التصوير حيوي داخلي من محور عصبي التفاعل مع الخلايا الدبقية الصغيرة والضامة في ماوس الظهرية الإصابات سحق العمود

الهدف العام من هذا الإجراء هو مراقبة الحركة والتفاعل بين الخلايا الدبقية الصغيرة والخلايا الوحيدة وأنواع الخلايا الأخرى في الحبل الشوكي المصاب. يتم تحقيق ذلك عن طريق إنشاء فئران خيميرية من نخاع العظم أولا تحتوي على خلايا دبقية صغيرة مقيمة أو ضامة مشتقة من نخاع العظم تحمل علامة الفلورسنت. الخطوة الثانية هي إحداث إصابة سحق العمود الظهري في النخاع الشوكي.

ثم يتم إعادة فتح وتثبيت الحبل الشوكي للتصوير متعدد الفوتون ، فإن الخطوة الأخيرة هي التقاط صور مفردة أو أفلام بفاصل زمني داخل الآفة. في النهاية ، يظهر تحليل الصور الحركة الخلوية والتفاعل الخلوي مع الركائز المحيطة. تتمثل المزايا الرئيسية لهذه التقنية على التقنية التقليدية ، مثل زراعة الخلايا والأنسجة الثابتة ، في أنه يمكن تصوير الخلايا في بيئتها الطبيعية المعقدة في الحي.

في هذه الجراحة ، استخدم المعدلة وراثيا أو مزدوجة الوراثة. راجع البروتوكول النصي حول كيفية تسمية الخلايا المقيمة أو المشتقة من نخاع العظم بعد تحفيز التخدير ، والحفاظ عليها بفلور ISO واحد إلى 2٪ للحصول على معدل تنفس يتراوح من 60 إلى 100 نفس في الدقيقة. الآن ، ضع مراهم العين وتأكد من مستوى التخدير الجراحي مع قرصة إصبع القدم.

استعد للجراحة عن طريق حلق منطقة الحبل الشوكي المستهدفة أولا ، ثم مسح الجلد نظيفا باستخدام بوفيدون اليود ومقشر الكحول بنسبة 70٪ ، ولف وعمل ثقب للوصول إلى موقع الجراحة. ثم ضع أدوات الأوتوكلاف على ستارة معقمة. يتضمن ذلك ملقطا رقما أربعة مثبتا ليكون ملليمترا واحدا بين السنون وله علامات ملليمتر واحد من الأطراف.

الآن يمكن فتح الجلد في خط الوسط باستخدام مقص القزحية ، وتعريض العضلات. تابع الجراحة تحت مجهر تشريح. على طول خط الوسط ، قم بقطع عضلات الظهر حيث ترتبط بعمليات العمود الفقري الظهرية بهدف تعريض العمود الفقري.

يتضمن ذلك قطع شبه المنحرف وأربطة latisimus dorsi. بعد ذلك ، قم بإزالة العضلات المدورة بين العمليات العرضية والعملية الظهرية للكشف عن صفيحة الفقرة المحددة المستهدفة للإزالة. هنا يتم الكشف عن T 10.

تابع عن طريق إدخال نصائح محلفين RO في الفراغ أعلى وأسفل العملية. ثم ارفعها قليلا للتأكد من أن الأطراف في مكانها بشكل آمن وليست عميقة جدا. ثم أغلق محلفين RO لإزالة الصفيحة.

الآن ، قم بإزالة جميع الأجزاء الأصغر من الفقرة المتبقية ، وبالتالي توسيع الفتحة. باستخدام إبرة قياس 30 ، قم بعمل فتحتين ، على بعد ملليمتر واحد في الجافية لإنشاء نقطة وصول للملقط الثابت. ثم أدخل الملقط الثابت بزاوية 90 درجة من خلال الجافية ، مع الحفاظ على العلامات الموجودة على السنون فوق الجافية.

الآن ، اضغط على إغلاق الملقط لمدة 10 ثوان. قم بالضغط لمدة عشر ثوان مرتين أخريين وقم بإزالة الملقط. بعد ذلك ، انقع قطعة من الجيلاتين القابل للامتصاص ، والإسفنجة المضغوطة في محلول ملحي ، وقم بتغطية موقع الإصابة بها.

أغلق العضلة فوق إسفنجة الجيلاتين باستخدام خيوط الجري الاصطناعية غير المصنوعة من النايلون رقم أربعة. ثم استخدم مشابك الجرح بطول خمسة ملليمترات لتأمين الجلد. أكمل الإجراء بحقن تحت الجلد 10 ميكرولتر من بوبيفاكائين في 490 ميكرولتر من المحلول الملحي مقابل ملليغرام واحد لكل كيلوغرام.

ثم حقن خمسة ميكرولتر من البوبرينورفين في عضلة الألوية مقابل 100 ميكروغرام لكل كيلوغرام. بعد الجراحة. قم بتدفئة ومراقبته حتى يستعيد وعيه. لإعادة فتح للتصوير ، قم بتحفيز التخدير كما كان من قبل ، ثم قم بإزالة مشابك الجرح وفقا للشركة المصنعة والتعليمات.

إذا لزم الأمر ، ضع منتج إزالة الشعر على المنطقة المحيطة بالشق. هذه المرة، ضع مقشرات إضافية مع بوفيدون اليود و 70٪ كحول. الآن ، أعد فتح الجلد على طول الشق السابق.

قم بإزالة الغرز المتبقية وافتح العضلات بالملقط باستخدام المقص حسب الحاجة. تحت مجهر التشريح ، استخدم المقص لعمل جيوب لمشابك الحبل الشوكي على طول العمليات العرضية على الفقرة ، مستوى واحد فوق استئصال الصفيحة الفقرية ومستوى واحد أسفل استئصال الصفيحة الفقرية. أدخل مشابك مثبت الحبل الشوكي حول كل فقرة وشد المشابك.

اضبط المشابك بحيث يكون الحبل الشوكي موازيا لمنصة التصوير ويكون النسيج مستقرا. إذا شوهدت قطعة أثرية للتنفس ، فاضبط المشابك لتقليل الحركة. ثم قم بتغطية المشابك والشكل.

بعد ذلك ، قم بإزالة رغوة الجل باستخدام ملقط. قم بإزالة أكبر قدر ممكن. أيضا ، قم بإزالة أي نسيج ندبي سميك فوق السحايا التي قد تكون موجودة.

بمجرد إزالة كل رغوة الجل ، قم بتغطية الحبل الشوكي بالمحلول الملحي. إذا لوحظ نزيف ، استخدم إسفنجة الجيلاتين لمنع النزيف. إذا لزم الأمر ، استخدم الكي أثناء الكي.

احرص على عدم لمس الحبل الشوكي وإبقائه مغطى بالمحلول الملحي ورغوة الجل. الآن قم بإنشاء بئر لعقد سائل الغمر ، وختم الجلد والأنسجة بمادة لاصقة cyanoacrylate. ثم قم ببناء بئر من أكريليك الأسنان بين المشابك.

اترك البئر وقتا للشفاء. بمجرد الشفاء ، املأ البئر بالسائل الدماغي النخاعي الاصطناعي. استمر في مراقبة النزيف خلال هذه الخطوات.

في هذه المرحلة ، يموت وعاء الفلورسنت عن طريق الحقن اختياريا في الوريد الذيل. لتسليط الضوء على الأوعية الدموية أثناء التصوير ، استخدم خيط DExT الفلوري فوق 70 نقطة كمومية كيلودالتون أو الليكتين المسمى بالفلورسنت. أثناء التصوير ، حافظ على الفأر عند 37 درجة مئوية في بيئة خاضعة للرقابة في مرحلة المجهر ، تتمثل أهم الخطوات المتعلقة بإعداد ناجح في التأكد من أن الحبل الشوكي نظيف ، وليس ينزف ، وأنه لا توجد قطعة أثرية مرئية للتنفس.

بشكل دوري أثناء التصوير ، تحقق من مستوى التخدير عن طريق مراقبة تنفس ، والذي يجب أن يتراوح بين 60 و 100 نفس في الدقيقة. تصحيح التخدير عن طريق ضبط مستويات الفلور ISO. بعد التصوير ، أعد إلى موقع الجراحة هناك ، وقم بإزالة المشابك الشوكية واسحب الأكريليك من الجلد.

يمكن بعد ذلك إغلاق الفأر للتصوير اللاحق كما هو الحال في نهاية الجراحة الأولية أو القتل الرحيم بعد خمسة أيام من الإصابة. لا تزال مواقع إدخال الملقط مرئية ، لكن حجم الآفة بدأ في الزيادة بسبب الإصابة الثانوية الناجمة عن الالتهاب. تراجعت المحاور الموجودة في نهاية الآفة من الموقع الأولي للإصابة.

في الوقت نفسه ، يمكن رؤية تدفق كبير من CX ثلاث خلايا موجبة C واحدة ، إما الخلايا الدبقية الصغيرة أو البلاعم وهي تتسلل داخل آفة السحق وحولها لتمييز سلوك هذه الخلايا داخل البيئة المكروية للآفة ، تم استخدام نموذج الوهم الإشعاعي أولا. تم استبدال الخلايا السلفية لنخاع العظم لفأر CX ثلاثة CR واحد إيجابي GFP بخلايا مانحة غير فلورية ، لذلك لن تكون الخلايا الدبقية الصغيرة المقيمة في الجهاز العصبي المركزي الإيجابي GFP مرئية فقط. ثانيا ، تم استبدال الخلايا السلفية لنخاع العظم في الفأر غير الفلوري بخلايا نخاع من CX ثلاثة CR واحد فأر GFP إيجابي لعرض الخلايا المشتقة من نخاع العظام.

قبل الإصابة ، كانت الخلايا الإيجابية الوحيدة المشتقة من نخاع العظم التي تم اكتشافها عبارة عن خلايا الأوعية الدموية إلى حد كبير ، والتي تم الإبلاغ عن استبدالها باستمرار من نخاع العظم بعد إصابة السحق. يتم زيادة خلايا CX وثلاثة C وواحد إيجابي GFP على طول الأوعية الدموية المحيطة بالآفة داخل الآفة. بالإضافة إلى ذلك ، تم ملء مركز الآفة ب CX ثلاثة CR واحد ضامة GFP إيجابية.

باستخدام هذه التقنية ، يمكن استخدام معدلة وراثيا مختلفة من أجل تسمية مجموعات الخلايا الفلورية الأخرى لتحديد تفاعلاتها داخل الحبل الشوكي وفي نماذج الأمراض الأخرى.