح الخلايا ملتقية بنسبة 90٪ تقريبا وافصل الخلايا مرة أخرى في مليلتر واحد من محلول التفكك كما هو موضح للتو. هذه المرة. باستخدام ماصة سعة 1000 ميكرولتر لإعادة تعليق الخلايا ، انقل محلول الخلية المفردة إلى أنبوب مخروطي سعة 50 مل.

وبعد ذلك بعد تدوير الخلايا مرة أخرى ، قم بتعليق الحبيبات. في 18 مل من التمايز ، تقوم الوسائط أخيرا بنسخ الخلايا في حاوية ثقافة مشفرة بالمصفوفة للحصول على أكبر عدد ممكن من الخلايا المرغوبة في الحد الأدنى من الممرات لمزيد من التحليل النهائي ، تبدأ المستعمرات المصطبغة في الظهور بعد خمسة إلى سبعة أسابيع من زراعة خط الخلايا الجذعية المحفزة متعددة القدرات. يمكن أن تستمر هذه المستعمرات في النمو لأسابيع مع الحفاظ على الثقافات.

بمجرد وصولها إلى حجم كاف ، يمكن استئصالها يدويا. يسهل الاستئصال الدقيق لتجنب التلوث بالخلايا غير RPE إلى حد كبير توليد ثقافات RPE نقية بما فيه الكفاية. بمجرد إتقانها ، يمكن اشتقاق أعداد كبيرة من خلايا RPE في غضون ثمانية إلى 12 أسبوعا إذا تم تنفيذ هذه التقنية بشكل صحيح.

أثناء محاولة هذا الإجراء ، من المهم أن تتذكر أن تكون حريصا على عدم تلويث الثقافات أثناء صنع الوسائط وتغذية الخلايا. بعد مشاهدة هذا الفيديو ، نأمل أن يتمكن الكثير منكم من إنتاج أعداد كبيرة من خلايا RPE عالية الجودة من IPS. نأمل أن يسهل ذلك الترجمة الأسرع من المقعد إلى السرير ، ويقدم علاجات قائمة على الخلايا للمرضى الذين يعانون من أمراض الأوعية الدموية التنكسية الشبكية غير القابلة للعلاج حاليا.